全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-07-25
基金项目 : 广东省自然科学基金项目（10151007002000009）, 广东省中国科学院全面战略合作专项（2010B090301037）
作者简介 : 李强 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物工程 ; E-mail:camelchicken@gamil.com
通讯作者 : 张菊梅 , 女 , 研究员 , 研究方向 : 食品微生物安全 ; E-mail:zhangjm926@126.com
副溶血性弧菌群体感应蛋白 CqsA 的原核表达
李强1,2 吴葵1,3 张菊梅1 吴清平1 徐明芳2
（1广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室 广东省华南应用微生物重点实验室—省部共建国家重点实验室
培育基地 广东省微生物研究所，广州 510070 ；2暨南大学生命科学技术学院，广州 510632 ；3中国科学院南海海洋研究所，广州 510301）
摘 要： 副溶血性弧菌 CqsA 是一种推测的信号分子合成酶，其合成的信号分子在群体感应系统中可能具有重要的调控作
用。从副溶血性弧菌 ATCC17802 中克隆 cqsA 基因，构建重组质粒 pET22b-cqsA。测序后转化大肠杆菌 BL21 进行 IPTG 诱导表达，
使用 SDS-PAGE 分析融合蛋白的表达状况，并通过 6×His-Tag 进行 Western blotting 检测。结果显示，经 0.6 mmol/L IPTG 诱导 4
h，目的基因以包涵体形式高效表达，表达的融合蛋白大小约为 49 kD，与理论值相符（437 aa）。表明副溶血性弧菌群体感应蛋白
CqsA 在大肠杆菌中成功表达，为后续寻找副溶血性弧菌群体感应信号分子，进一步探索副溶血性弧菌群体感应系统提供参考。
关键词： 副溶血性弧菌 群体感应 CqsA 原核表达
Prokaryotic Expression of the Quorum-sensing Protein CqsA from
Vibrio parahaemolyticus
Li Qiang1,2 Wu Kui1,3 Zhang Jumei1 Wu Qingping1 Xu Mingfang2
（1Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，
State Key Laboratory of Applied Microbiology，Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base，South China，Guangdong Institute of
Microbiology，Guangzhou 510070 ；2Life Science Department, Jinan University，Guangzhou 510632 ；3South China Sea Institute of Ocenology
Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301）
Abstract: CqsA, a quorum-sensing-related protein in Vibrio parahaemolyticus, is a putative autoinducer synthase, and the autoinducer
synthesized by CqsA maybe is a major regulator in quorum sensing system. cqsA gene was cloned from V. parahaemolyticus ATCC17802 and
inserted into the expression vector pET-22b. After sequencing the recombinant vector pET22b-cqsA was transformed into Escherichia coli
BL21 and induced by IPTG, and then the fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and verified by Western blotting employed 6×His-Tag.
The results showed that the pET22b-cqsA could be able to express efficiently in a form of inclusion body under the induction of 0.6 mmol/L
IPTG for 4 h. The molecular weight of the fusion protein was 49 kD, and this result matched the theory value （437 aa）. In this experiment, V.
parahaemolyticus quorum-sensing protein CqsA was expressed correctly in E. coli BL21.
Key words: Vibrio parahaemolyticus Quorum sensing CqsA Prokaryotic expression
细菌的群体感应（Quorum sensing，QS）是一
种与群体密度相关的通讯机制，通过识别信号分子，
细菌间进行相互交流，协调群体行为［1］。通过群体
感应系统，细菌可以控制自身或其它细菌的细胞群
体密度和调控特定基因的表达［2,3］；在许多病原菌中，
群体感应系统参与甚至控制着一些重要毒力基因的
表达［4］。在弧菌的群体感应系统中 CqsA（Cholerae
quorum-sensing autoinducer）是一种信号分子合成酶。
Miller 等［5］在霍乱弧菌（Vibrio cholera, VC）中首次
发现和命名了编码该酶的基因 cqsA（VC_A0523），
并 且 确 认 该 酶 合 成 的 信 号 分 子 CAI-1（Cholerae
autoinducer-1）可以调控自身毒性蛋白的表达。随
后，Henke 等［6］在哈维氏弧菌（Vibrio haiveyi，VH）
中也发现 CqsA 的存在，其合成的信号分子 CAI-1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期90
与该菌的另外两种信号分子（HAI-1 和 AI-2）共同
调控自身的一系列基因表达，包括生物荧光、三型
分泌系统和金属蛋白酶的产生。根据 GenBank 公布
的基因组信息及相关研究，副溶血性弧菌（Vibrio
parahaemolyticus，VP） 具 有 类 似 哈 维 氏 弧 菌 的 群
体感应系统，其基因组中含有类似编码 CqsA 的基
因［6-11］。但是副溶血性弧菌 CqsA 的功能及其合成
的信号分子的调控作用尚不清楚。本研究克隆、表
达副溶血性弧菌 ATCC17802 cqsA 基因并获得 CqsA
蛋白，旨在为阐明副溶血性弧菌 CqsA 的功能并寻
找其可能合成的信号分子，进而进一步探索副溶血
性弧菌的群体感应机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒载体 VP ATCC17802 由本实验室
保存，大肠杆菌 DH5α 和大肠杆菌 BL21 购自天根生
物科技公司，克隆载体 pMD19-T 购自 TaKaRa（大连）
公司，表达载体 pET-22b 购自 Novagen 公司，引物
设计采用 Primer Premier 6.0，由上海生工公司合成。
1.1.2 主要试剂和仪器 细菌基因组抽提试剂盒、
质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均购自上海生工
公司，PCR 试剂盒、蛋白 Marker 和限制性内切酶
BamHⅠ和 Hind Ⅲ购自 Fermentas 公司，Western blot
一抗、二抗及相关试剂购自德国 Merck 公司。其他
化学试剂购自广东环凯微生物科技有限公司。台式
高速冷冻离心机（ Eppendorf，Centerifuge 5804R 型），
PCR 仪（Eppendorf，Mastertycler 型），化学发光 / 荧
光凝胶成像分析系统（GE ImageQuaunt 350），蛋白
电泳仪及转膜仪（Hoefer SE600，TE22）。
1.2 方法
1.2.1 cqsA 基因的扩增 提取 VP ATCC17802 基因
组 DNA。 由 于 VP ATCC17802 基 因 组 DNA 的 序 列
尚未发表，本研究根据 GenBank 中 VP AQ3810 的
cqsA 基因序列（A79-1588）设计特异性引物，上游
引 物（P-F）：5-GCGCGGATCCGATGTGTACTAAAA
ACGAAAC-3 ；下 游 引 物（P-R）：5-CTGGAAGCTT
CACAAACTCTAAGTCGGGA-3，其中下划线部分分
别为 BamHⅠ和 Hind Ⅲ的酶切位点。PCR 反应体系
50 μL ：2×PCR Master Mix 25 μL ；上下游引物各 2
μL（10 mmol/L）；模板 2 μL ；ddH2O 19 μL。PCR 反
应程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 45 s，53℃ 50 s，72℃
90 s，35 个循环。
PCR 胶回收产物直接与克隆载体 pMD19-T 连
接，得到重组质粒 pMD19-T-cqsA，将重组质粒转化
感受态细胞 DH5α 进行大量克隆，通过蓝白斑和菌
落 PCR 进行初筛［12］，并提取质粒进行鉴定，筛得
阳性克隆。
1.2.2 重组表达质粒 pET22b-cqsA 的构建 重组质
粒 pMD19-T-cqsA 经限制性内切酶 BamHⅠ和 Hind
Ⅲ双酶切后，连接到经相同酶切的 pET-22b 载体上，
得到重组表达质粒 pET22b-cqsA，该重组质粒将表
达出一个大小为 437 aa（约 49 kD）的融合蛋白，其
中包含质粒本身编码的信号肽、目的编码蛋白 CqsA
及其 C-末端连接的 6×His-Tag。将质粒转化感受态
细胞 DH5α 进行大量克隆，提取质粒，经限制性内
切酶鉴定后，委托华大基因以 T7 引物对阳性菌落的
目的基因片段进行测序。
1.2.3 融 合 蛋 白 CqsA 的 序 列 分 析 将 测 序 的 目
的基因序列翻译成氨基酸序列，利用 NCBI 网站
的 BLASTp 工 具 对 序 列 进 行 同 源 分 析， 并 使 用
ClustalW2［19］比对同源序列。
1.2.4 融合蛋白的诱导表达及 Western blot 验证 取
已经转入重组质粒的大肠杆菌 BL21，37℃培养 4 h，
再以 1 100 转种后继续培养。培养至对数生长期
（A600=0.7） ，分别以终浓度为 0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L
的异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thioga
lactopyranoside，IPTG）诱导 4 h，收集菌体，超声裂解。
离心后分别收集沉淀和上清液，通过 SDS-PAGE 确
定最佳 IPTG 诱导浓度。将 SDS-PAGE 电泳的目的蛋
白条带转移到硝酸纤维素膜上，用 5% 碱溶酪蛋白
封闭，以 His-Tag 单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠
IgG HRP Conjugate（H+L）为二抗与之反应，最后用
DAB 显色。
2 结果
2.1 cqsA基因的获得
通过优化的 PCR 程序，使用以 VP AQ3810 cqsA
基因序列设计的引物，结果（图 1）显示，从 VP
ATCC17802 基因组中成功扩增出目的基因片段大小
2012年第1期 91李强等 ：副溶血性弧菌群体感应蛋白 CqsA 的原核表达
约为 1 200 bp（含引物中的酶切位点和保护碱基），
与预期结果相符。
2.2 重组表达质粒pET22b-cqsA的获得
将目的基因片段与载体 pET-22b 连接后，酶切
鉴定结果（图 2）显示，目的基因片段已经插入载体，
初步确认得到正确的重组质粒。测序结果表明，该
表达质粒 pET-22b 成功连接了目的基因序列，大小
为 1 179 bp（去除了终止密码子，GenBank 登录号为
HQ683754）。HQ683754 与 GenBank 中 VP AQ3810
cqsA（GI: 121674956）序列的一致性为 99%，且未
有移码突变，进一步表明已成功构建重组表达质粒
pET22b-cqsA。
2.3 融合蛋白CqsA的序列分析
由测序得到的碱基序列可推测，副溶血性弧菌
ATCC17802 CqsA 由 393 个氨基酸组成。序列同源分
析结果显示，副溶血性弧菌 CqsA 与霍乱弧菌和哈
维氏弧菌的 CqsA 高度同源，都属于氨酰基转移酶
家族，且都依赖辅酶磷酸吡哆醛（PLP）［11,16］。由图
3 可知，氨基酸序列比对后，一致性分别达到 57.6%
和 82.4%。与霍乱弧菌和哈维氏弧菌的 CqsA 相似，
图 3 副溶血性弧菌 CqsA 与霍乱弧菌和哈维氏弧菌 CqsA 的序列比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期92
副溶血性弧菌 CqsA 序列中同样存在结合 PLP 的赖
氨酸 （Lys240） ，该赖氨酸与 PLP 可以形成醛亚胺，
而亚胺结构在氨基酸的缩合和转移方面起到重要作
用［17,18］。上述结果表明，副溶血性弧菌 CqsA 可能
具有霍乱弧菌 CqsA 相似的功能，合成类似信号分
子 CAI 的物质。该推论为后续原核表达副溶血性弧
菌 CqsA 以大量获得其合成的信号分子提供了理论
依据。
2.4 融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
用 SDS-PAGE 检 测 蛋 白 表 达 情 况， 经 考 马 斯
亮蓝染色后在大约 49 kD 处出现明显表达条带，为
CqsA 的融合表达产物，与预期蛋白大小相一致。0.4、
0.6、0.8、1.0 mmol/L 四个不同 IPTG 浓度对目的蛋
白表达量影响不大，以 0.6 mmol/L IPTG 浓度诱导效
果为最优（图 4-A）。表达产物以包涵体形式表达（图
4-B）。
A: 经不同浓度 IPTG 诱导的 pET22b-cqsA/BL21 ；M. 蛋白质 Marker ；1. 未经 IPTG 诱导 ；2-5.IPTG 浓度分别为 0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L 的表达产物
B: 重组蛋白 CqsA 的可溶性分析 ；M. 蛋白质 Marker ；1. 空质粒 pET-22b 的表达产物 ；2. 未经 IPTG 诱导的 pET22b-cqsA/BL21 ；3,4. 超声破碎后的沉淀 ;
5,6. 超声破碎后的上清 ；7. 细胞总蛋白
图 4 CqsA 融合蛋白的 SDS-PAGE 及可溶性分析
Western blotting 结果（图 5）显示，pET22-cqsA
的诱导表达产物在 49 kD 处有明显显色条带，证实
目标蛋白在大肠杆菌 BL21 中成功表达。CqsA 在大
肠杆菌的成功表达为后续获得其合成的信号分子提
供参考。
1. 未经 IPTG 诱导产物 ；2. 经 1.0 mmol/L IPTG 诱导产物
图 5 CqsA 融合蛋白的 Western blotting 验证
3 讨论
群体感应是微生物根据种群密度进行细胞信息
交流，通过其合成的信号分子进行信号传导并调控
基因表达的过程。QS 系统能够调控微生物的多种生
理生化功能如致病基因的表达、生物膜的形成、荧
光的产生、对宿主的侵袭、抗生素的合成和免疫机
制及药物的抗性等［2,10］。信号分子还能够诱导哺乳
动物细胞凋亡［13,14］，因此 QS 系统调控在农业、医学、
环境保护等领域具有广阔的应用前景。主要研究内
容为通过调控 QS 系统信号分子的合成与降解，阐明
抗病的信号传导机制，达到对病原进行控制的目的。
群体感应的研究为病原菌的防控机制提供了新的探
索角度。然而，包括 VP 在内的多种病原菌，其群
体感应研究工作尚未展开。在 VP 基因组中，我们
发现了很多群体感应相关基因，其中包括 3 种推测
2012年第1期 93李强等 ：副溶血性弧菌群体感应蛋白 CqsA 的原核表达
的信号分子合成酶基因 ：opaM，cqsA 和 luxS［9］。本
研究从 cqsA 基因入手，获得其克隆及表达产物，从
而为探索 VP 群体感应信号分子和通路提供初步信
息，为认识 QS 在 VP 中的作用打下基础。
Higgins 等［15］ 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 霍 乱 弧 菌
cqsA 基 因， 并 获 得 了 大 量 由 CqsA 合 成 的 信 号 分
子 CAI-1。本试验成功表达 VP ATCC17802 cqsA 基
因，IPTG 诱导下，CqsA 蛋白在大肠杆菌中获得大
量异源融合表达。但是这些融合蛋白是否具有活性
还需进一步验证，甚至 CqsA 在 VP 中是否具有功能
也同样需要证实，而相应信号分子的获得将为验证
VP CqsA 的信号分子合成酶功能提供最直接的证据。
信号分子的寻找和鉴定工作已经开展，希望能够获
得 VP CqsA 可能产生的信号分子，从而为全面认识
CqsA 的功能及特性提供重要基础。
4 结论
本试验成功表达副溶血性弧菌 ATCC17802 cqsA
基因，CqsA 蛋白在大肠杆菌中获得大量异源融合表
达。表达的融合蛋白大小约为 49 kD，与理论值相
符（437 aa）。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）