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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-24
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31071075）
作者简介 : 张静 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: bio_zhangjing@sina.com
通讯作者 : 张飞云 , 副教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 植物分子生物学和植物分子病毒学 ; E-mail: feiyun93@126. com
拟南芥中柯浩体蛋白 Atcoilin的克隆、表达及纯化
张静1 田兆丰2 朱文壮1 张飞云1
（1首都师范大学生命科学学院，北京 100048 ；2北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097）
摘 要： 旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白，利用 pET-28a与目的基因构建重组表达质粒，经 DNA测序证实插入
序列与设计完全一致后，将重组质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3），用 IPTG进行诱导表达，产物用 SDS-PAGE及Western blotting分
析鉴定。通过分别改变 IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化 Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子
筛进行纯化。结果显示，原核表达载体 pET28a-At1g13030成功构建，可在大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达，得到相应的重组蛋
白经Western blotting鉴定正确。在 IPTG浓度为 0.7 mmol/L，18℃培养 20 h的条件下，目的蛋白表达量最高。经过 SDS-PAGE分析
鉴定，过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。
关键词： Atcoilin蛋白 表达 纯化 标志蛋白
Cloning，Expression and Purification of Atcoilin—A Symbol of Cajal
Bodies in Arabidopsis
Zhang Jing1 Tian Zhaofeng2 Zhu Wenzhuang1 Zhang Feiyun1
（College of Life Sciences，Capital Normal University，Beijing 100048；Institute of Plant and Enviroment Protection, Beijing Academy of
Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097）
Abstract: For the sake of a high expression of Atcoilin, which is a symbol of Cajal bodies（CBs）, the recombinant vector pET28a-
At1g13030 was constructed by pET-28a and the target gene. The recombinant protein was induced by IPTG in E. coli BL21（DE3）and the
expressed protein was detected by SDS-PAGE and Westernblotting. Through changing the concentration of IPTG, length of time induced by IPTG
and culture temperature to optimize Atcoilin expression. Results indicated that the recombinant vector pET28a-At1g13030 was successfully
constructed and the Atcoilin protein could be expressed in E. coli BL21（DE3）. The recombinant protein was characterized by Western blotting.
Through optimizing, the satisfactory expression condition was obtained, as follow including IPTG concentration 0.7 mmol/L; induced time of 20 h;
culture temperature 18℃. The protein obtained through the nickel column and molecular sieve was identified by SDS-PAGE.
Key words: Atcoilin Expression Purify Symbol
柯浩体（Cajal bodies，CBs）最早是由西班牙神
经科学之父，科学家 Cajal 在 1903 年发现存在于细
胞核附近的一种亚核结构。随后，科学家们研究发
现在哺乳动物、两栖动物、昆虫、植物以及酵母的
细胞中都有其相似的结构存在［1, 2］。到目前为止，已
经发现拼接复合体 snRNPs、与组蛋白 mRNA 3-末端
剪接有关的U7 snRNPs以及与rRNA前体剪接有关的
snoRNPs都定位在柯浩体上［2］。之前的研究结果表明，
snRNPs 和 snoRNPs 只有在柯浩体上经过加工、修饰
后才能形成具有功能的复合体，并定位在 speckles
和核仁中，分别行使 mRNA 和 rRNA 前体的拼接和
剪接功能。研究报道 CBs 参与 snRNPs （small nuclear
ribonucleoproteins）和 snoRNPs（small nucleolar RNPs）
的组装和成熟以及 snRNA 和组蛋白基因的转录［3, 4］。
而且已有报道证明，Atcoilin 缺失时，拟南芥的柯浩
体不能正常形成，当在细胞中对 Atcoilin 进行过表达
时，柯浩体不仅能够形成，而且比正常的大［5］。研
究表明，在拟南芥中 Atcoilin 蛋白（At1g13030）对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期64
于柯浩体的形成是必需的，它是柯浩体的一种标志
蛋白。在研究柯浩体在细胞代谢中的重要功能时，
Atcoilin 蛋白的研究起着较为关键的作用［5］。Atcoilin
作为一种标志蛋白，在研究柯浩体这个亚核结构的
功能、代谢时，越来越受到人们的关注。因此，本
研究通过构建重组质粒，大肠杆菌中可溶性表达并
纯化得到高纯度的蛋白，旨在为进一步进行相关的
结构和功能研究提供试验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 TOP10 感受态细胞，E. coli BL21
（DE3），E. coli Rosetta（DE3），E. coli Rosetta（DE3）
plysS 感受态细胞，原核表达质粒载体 pET-28a（Kanr）
由北京大学郑晓峰教授实验室保存。
1.1.2 试剂 各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、
T4 DNA 连接酶均为 TaKaRa 公司产品 ； DNA Marker、
蛋白 Marker、质粒小提试剂盒、快捷琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒购自 Genstar 及天根 ；其他普通试
剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥 RNA 的提取及反转录 以拟南芥的花
为材料，用 Trizol 法提取 RNA，并用反转录试剂盒
将 RNA 反转录成 cDNA。
1.2.2 coilin 基 因 的 扩 增 根 据 GenBank 中 A-
t1g13030 序列利用 PrimerPremier5.0 设计引物，上游
加入 NdeⅠ酶切位点，下游加入 XhoⅠ酶切位点，
引物序列为 ：
上游：5-CGCCATATGATGGAGGAAGAGAAGG
-3；
下游：5-CCGCTCGAGTCAAATCTCTTTCTGAG-
ATCTG-3。
以制备好的拟南芥的 cDNA 为模板，扩增体系
为 50 μL，反应程序 ：98℃ 2 min ；98℃ 30 s，59℃
30 s，72 ℃ 1 min，35 个 循 环 ；72 ℃ 延 伸 10 min。
反应结束后，取出 2 μL 进行电泳，检测是否扩增到
目的片段，检测到目的片段后对目的片段用胶回收
试剂盒进行回收。
1.2.3 原核重组表达载体的构建和鉴定 将纯化后
的 PCR 产物及 pET-28a 载体分别用限制性内切酶
将连接产物转化至大肠杆菌 TOP10 感受态细
胞，37℃活化 1.5 h 后涂 LB Kan 抗性平板，置 37℃
倒置培养。
转化后，用抗生素筛选后的单克隆进行如下程
序检测：菌液 PCR 筛选 - 质粒大小筛选 - 酶切检验 -
测序，最终找出正确重组克隆。
1.2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 将测序结果
正确的重组质粒分别转化 E. coli BL21（DE3），E. coli
Rosetta（DE3），E. coli Rosetta（DE3）plysS 3 种 表
达菌株，对重组菌用 IPTG 进行诱导使蛋白表达 ；同
时优化诱导温度和诱导剂 IPTG 浓度梯度等表达条
件。诱导温度设定为 18℃和 37℃ ；诱导剂终浓度设
定为 0.1-1.0 mmol/L。通过 SDS-PAGE 电泳检测，选
择最佳的诱导表达条件进行诱导表达。
1.2.5 不同诱导时间的目的蛋白的 Western blotting
检测 加入诱导剂 IPTG 后诱导时间分别设为 8 h、
12 h、16 h、20 h，4℃ 5 000 r/min，10 min 收菌。然
后超声破碎，4℃ 18 000 r/min 离心 30 min，得到蛋
白样品。通过 SDS-PAGE 电泳检测表达情况，冰浴
中转 PVDF 膜 2 h，分别加入 His-tag 的一抗和相应
带标记的二抗进行孵育，然后进行自显影。
1.2.6 目的蛋白的纯化 将表达检测成功的样本接
种到 200 mL 含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，
37℃ 210 r/min 过夜培养，1 20 接种到大瓶 LB 培
养基中 37℃继续培养至 OD600=0.6，然后加入 IPTG
18℃ 20 h 诱导，4℃ 5 000 r/ min，10 min 收菌。然
后超声破碎，4℃ 18 000 r/ min 离心 30 min，经 0.22
μm 滤膜过滤后依次通过镍柱 - 分子筛两步纯化法纯
化蛋白。
表 1 PCR产物与 pET28a线性片段连接体系
Nde I 和 Xho I 进行双酶切，胶纯化回收后将 PCR 产
物与 pET-28a 线性片段连接，16℃连接过夜。连接
体系如表 1 所示。
试验组 用量（μL） 对照组 用量（μL）
T4 连接酶 0.5 T4 连接酶 0.5
10×Buffer 1.0 10×Buffer 1.0
载体片段 1.0 载体片段 1.0
目的片段 7.5 ddH2O 7.5
2012年第3期 65张静等 ：拟南芥中柯浩体蛋白 Atcoilin 的克隆、表达及纯化
2 结果
2.1 RNA的提取及反转录
用 Trizol 法从拟南芥的花中提取 RNA，根据检
测的浓度利用反转录试剂盒将 RNA 反转录成 cDNA，
保存在 -20℃备用。
2.2 Atcoilin基因的扩增
利用特异的上、下引物通过 PCR 程序从拟南芥
cDNA 中扩增得到目的条带，1% 琼脂糖凝胶电泳检
测扩增的 PCR 产物，结果（图 1）表明获得了与预
期片段大小相符的清晰的目的条带。
取健壮的单克隆摇菌。通过菌液 PCR 检测出现单一
条带，然后用质粒小提试剂盒提取菌液 PCR 检测为
阳性的重组质粒，用 Nde I 和 Xho I 双酶切质粒，1%
琼脂糖凝胶电泳检测得到 2 个片段，载体 DNA 片段
和相应大小的目的片段，与预期的目的片段大小完
全吻合（图 3），将检测正确的菌液送去测序，测序
结果与 NCBI 的相关序列比对完全正确。
图 2 目的基因及 pET-28a的双酶切
图 1 目的基因 PCR
2.3 原核重组表达质粒的构建和鉴定
将切胶回收的目的基因 PCR 产物与表达载体质
粒 DNA 分别用限制性内切酶 Nde I 和 Xho I 37℃双
酶切，酶切结果如图 2 所示。
酶切产物进行回收、16℃过夜连接、转化，挑
图 3 双酶切检测图
2.4 原核重组表达载体的表达及可溶性分析
将测序结果正确的重组质粒分别转化到 E. coli
BL21（DE3）， E. coli Rosetta （DE3），E. coli Rosetta
（DE3）plysS 3 种表达菌株中，分别挑取生长健壮的
单克隆培养至 OD600=0.6，加入诱导剂 IPTG 在 37℃
M. DNA Marker ；1，2. 目的条带
M. Marker；1.双酶切后目的基因；2.双酶切后pET-28a；3.pET-28a
未酶切 ；4, 5. 分别 Nde I、Xho I 单酶切
M. Marker ；1. 双酶切后的质粒（上）和目的基因（下）
图 4 SDS-PAGE电泳分析蛋白表达
M. 蛋白质 Marker ；1.37℃经 IPTG 诱导 ；2.18℃经 IPTG 诱导
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期66
和 18℃下分别进行诱导，诱导后用 SDS 凝胶电泳检
测，结果（图 4）显示，在 37℃诱导下，蛋白表达
量更多。但（图 5）显示，37℃诱导时形成的更多
的是包涵体，可溶性较差 ；而在 18℃诱导时可溶性
蛋白明显增多。为了得到更多的可溶蛋白，在诱导
图 5 目的蛋白的可溶性分析
1.37℃诱导破碎后沉淀 ；2.37℃诱导破碎后上清 ；3. 未
诱导 ；4.18℃诱导破碎后上清 ；5.18℃诱导破碎后沉淀
蛋白表达时选择 18℃ 低温诱导。
在 18℃条件诱导下，可溶性蛋白增多，但是，
蛋白的量不足。为此，我们用不同浓度的 IPTG 诱
导蛋白表达。SDS-PAGE 检测结果（图 6）发现，
不同浓度的 IPTG 对重组蛋白的表达影响显著，当
IPTG 的终浓度设定为 0.5 mmol/L 时，目的蛋白表达
量明显迅速增多，是终浓度为 0.3 mmol/L 时表达量
的 3 倍以上 ；诱导剂浓度从 0.5 mmol/L 变化为 0.7
mmol/L 时，表达量进一步增加 ；高于 0.7 mmol/L 时
表达量反而下降，减少到 0.7 mmol/L 时表达量的 1/3
左右。结果表明，IPTG的终浓度设定为0.7 mmol/L时，
表达量最多，在之后进行蛋白表达诱导时选择此
浓度。
2.5 经不同诱导时间的目的蛋白的Western blotting
检测
对不同时间诱导蛋白的表达量进行对比试验，
同时对诱导不同时间的蛋白用 Western blotting 进行
检测。结果 SDS-PAGE（图 7）及 Western blotting（图
8）均表明随着时间的延长，重组蛋白的表达量不断
增加 ；诱导时间超过 12 h 后，表达量是诱导 8 h 表
达量的 2 倍 ；之后随着诱导时间的延长，表达量进
一步增加，诱导 20 h 后表达量达到最大。
M. Marker ；1. 未被 PTG 诱导的重组质粒在 E. coli BL21 中的表达产物 ；2.
100 μmol/L IPTG 诱导的重组质粒在 E. coli BL21 中的表达产物；3. 300 μmol/L
IPTG 诱导的重组质粒在 E. coli BL21 中的表达产物 ；4. 500 μmol/L IPTG 诱导
的重组质粒在 E. coli BL21 中的表达产物 ；5. 700 μmol/L IPTG 诱导的重组质
粒在 E. coli BL21 中的表达产物 ；6. 1000 μmol/L IPTG 诱导的重组质粒在 E.
coli BL21 中的表达产物
图 6 SDS-PAGE电泳分析不同浓度 IPTG诱导蛋白表达
图 8 目的蛋白的Western blotting检测
图 7 目的蛋白的 SDS-PAGE分析
M. Marker；1.18℃诱导 16 h；2.18℃诱导 20 h；3.18℃
诱导 8 h ；4.18℃诱导 12 h ；5. 未加 IPTG 诱导
1-4. 分别为用 His 标签抗体处理后与图 7 对应的条
带 ；5. 未诱导表达作为对照
2012年第3期 67张静等 ：拟南芥中柯浩体蛋白 Atcoilin 的克隆、表达及纯化
2.6 目的蛋白的纯化
在前面试验的基础上，我们最终选择用终浓度
0.7 mmol/L 的 IPTG 在 18℃时进行诱导表达。表达
20 h 后收集菌液，超声波破碎后，18 000 r/min 离心
30 min，经孔径为 0.45 μm 滤膜过滤，最后通过镍柱 -
分子筛两步纯化法纯化蛋白，过镍柱、分子筛曲线
如图 9，图 10，经 SDS-PAGE 检测得到比较单一的
条带，纯度大约在 95%（图 11）
图 10 Atcoilin蛋白过分子筛图
图 9 Atcoilin蛋白过镍柱图
图 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化
M. 蛋白质 Marker ；1-3. 均为镍柱纯化后蛋白 ；4. 分子筛纯化后蛋白
3 讨论
本试验成功构建了带 His 标签的拟南芥柯浩体
标志蛋白——Atcoilin 的表达载体，并原核系统中对
重组蛋白进行了表达、纯化。
试验发现温度影响该蛋白的表达，37℃时表达
量虽然很多，但大多数蛋白以包涵体的形式存在沉
淀中，不利于蛋白的纯化。为了促使更多的蛋白以
可溶性状态存在，我们采用降低温度的方法，使可
溶性蛋白的量得到了提高。
试验还发现诱导剂 IPTG 的浓度是影响该蛋白
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期68
表达的一个重要因素，分别选择 0.1，0.3，0.5，0.7
和 1.0 mmol/L 5 个浓度梯度分别进行诱导表达，结
果发现终浓度为 0.5-0.7 mmol/L 时表达量最大，低
于或者高于该浓度表达量都明显减少。
诱导时间是影响该重组蛋白表达的另一个重要
因素，随着时间的延长，蛋白的表达量不断增加 ；
诱导时间超过一定值后表达量增加缓慢，诱导 20 h
后表达量最大。通过 Western blotting 检测证实得到
了目的蛋白，将得到的目的蛋白浓缩后在液氮中保
存，此蛋白表达、纯化的成功，将为进一步研究相
关蛋白的功能奠定了基础。
Atcoilin 蛋白虽然在大多数研究过的生物体中集
中存在于柯浩体上［6-8］，在柯浩体形成中起着关键
作用，但在拟南芥中其氨基酸序列与其他脊椎动物
等相比序列同源性很低［9］；关于 Atcoilin 的生物学
活性还没有研究清楚［10, 11］，至今还是一个未知功能
的蛋白，目前只知道其最主要的功能是参与柯浩体
的形成，其他功能还有待进一步的研究。
4 结论
本试验成功构建了带 His 标签的拟南芥柯浩体
标志蛋白——Atcoilin 的表达载体，在原核系统中
利用终浓度为 0.5-07 mmol/L 的 IPTG 在低温条件下
进行对重组蛋白进行了诱导表达，经过纯化得到了
Atcoilin 蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）