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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-05-24
基金项目 : 国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2007AA10Z439）, 国家自然科学基金项目（30671205）, 北京市财政课题资助项目
（KJCX201101010）
作者简介 : 李鹏 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 重金属免疫学检测 ; E-mail:zplipeng@163.com
通讯作者 : 李霞 , 女 , 博士 , 研究方向 : 重金属抗体工程 ; E-mail:lixia@nercv.org
锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及
重组抗体的三维模建
李鹏1,2 刘凤权1 杨慧2 赵丽2 李霞2,3
（1南京农业大学植物保护学院，南京 210095 ；2北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097 ；
3北京农产品质量检测与农田环境监测技术研究中心，北京 100097）
摘 要： 筛选得到能分泌抗锌（II）- 二乙烯三胺五乙酸（Zn（II）-DTPA）的单克隆抗体杂交瘤细胞株 2E8E3。经测定，此
株细胞分泌 IgM，轻链 κ型抗体。为了得到该抗体可变区序列，分别在小鼠抗体的信号肽区域和抗体的第一恒定区半胱氨酸残基（Cys）
附近选择合适引物，通过 RT-PCR 方法，得到重（VH）、轻（VL）链可变区序列。将序列进行 BLAST 分析、SignalP 分析、IMGT-V/
QUEST 分析，结果显示，克隆到的 VH-2E8E3 （465 bp）和 VL-2E8E3 （417 bp），序列与小鼠 μ 重链，κ 轻链抗体可变区序列具有同
源性（相似度 >97%），前端序列符合信号肽特征，抗体骨架区（Framework region，FR）及第一恒定区均含有保守半胱氨酸（Cys）
残基。在此基础上，构建了重组抗体的真核表达载体，转染 293T 细胞并用间接 ELISA 法初步验证其具有表达活性。对重组抗体进
行了三维模拟，并推测了主要氨基酸残基。试验结果表明，克隆到了正确的 2E8E3 抗体可变区序列并初步鉴定为有活性。
关键词： 重金属 单克隆抗体 免疫学检测 序列分析 三维模拟
Cloning, Identification and Eukaryotic Expression of Variable
Region of Monoclonal Antibodies Against Chelated Zinc and Three
Dimensional Modeling of Recombinant Antibody
Li Peng 1,2 Liu Fengquan1 Yang Hui2 Zhao Li2 Li Xia2,3
（1College of Plant Protection of Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095 ；2Vegetable Research Center of Beijing Academy of
Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097 ；3Beijing Research Center for Agri-food Testing and
Farmland Monitoring，Beijing 100097）
Abstract: Hybridoma cellines which secrete monoclonal antibody against heavy metals chelators were selected in our lab. 2E8E3 is the
monoclonal antibody against zinc（II）-SCN-DTPA chelator（Zn（II）-DTPA）. Primers were designed and synthesized to contain the signal
peptide, whole variable region segments and partial constant region including Cys. VH-2E8E3 （465 bp） and VL-2E8E3 （417 bp） were cloned by
RT-PCR method. After sequencing, the DNA sequences were analyzed by BLAST, SignalP analysis and IMGT-V/QUEST analysis. The results
showed that the VH-2E8E3 and VL-2E8E3 were homologous with murine antibody μ chain and κ chain respectively. The leader sequences were
with character translated to be the signal peptide, the specific-site-cysteines in antibody were also in the clonal DNA sequence. The expression
plasmid vector in eukaryotic cells was constructed and used for transfecting 293T cell lines. The recombinant antibody protein expressed in
transected 293T cell lines was active proved by ELISA. The three dimentional modeling of recombinant antibody were got by Swiss-Pdb Viewer.
The important amino acids were also selected according to this model.
Key words: Heavy metal Monoclonal antibody Immunoassay Sequence identification Three dimentional modeling
锌是维持机体正常功能的必须元素，但锌过量 同样会引起中毒。过量的锌会导致机体代谢紊乱，
2012年第1期 109李鹏等 ：锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及重组抗体的三维模建
提高检测灵敏度。
1 材料与方法
1.1 材料
分泌抗重金属锌螯合物单克隆抗体的杂交瘤细
胞株 2E8E3 为本实验室制备并保存 ； E. coli TOP10
感受态细胞、pGM-T 载体和总 RNA 提取试剂盒均
购自天根生化公司 ； cDNA 第一链合成试剂盒、高
保 真 PCR SuperMix 购 自 全 式 金 公 司 ；DNA Marker
DL2000 购自康润生物，DNA Marker IV 购自天根生
化 ；限制性内切酶购自 Fermentas 公司 ；质粒提取
试剂盒购自 Axygen 公司 ；293T 细胞系由本实验室
保存；ELISA 耗材及细胞培养耗材购自 Corning 公司；
细胞培养液及胎牛血清为索莱宝公司产品 ；检测用
抗体购自中杉金桥公司。
1.2 方法
1.2.1 引物选择 为了最大程度的保证可变区序列
的完整性以及方便随后的重组抗体真核表达，参照
文献［7-10］，将上游引物选择在信号肽区域，而下
游引物选择在第一恒定区。根据信号肽区域的保守
位点，从文献［10］中选择了 3 条扩增重链可变区
序列（VH）的上游简并引物和 5 条扩增轻链可变区
（VL）的上游简并引物。
从 IMGT 数据库中分别下载 μ 重链、κ 轻链的
恒定区序列，利用 Clustal X 软件确定其保守区域，
将引物设计在恒定区第一半胱氨酸残基（Cys）附近。
扩增得到的 Cys 将会成为重轻链蛋白共价结合的位
点。序列结果见表 1。在 VH 上下游引物的 5 端分别
加入 Not Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位点，VL 上下游引物的 5
端分别加入 Hind III 和 Xba Ⅰ酶切位点，以方便克
隆入表达载体。
为了验证反转录 cDNA 的质量，选择小鼠持家
基因 β-actin（β-肌动蛋白）、GAPDH（甘油醛-3-磷
酸脱氢酶）作为内参基因，分别选择了两个内参基
因的上下游引物（表 1）。β-actin 的扩增引物较多，
此处选择第 407-588 位核苷酸片段，扩增目的条带
大小为 182 bp。GAPDH 选择第 306-835 位核苷酸片
段，扩增目的条带大小为 530 bp。
T7、SP6 为 pGM-T 载体上自带的上下游通用测
序引物，本试验选择它们作为菌落 PCR 的上下游引
通过对神经细胞的直接损害及对体内各种物质的拮
抗而影响脑功能，可明显抑制红细胞免疫功能，造
成组织及器官损伤［1, 2］。采矿，电镀和冶炼行业会
大量排放锌污染物。传统的重金属检测方法仪器昂
贵，费时费力，越来越不能满足当前实践中对快速
简便的要求。免疫检测法可以快速、灵敏、实时大
通量的检测环境中的重金属污染物，在环境和食品
安全领域应用潜力巨大［2, 3］。本实验室已经以重金
属螯合物为免疫原通过杂交瘤细胞技术制备出重金
属特异性的汞、铅、铜、锌等单克隆抗体［4］。由于
重金属分子量小，结构相似，杂交瘤细胞制备的单
克隆抗体与其他金属有交叉反应，影响检测的灵敏
性。商用的抗体检测试剂盒通常采用如 Cy5 等荧光
蛋白或 H3 放射性元素标记抗体以提高检测的灵敏
性，但荧光蛋白、放射性标记是随机的，标记后，
可能导致抗体失活。近几年发展的抗体基因工程可
以补充和改进完全抗体在检测领域应用的局限性［5］。
克隆出杂交瘤细胞株中抗体基因的可变区序列
不仅可以避免因杂交瘤细胞系易丢失染色体而失去
应用价值，还为抗体的定点基因改造进而提高亲和
力打下基础。经鉴定，本实验室已经制备的针对锌
螯合物的单克隆抗体 2E8E3，种类为 IgM，轻链 κ 型。
IgM 型抗体的纯化目前研究较少，商业化的成品价
格昂贵，这也影响了抗体免疫学检测方法的成本及
应用。通过基因工程的方法，获得该株单抗的重链
和轻链可变区序列，并构建入真核表达载体中，就
可以在细胞系中表达和制备重组抗体蛋白，不仅降
低了检测成本，还为抗体基因的改造奠定了基础。
Anfinsen 提出的蛋白质三级结构由其一级序列
决定的理论，成为由一级序列预测蛋白质三维结构
的理论基础。在从头预测法、同源建模法、折叠识
别法 3 种目前最主要的蛋白质空间预测方法中，以
同源建模预测最为实用，准确度最高。当模板蛋白
与目标蛋白的序列相似性超过 60% 时，自动比对方
法就可以获得较为理想的模型［6］。确定抗体可变区
的空间三维结构，为抗原互补决定区（Complementary
determinant region，CDR）与抗原结合的分子机制研
究提供了良好平台，并可以通过基因定向突变的方
法获得更高亲和力的重组抗体或者选择远离抗原互
补决定区的氨基酸进行标记，扩展检测应用领域，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期110
物，以避免简并引物对菌落 PCR 结果造成不良影响。
1.2.2 细 胞 总 RNA 的 提 取 及 第 一 链 cDNA 的 合
成 取 5×106 杂交瘤细胞，按照天根 RNAprep pure
培养细胞 / 细菌总 RNA 提取试剂盒的使用说明书
提取细胞总 RNA。取 2 μL RNA 溶液，按照全式金
TransScript II First-Strand cDNA Synthesis Supermix
试剂盒的操作说明书，以 Oligo（dT）为引物合成
第 一 链 cDNA。 取 2 μL cDNA 作 为 模 板， 用 小 鼠
β-actin、GAPDH 的上下游引物进行 PCR，检测合
成的 cDNA 是否完整。反应程序为 ：94℃ 5 min ；
94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，35 个循环 ；72℃
孵育 10 min。取 6 μL PCR 产物用于琼脂糖电泳检测。
1.2.3 PCR 扩 增 VH、VL 取 2 μL 合 成 的 cDNA 作
为模板，将 VH 或 VL 的上下游引物两两组合配对（每
引物终浓度 0.2 μmol/L），按照全式金 2×TransTaq-T
PCR SuperMix 的使用说明书，以较低的退火温度
进行 PCR 扩增反应。反应程序 ：94℃ 5 min ；94℃
30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，35 个循环 ；72℃孵育
10 min。取 6 μL 用于琼脂糖电泳。
1.2.4 重轻链可变区基因的克隆与序列测定 按照
天根 pGM-T 克隆试剂盒的指导说明书，取适量 PCR
产物与 pGM-T 载体（1 3-1 8）16℃条件下过夜连
接，转化大肠杆菌 TOP10，涂布含有 X-Gal 与 IPTG
的 LB 平板，在氨苄青霉素（50 mg/μL）抗性条件
下 37℃过夜培养。挑取白色菌落于 10 μL 无菌水中，
取 2 μL 作为模板，用 T7、SP6 为引物做菌落 PCR，
选取 3 个阳性克隆摇菌，提取质粒并双酶切鉴定插
入片段大小，保存菌种后测序（测序引物为 T7）。
PCR 扩增反应程序 ：95℃ 10 min ；94℃ 30 s，48℃
30 s，72℃ 50 s，35 个循环 ；72℃孵育 10 min。取
6 μL 用于琼脂糖电泳。
1.2.5 重轻链可变区基因的鉴定 将测序结果中的
载体序列去除，然后输入 NCBI BLAST，分析序列
是否与小鼠免疫球蛋白基因可变区有同源性。查找
是否含有特征性半胱氨酸残基。用 SignalP 3.0 Server
对扩增出的序列进行信号肽分析［12］。用 IMGT/V-
QUEST 分析 4 个骨架区（FR）及 3 个抗原互补决定
区（CDR），并进行胚系分析［13］。
1.2.6 重组抗体真核表达载体的构建 将轻链目的
基因、pBudCE4.1 载体分别用 Hind III、Xba Ⅰ双酶
切，1% 琼脂糖凝胶电泳回收各片段，T4 DNA 连接
酶作用下 16℃连接过夜。取 5 μL 转化 50 μL TOP10
感受态细胞，涂布低盐 LB（含 Zeocin）平板，37℃
过夜培养。菌落 PCR 检测阳性克隆，选择 3 个阳性
引物名称 引物序列（5-3） 长度（bp） 酶切位点
MHV-Fwd1 GGGGCGGCCGCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT 40 Not I
MHV-Fwd2 GGGGCGGCCGCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 40 Not I
MHV-Fwd3 GGGGCGGCCGCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 39 Not I
MHV-Rev1 GGTCTCGAGCTCTCGCAGGACACGAGTGGGAAGAC 35 Xho I
MHV-Rev2 GGGCTCGAGGTATTCATCTGAACCTTCAAGGATGCTCTTGGG 42 Xho I
MHV-Rev3 CTTCTCGAGCCCTGGATGACGTCAGTGTTGTTCTGGTAGTTCC 43 Xho I
MKV-Fwd1 GGGAAGCTTCACCATGGGCWTCAARATGRARWCWCAT 37 Hind III
MKV-Fwd2 GGGAAGCTTCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAC 39 Hind III
MKV-Fwd3 GGGAAGCTTCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA 40 Hind III
MKV-Fwd4 GGGAAGCTTCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT 36 Hind III
MKV-Fwd5 GGGAAGCTTCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 38 Hind III
MKV-Rev1 GGGTCTAGATTAACACTCATTCCTGTTGAAGC 32 Xba I
MKV-Rev2 GGGTCTAGACGATACAGTTGGTGCAGCATC 30 Xba I
MKV-Rev3 GAATCTAGACAAGAAGCACACGACTGAGGCACC 33 Xba I
β-actin-Fwd CTGAACCCTAAGGCCAACCG 20 -
β-actin-Rev CAGGATGGCGTGAGGGAGAG 20 -
GAPDH-Fwd AGGCCGGTGCTGAGTATGTC 20 -
GAPDH-Rev TGCCTGCTTCACCACCTTCT 20 -
T7 TAATACGACTCACTATAGGG 20 -
SP6 ATTTAGTTATTGCTCAGCGG 20 -
表 1 试验所用引物序列
简并碱基标准取自 IUB-IUPAC 数据库
2012年第1期 111李鹏等 ：锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及重组抗体的三维模建
克隆摇菌、保存、提取质粒并测序。将重链目的基因，
含有正确轻链基因的载体用 Not Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切，
回收后连接转化并测序鉴定，步骤同上。
1.2.7 重组抗体的初步表达及鉴定 按照 1×105-
4×105 细胞 /cm2 的密度平铺 293T 细胞于 12 孔细胞
培养板上。培养 24 h 后，用磷酸钙介导的转染方法［14］，
以 pcDNA3.1-EGFP 质粒为对照，将鉴定正确的表
达载体导入 293T 细胞系，4-6 h 后换新鲜的含 10%
胎牛血清的 DMEM 培养基，24-48 h 后荧光显微镜
下观察对照细胞中是否有绿色荧光出现。当绿色荧
光蛋白充分表达时，收集细胞上清并先用 Amicon
Ultra-15（50 kD）超滤离心管过滤除去血清中的大
分子蛋白，随后用 Amicon Ultra-15（10 kD）超滤离
心管浓缩表达产物。以 Zn（II）-DTPA-BSA 为包被
抗原，间接 ELISA 法分别检测纯化前后转染细胞上
清、原杂交瘤细胞系的上清（阳性对照）以及 SP2/0
细胞系的上清（阴性对照）。由于重组抗体不含有完
整的恒定区片段，无法用常规二抗检测，因此选择
载体上的 6×His 标签蛋白作为二抗结合位点，以辣
根过氧化物酶（HRP）标记的抗体为三抗，检测重
组抗体的细胞上清，其余上清均以 HRP 标记的抗体
为二抗直接检测。
1.2.8 VH 及 VL 区的三维模建 以获得的 VH、VL 蛋
白序列为探针，BLAST 搜索 PDB 数据库，选择相似
性最高的晶体结构做为模板。利用 Swiss-Pdb Viewer
软 件［15］ 分 别 构 建 VH 及 VL 的 空 间 模 型， 确 定 其
SCR 区和 Loop 区。SCR 区的空间结构可直接取自模
板，而 Loop 区则需要搜索 Loop 结构数据库，同样
选取相似性最高的 Loop 做为模板构建未知 Loop 的
结构。选择一个与 VH、VL 都具有较小均方根值（root
mean square，RMS）的结果为模板，叠合 VH 与 VL
为一个完整的模型，并对其进行分子力学与动力学
优化，得到 VH-VL 的三维图像模型。用 Procheck 软
件对获得的三维结构进行合理性验证。与已知重金
属抗体 CHA255 进行三维结构比较［16］，确定抗原互
补决定区的关键氨基酸残基。
2 结果
2.1 重轻链可变区基因的PCR扩增
从杂交瘤细胞株中成功提取到总 RNA，反转录
为第一链 cDNA 后，用小鼠 β-actin、GAPDH 作为内
参基因验证反转录 cDNA 的质量。结果（图 1）显示，
两个内参基因均可以得到清晰单一的条带，与预期
条带大小一致，而空白对照体系无条带。
1-4. 以 β-actin 为内参基因 ；5-8. 以 GAPDH 为内参基因 ；1,5. 以水为空白对
照 ；2,6.SP2/0 cDNA 的 RT-PCR 结果 ；3,4,7,8.2E8E3 的 cDNA RT-PCR 结果 ；
M.Marker DL2000
图 1 内参基因验证 cDNA 质量的电泳结果
将扩增 VH、VL 所设计上下游引物两两配对，
PCR 扩增单克隆抗体 2E8E3 的 VH、VL。结果（图 2）
表明，在 VH 方面，引物 MHV-Fwd1 与 MHV-Rev1 的
组合成功扩增出单抗 2E8E3 的 VH，而其他组合均未
出现特异条带（结果未显示）；在 VL 方面，引物 MK
V-Fwd2 与 MKV-Rev1 的组合成功扩增出两个单抗
的 VL，MKV-Fwd2 与 MKV-Rev2 的组合成功扩增出
2E8E3 的 VL，MKV-Fwd2 与 MKV-Rev3 的组合无扩
增条带，其余未出现特异条带的图像未在此处列出。
1. 所用引物为 MHV-Fwd1 和 MHV-Rev1 ；2. 所用引物为 MKV-Fwd2 和 MKV-
Rev1 ；3. 所用引物为 MKV-Fwd2 和 MKV-Rev2 ；4. 所用引物为 MKV-Fwd2 和
MKV-Rev3 ；M.Marker DL2000
图 2 RT-PCR 扩增 VH、VL 的电泳结果
2.2 VH和VL克隆入pGM-T测序载体
取适量 PCR 产物连接入 pGM-T 载体中，培养
后进行 PCR。结果（图 3）显示，均出现预期条带，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期112
取 3 个条带大小正确的克隆摇菌并提取质粒，双酶
切鉴定并测序。
将克隆到的 VH、VL 序列提交到 GenBank 并获得序
列号，结果见表 2。
名称 序列号 相似性（%） 最相似序列号
2E8E3-H JF742068 97 AY704180
2E8E3-L JF339154 98 X79906
名称 V 片段 D 片段 J 片段
2E8E3-H IgHV1-18 IgHD1-2 IgHJ4
2E8E3-L IgKV4-74 - IgKJ5
1.引物为MHV-Fwd1 和MHV-Rev1 Not I 与 Xho I双酶切pGM-T-VH结果；2.（引
物 MKV-Fwd2 和 MKV-Rev1）；3. 引物为 MKV-Fwd2 和 MKV-Rev 2Hind III 与
Xba I 双酶切 pGM-T-VL 结果 ；M.Marker IV
图 3 重组克隆质粒 pGM-T-VH/VL 双酶切鉴定
2.3 VH和VL序列的鉴定
所测序列输入 BLAST 进行分析，结果表明克隆
到 2E8E3 VH 序列 465 bp，与已发表小鼠抗体可变区
的序列高度相似（97%），相似性最大的序列见表 2。
引物 MKV-Fwd2 与 MKV-Rev1 的组合克隆到 2E8E3
VL 序列 715 bp，引物 MKV-Fwd2 与 MKV-Rev2 克隆
到 2E8E3 VL 序列 417 bp，其余引物组合均未扩增
出条带。序列比对结果显示，MKV-Fwd2 与 MKV-
Rev1 引物组合扩增得到的 VL 序列包括了引物 MKV-
Fwd2 与 MKV-Rev2 组合扩增得到的全部序列，并
且虽然另一对引物 MKV-Fwd2 与 MKV-Rev3 在扩增
时无条带，但其序列也包含在 VL 的 715 bp 序列中。
由于引物 MKV-Fwd2 与 MKV-Rev2 的组合扩增到的
序列不包含 Cys 残基，因此用 MKV-Fwd2 与 MKV-
Rev3 引物扩增 715 bp 序列以保证所获得序列中含有
Cys 残基。BLAST 分析发现， 2E8E3 的 VL 序列与已
发表小鼠抗体可变区也存在较高相似性（98%）。从
BLAST 结果可以判定，克隆得到的 VH、VL 均与小
鼠抗体可变区同源。
SignalP 3.0 Server 分析（图 4）发现，VH、VL 5
端均含有可正确剪切的信号肽区域。登录入 IMGT-
V/QUEST 分析发现，克隆到的序列均含有两个正确
的特征性半胱氨酸残基，4 个骨架区（FR）及 3 个
抗原互补决定区（CDR）。重轻链可变区序列的胚系
分析结果见表 3，FR 及 CDR 分区结果见图 5，图 6。
表 2 BLAST 同源性分析及提交后获得的 GenBank 序列号
表 3 2E8E3 的 VH、VL 胚系分析
图 4 SignalP 3.0 Server 预测信号肽结果
2.4 重组抗体真核表达载体的构建及初步表达
将 2E8E3 的 VH、VL 基因分别构建入真核表达
载体，转化 TOP10 感受态细胞后提取质粒双酶切（图
7）并测序验证。将构建正确的表达载体质粒转染入
293T 细胞，24 h 后荧光显微镜下观察（图 8）发现，
pcDNA3.1-EGFP 对照质粒已经充分表达，此时用超
滤离心管分两次纯化浓缩表达的上清，并用 ELISA
检测其表达活性。结果显示，表达产物对 Zn-DTPA-
BSA 抗原具有免疫活性，但只有天然抗体（阳性对照）
的 20%，纯化后抗体效价有一定提高。
2.5 VH及VL区的三维模建
BLAST 搜索 PDB 数据库，寻找到与 VH 最相似
2012年第1期 113李鹏等 ：锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及重组抗体的三维模建
的模板 3cvi（相似性 86.7%），与 VL 最相似的模板
15c8（相似性 95.6%）。用 Swiss-Pdb Viewer 软件构
建各可变区的三维结构。选择 3cvi 作为模板叠合 VH
（RMS=0.33） 与 VL（RMS=0.64） 为 一 个 总 的 三 维
结构，优化结构后得到 2E8E3 的三维模型（图 9）。
用 Procheck 评价三维结构的合理性，大于 92.3% 的
残基位于拉氏图（Ramachandran plot）的最理想区
（most favoured region），0.5% 的残基位于不允许区
（disallowed region），说明结构基本合理。选择位于
抗体 2E8E3 抗原互补决定区表面的氨基酸残基作为
关键氨基酸残基（图 5，图 6）。根据推测的关键氨
图 5 2E8E3 VH 序列、CDR 区与 FR 区分析及其推测的关键氨基酸残基（粗线黑框）
图 6 2E8E3 VL 序列、CDR 区与 FR 区分析及其推测的关键氨基酸残基（粗线黑框）
1.Not I 与 Xho I 双酶切结果 ；2.Hind III 与 Xba I 双酶切结果 ；M.DNA
Marker IV
图 7 重组表达质粒 pBudCE4.1-2E8E3 的鉴定
图 8 对照质粒 pcDNA-EGFP 的表达结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期114
基酸残基，绘制了抗体活性部位的表面图（图 9）。
3 讨论
从分泌鼠单抗的杂交瘤细胞中克隆出可变区
基因，是构建基因工程抗体的第一步，目前主要通
过两条技术路线来实现。一是用探针从基因组文库
中或 cDNA 文库中钓取，二是用 RT-PCR 的方法从
mRNA 中分离。由于第一种方法操作繁琐，难度较高，
现在一般采用第二种方法，而其最关键的部分在于
引物设计。前端引物可以设计在第一骨架区（FR1）
或信号肽区，而后端引物可以设计在第四骨架区
（FR4）或恒定区。此外，还可以只设计后端引物利
用 5-RACE 的方法扩增可变区序列［7］。根据 FR1 及
信号肽区的相对保守性位点，可以设计前端简并性
引物，但简并引物位于 FR1 时，可能会改变骨架区
的序列，进而改变抗体的氨基酸序列［10］。本试验将
引物设计在信号肽及恒定区，可以最大程度的保证
FR 及 CDR 序列的完整性。同时由于前端携带信号
肽序列保证抗体分泌到胞外，后端恒定区含有的半
胱氨酸残基使得重组 VH、VL 可以结合在一起，因此
该载体可以直接用于真核表达。表达活性结果也表
明这一策略是可行的。目前的基因工程重组抗体以
构建单链抗体（scFv，single-chain Fv）在原核生物
中表达最为普遍，但本实验室的前期研究发现，重
金属单抗的 scFv 几乎无活性［16］。这可能与重金属
单抗的原核表达不能正确修饰［7］以及重金属抗原分
子较小的性质［4］有关。因此本试验采取真核表达策
略，并尽最大可能保证可变区序列的完整性。
从本试验所选引物的扩增情况看，有些后端引
物即使包含在可变区序列中也未必能扩增到相应序
列。 以 引 物 MKV-Fwd2 分 别 与 MKV-Rev1、MKV-
Rev2 和 MKV-Rev3 配 对 的 扩 增 及 测 序 结 果 为 例，
引 物 MKV-Fwd2 与 MKV-Rev1 组 合 扩 增 到 较 长 的
715 bp 序列，此序列中包含了完整的 MKV-Rev2 和
MKV-Rev3 引物位点，但只有 MKV-Rev2 可在通用
PCR 条件下扩增出相应条带。对 MKV-Rev3 引物进
行 PCR 条件的优化发现可以扩增到相应条带，说明
对不同的引物进行 PCR 条件的优化［17］是必要的。
SP2/0 与脾细胞形成的杂交瘤细胞中往往会分
泌无功能性的异常 κ 轻链［18］；引物的简并性以及抗
体可变区的高度多样性也使得扩增 VH、VL 获得的序
列必须经过验证，以保证获得正确的抗体可变区序
列。本试验获得的序列经过 BLAST 比对并验证正确，
经 SignalP 3.0 Server 分析信号肽序列，后用 IMGT/V-
QUEST 分析其胚系。确定为真正的小鼠抗体可变区
序列后，用 BankIt 提交到 GenBank，并获得了相应
的序列号。
目前重金属重组抗体的真核表达以 Fab 片段
为主，活性与天然 Fab 片段相当［19］。本试验的真
核表达结果显示，重组抗体活性较低，纯化后的
OD450 也只有天然抗体的 20%。对抗体表达产物的
图 9 2E8E3 的三维结构模型及其推测的关键氨基酸残基和其表图
表 4 ELISA 测定重组抗体表达活性结果
活性比 = OD 值（纯化）/OD 值（阳性）×100%
OD 值（阳性） OD 值（未纯化） OD 值（纯化后） 活性比
2E8E3 1.380±0.072 0.109±0.024 0.264±0.038 20%
2012年第1期 115李鹏等 ：锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及重组抗体的三维模建
初步纯化结果显示，活性比纯化前提高了 2.4 倍，
说明重组抗体活性较低可能是表达量较低所致。对
表达体系进一步优化，并对表达产物进行亲和层析
纯化［14］会显著提高重组表达抗体的效价。
Love［20］在测定 CHA255 与金属螯合物抗原结
合在一起的晶体结构后，认为其 CDR 的组氨酸残基
与抗原配位结合，是重要的氨基酸残基。本试验克
隆到抗体的 HCDR3 序列也含有组氨酸残基，并含
有两个精氨酸残基，推测其皆有可能是与抗原配位
结合的关键氨基酸。正确 VH、VL 序列的获得以及三
维结构的成功模拟不仅为下一步的抗体基因定向突
变 以提高抗体亲和力奠定了基础，还为抗体中非重
要氨基酸的确定与标记得以应用到环境检测领域提
供保证。
4 结论
本研究成功扩增了抗锌（II）- 二乙烯三胺五乙
酸（Zn（II）-DTPA）的单克隆抗体杂交瘤细胞株
2E8E3 的重、轻链可变区序列。其中，重链 465 bp、
轻链 417 bp，分别与小鼠抗体的 μ 重链，κ 轻链抗
体可变区序列具有同源性。将获得的可变区序列提
交到 GenBank 并转入 293T 真核细胞进行表达，其
表达产物具有抗重金属锌（II）- 二乙烯三胺五乙酸
（Zn（II）-DTPA）螯合物的活性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）