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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):138-143
溶 菌 酶（Lysozyme，LYZ） 是 一 类 酶 的 总 称，
能水解细菌细胞壁的肽聚糖，水解位点是 N-乙酰葡
萄糖胺和 N-乙酰胞壁酸之间的 β-1，4 糖苷键，引起
细菌裂解。溶菌酶是许多生物先天性免疫系统的重
要组成成分，它不仅成为蛋白质化学、酶学、结晶
学、光谱学、免疫学和分子生物学的研究模型，还
收稿日期 ：2015-05-19
基金项目 ：贵州省科技合作计划项目（黔科合 LH 字［2015］7336 号），贵阳市科技计划项目（筑科合同［20151001］社 19 号），贵州省
科技基金项目（黔科合 LH 字［2014］7085 号），贵州省教育厅自然科学研究项目（黔教合 KY 字［2012］039 号）
作者简介 ：王赟，女，硕士，研究方向 ：医学昆虫分子生物学 ；E-mail ：forever_wangyun@sina.cn
通讯作者 ：张春林，男，硕士，研究方向 ：医学昆虫分子生物学 ；E-mail ：zcl@gmc.edu.cn
美洲大蠊 i 型溶菌酶的原核表达及多克隆抗体制备
王赟1  翟素珍2  张春林2  王吉平2
（1. 贵州医科大学生物与工程学院，贵阳 550004 ；2. 贵州医科大学基础医学院，贵阳 550004）
摘 要 ： 旨在获得美洲大蠊 i 型溶菌酶 PaI 的原核表达蛋白，并制备鼠抗 PaI 多克隆抗体。PCR 扩增 PaI 成熟肽编码序列，
构建原核表达载体 pET28a-PaI，诱导表达、纯化 PaI-His 融合蛋白，免疫 Balb/c 小鼠，间接 ELISA 法检测抗血清效价，Western
blotting 检测多克隆抗体的特异性。结果显示，PaI 成熟肽部分的编码序列长 414 bp，由 137 个氨基酸组成。构建的原核表达载体
pET28a-PaI 在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中成功表达，SDS-PAGE 检测显示纯化的 PaI-His 融合蛋白的大小约为 18 kD，间接 ELISA
和 Western blotting 分析表明免疫小鼠产生的抗血清具有较高的效价和较强的特异性。美洲大蠊溶菌酶 PaI 成功实现原核表达，并
获得了高效价特异性多克隆抗体。
关键词 ： 美洲大蠊 ；溶菌酶 ；原核表达 ；多克隆抗体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.023
Prokaryotic Expression of i-type Lysozyme from Periplaneta americana
and Preparation of Its Polyclonal Antibodies
WANG Yun1 ZHAI Su-zhen2 ZHANG Chun-lin2 WANG Ji-ping2
（1. School of Biology and Engineering，Guizhou Medical University，Guiyang 550004 ；2. School of Basic Medical Sciences，Guizhou Medical
University，Guiyang 550004）
Abstract: The objective of this work is to express i-type lysozyme（PaI）from Periplaneta americana in Escherichia coli and prepare
its polyclonal antibodies of anti-PaI in mice. The coding gene of mature peptide region was amplified by PCR and prokaryotic expression vector
pET28a-PaI was constructed. PaI-His fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni-NTA affinity chromatography. Then,
Balb/c mice were immunized with the purified recombinant protein, and the titers of antiserum and the specificity of polyclonal antibodies were
detected by indirect ELISA and Western blotting respectively. Results were as below. The length of nucleotide sequence encoding the mature
peptide was 414 bp that encoded a putative protein with 137 amino acids. The constructed prokaryotic expression vector pET28a-PaI was
successfully expressed in Escherichia coli. SDS-PAGE detection indicated that the PaI-His fusion protein was about 18 kD. Indirect ELISA and
Western blotting analysis showed that the antiserum from immunized mice had high titer and specificity. In conclusion, the prokaryotic expression
of PaI protein was successfully realized, and the anti-PaI polyclonal antibody with high efficiency and specificity were prepared, which laid the
foundation for the further researches on the biological function of PaI protein.
Key words: Periplaneta americana ；lysozyme ；prokaryotic expression ；polyclonal antibody
2016,32(1) 139王赟等：美洲大蠊 i 型溶菌酶的原核表达及多克隆抗体制备
被证实具有抑菌防御功效，并被用作食品和药品
的防腐剂［1，2］。根据结构特征、催化特征、免疫
特性和来源可以将溶菌酶分成 6 种类型 ：c 型溶菌
酶（Chicken-type lysozyme）、g 型 溶 菌（Goose-type
lysozyme）、i 型 溶 菌 酶（Invertebrate-type lysozyme）、
噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶和细菌溶菌酶［3］。c 型、
g 型和 i 型溶菌酶是动物型溶菌酶。其中，c 型溶菌
酶是同时存在于无脊椎动物和脊椎动物中的类型，g
型溶菌酶主要存在于脊椎动物，而 i 型溶菌酶存在
于无脊椎动物中［4］。目前，科研人员已对不同动物
来源的不同溶菌酶基因和蛋白进行了广泛的研究，
发现溶菌酶在动物的很多组织中广泛存在，经不同
外源微生物刺激后其表达水平会发生改变［5-7］。同
时，利用大肠杆菌表达系统和酵母表达系统等进行
体外异源表达，获得溶菌酶进行抑菌活性研究［8，9］。
美洲大蠊属于昆虫纲蜚蠊目，其生活环境肮脏，
能携带多种病原体，是人类许多传染性疾病的重要
传播媒介［10］。当然，美洲大蠊能够在恶劣的环境中
顽强生存，也说明它能有效抵御病原菌的感染，具
有独特的免疫防御机制。在前期工作中，本课题组
通过 RT-PCR 和 RACE PCR 技术，获得了美洲大蠊
i 型溶菌酶基因 PaI（GenBank 登录号 ：JQ754173），
并对其功能活性位点等进行了分析［11］。为进一步明
确该基因的功能，本研究通过扩增 PaI 成熟肽的编
码序列，构建其原核表达载体，并进行原核表达和
纯化，免疫小鼠制备多克隆抗体，旨在为进一步研
究美洲大蠊 i 型溶菌酶的分子生物学特征及功能奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 与 载 体 表 达 菌 株 大 肠 杆 菌 Rosetta
（DE3）及质粒 pET-28a（+）、pMD18-PaI 均由本校
生物学教研室保存。
1.1.2 主要试剂 Hind III 和 BamH I 限制性核酸内
切 酶、Taq 酶、T4 DNA 连 接 酶、DNA Marker、 低
分子量蛋白质 Marker 为宝生物工程（大连）有限公
司产品 ；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、
His-镍蛋白纯化套装为北京天恩泽基因科技有限公
司产品 ；异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-
1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素、氯霉素为
北京索莱宝科技有限公司产品 ；兔抗 His 标签抗体、
辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗、HRP 标
记羊抗鼠二抗、二氨基联苯胺（DAB）/5- 四甲基联
苯胺（TMB）显色试剂、BCA 蛋白定量试剂盒为博
士德生物工程有限公司产品 ；引物由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。
1.1.3 实验用动物 Balb/c 小鼠购自贵州医科大学
实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 PaI 成 熟 肽 编 码 序 列 的 扩 增 根 据 前 期 获
得 的 PaI 基 因 序 列， 用 Primer Premier 5.0 软 件 设
计 扩 增 成 熟 肽 序 列 的 上 下 游 引 物。 上 游 引 物 为
5-CGGGATCCCAGCAGCAACCGAAG-3（ 下 划 线 为
BamH I 酶切位点）；下游引物为 5-CCCAAGCTTTT-
ACAGTGGAACG-3（下划线为 Hind III 酶切位点）。
以实验室构建的重组质粒 pMD18-PaI 为模板进行
PCR 扩增，该重组质粒含 PaI 全长编码序列。PCR
扩增条件 ：94℃ 5 min ；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃
1 min，30 个循环 ；72℃ 5 min。PCR 扩增产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测后，使用琼脂糖凝胶回收试剂
盒回收目的片段。
1.2.2 重组表达质粒 pET28a-PaI 的构建及测序 用
BamH I 和 Hind III 双酶切纯化的 PaI 基因片段以及
pET-28a（+）载体，回收酶切产物。用 T4 DNA 连
接酶将质粒与目的基因片段在 16℃水浴连接过夜，
转化大肠杆菌 Rosetta（DE3）感受态细胞，挑取单
菌落进行培养。经 PCR 初步筛选阳性克隆，再抽提
重组质粒用 BamH I 和 Hind III 双酶切进一步鉴定后
测序。
1.2.3 重组载体的诱导表达 将构建成功的重组工
程菌接种于含卡那霉素的 LB 液体培养基中，37℃
摇床培养至 OD600 ≈ 0.6 时，加入终浓度为 1 mmol/L
IPTG 诱导 4 h，按常规进行 SDS-PAGE 检测，分析
目的蛋白表达情况。以空质粒 pET-28a（+）作对照。
1.2.4 产物表达形式的鉴定 取 5 mL 诱导表达的菌
液以 8 000 r/min 离心 10 min 收集菌体，加入细菌裂
解缓冲（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1 mmol/L EDTA、
0.1 mol/L NaCl）悬浮菌体沉淀，反复冻融后在冰浴
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1140
中超声破碎细菌，离心后分别收集上清及沉淀样品
进行 SDS-PAGE 电泳，分析重组蛋白的表达情况。
1.2.5 包涵体的提取和纯化 重组工程菌大量诱导
表达，离心收集菌体沉淀，用细菌裂解缓冲液重悬
菌体，反复冻融 3 次，加入 100 mmol/L PMSF，在冰
浴中超声碎菌。破碎后离心弃上清，获得包涵体蛋
白。向包涵体中加入含 8 mol/L 尿素的 PBS 缓冲液，
4℃缓慢搅拌下使包涵体溶解过夜。待包涵体完全溶
解后，用 0.45 μm 滤膜过滤，用 Ni-NTA 亲和层析柱
按操作说明纯化溶解的包涵体蛋白。其中洗柱的结
合液含 5 mol/L 尿素，洗脱液含 200 mmol/L 咪唑。
1.2.6 包涵体的复性 采用梯度透析法对纯化的变
性蛋白进行复性［12］。调整亲和层析洗脱的蛋白浓度
为 1 mg/mL，将稀释后的变性蛋白装入预先处理的
透析袋中。将透析袋依次在含 6、4、3、2、1 和 0
mol/L 尿 素 的 50 mmol/L Tris-HCl 溶 液 及 ddH2O 中，
分别在 4℃条件下搅拌透析 4 h。其中在含 2 mol/L
和 1 mol/L 尿 素 的 Tris-HCl 中 均 加 入 终 浓 度 为 0.8
mol/L 的精氨酸，一定程度上抑制复性过程中蛋白的
聚集。复性后的蛋白用 BCA 蛋白定量试剂盒测定其
浓度。
1.2.7 重组融合蛋白的 Western blotting 分析 将纯
化蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，然后电转移至 PVDF
膜上，5% 脱脂奶粉封闭液 4℃封闭过夜，经 TBS-T
（pH7.4）漂洗后，PVDF 膜转入兔抗 His 标签抗体
（1∶1 000），低速摇床上结合 1 h，TBS-T 洗膜后与
HRP 标记羊抗兔二抗在低速摇床上结合 1 h，最后
DAB 显色至目的条带清晰。
1.2.8 PaI 多克隆抗体的制备 将纯化的重组蛋白进
行动物免疫。取 5-7 周龄 Balb/c 小鼠 4 只，尾静脉
取血作为阴性对照。初次免疫，50 μg 纯化的融合蛋
白与弗氏佐剂等比例混合，超声乳化后皮下和腹腔
多点注射 ；2 周后，加强免疫，PaI 蛋白与不完全弗
氏佐剂等量混合超声乳化后皮下和腹腔多点注射 ；
加强免疫后 2 周，追加免疫，同等剂量 PaI 蛋白腹
腔注射。追加免疫后 3 d，眼球取血并分离多抗血清。
1.2.9 抗血清的效价检测及特异性分析 将纯化得
到的重组 PaI 蛋白作为抗原包被 ELISA 板，用 BSA
封闭后，将倍比稀释的抗血清加入反应孔中，37℃
孵育 2 h，同时用免疫前的小鼠血清作对照。洗涤后
加入 HRP 标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育 1.5 h。洗
涤后，加入底物 TMB 显色，反应 20 min，加入终止
液，以 450 nm 波长测定其光密度。Western blotting
检测效价最高抗血清的特异性，方法同 1.2.7。
2 结果
2.1 PaI成熟肽编码序列的扩增
以含有酶切位点的引物进行 PCR 扩增，扩增产
物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测（图 1），可见约 430
bp 的特异条带大小，与预期相符。
M ：DNA 标准 DL2000 ；1 ：PCR 产物 ；2 ：酶切回收 PCR 产物
图 1 美洲大蠊 i 型溶菌酶成熟肽基因片段 PCR 结果
bp
2000
1000
750
500
250
100
㓖430bpM 1 2
2.2 重组表达质粒pET28a-PaI的酶切鉴定及测序
回收的 PCR 产物和表达载体 pET-28a（+）经
BamH I 和 Hind III 双酶切后进行连接，转化感受态
细胞 Rosetta（DE3），获得重组质粒 pET28a-PaI。重
组质粒经双酶切后得到一条约 430 bp 与 PCR 产物
大小较一致的条带，在约 6 000 bp 处出现了与线性
pET-28a（+）大小较一致的条带（图 2），初步判断
bp
2000
1000
750
500
250
100
2027
M1 1 M2
6361
6557
23130
bp
M1 ：DNA 标准 DL2000 ；M2 ：DNA 标准 λ-Hind III ；1 ：经 BamH I 和 Hind
III 双酶切后的重组质粒 pET28a-PaI
图 2 pET28a-PaI 重组质粒的酶切鉴定
2016,32(1) 141王赟等：美洲大蠊 i 型溶菌酶的原核表达及多克隆抗体制备
目的基因成功与表达载体相连。测序结果显示插入
序列与课题组前期提交的 PaI 序列（JQ754173）完
全一致，且阅读框正确，进一步证明重组表达载体
构建成功。
2.3 重组质粒的诱导表达及检测
重组质粒经 IPTG 诱导表达后，SDS-PAGE 电泳
检测结果（图 3）显示，诱导后的菌体总蛋白相对
未诱导的菌体总蛋白在相对分子质量约 18 kD 处可
见特异性蛋白条带，与预期大小相符。收集菌体经
超声破碎后，取离心后的上清和沉淀分别进行 SDS-
PAGE 电泳，结果显示目的蛋白以包涵体形式存在。
鼠的抗血清进行 Western blotting 分析，结果（图 7）
表明，免疫后的抗血清可见明显的特异性免疫反应
条带，而阴性对照血清在相应的位置未识别出条带。
3 讨论
昆虫具有许多免疫功能的多肽类物质，与血细
胞一起组成了昆虫体内免疫功能体系。受到细菌等
M ：蛋白分子质量标准 ；1 ：pET28a-PaI 诱导前 ；2 ：pET28a-PaI 诱导后 ；3 ：
pET-28a（+）诱导前 ；4 ：pET-28a（+）诱导后 ；5 ：pET28a-PaI 诱导后裂解
上清 ；6 ：pET28a-PaI 诱导后裂解沉淀
图 3 SDS-PAGE 分析重组蛋白的诱导表达情况
M ：蛋白分子质量标准 ；1 ：溶解包涵体复性蛋白 ；
2 ：包涵体变性溶解后上清
图 4 SDS-PAGE 分析复性的重组蛋白
M ：蛋白分子质量标准 ；1 ：pET28a-PaI 诱导前 ；2 ：pET28a（+）-PaI 诱导后 ；
3 ：纯化复性后的重组 PaI 蛋白
图 5 重组蛋白的免疫印迹鉴定
图 6 抗 PaI 多克隆抗血清的效价
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
18
kD
M1 1 2 3 4 5 6
2.4 重组融合蛋白的纯化及复性
超声破碎处理诱导后的重组工程菌，离心获得
包涵体，将包涵体变性后纯化并用梯度尿素复性，
复性蛋白进行 SDS-PAGE 检测（图 4），呈现一条
约 18 kD 条带。BCA 法测定蛋白浓度为 1.23 mg/mL。
利用抗 His 标签抗体进行 Western blotting 分析纯化
和复性后的重组蛋白，同样在约 18 kD 处可见清晰
的条带（图 5），与 SDS-PAGE 检测结果一致。
2.5 抗血清效价检测及特异性分析
将纯化复性的 PaI 重组蛋白共免疫 4 只 Balb/c
小鼠，获得小鼠抗 PaI 抗体后，用间接 ELISA 检测
抗体效价，结果（图 6）显示，免疫的 4 只小鼠均
产生了较强的免疫反应。其中 3 号免疫小鼠的抗血
清效价最高，超过 1∶128 000，最低的 2 号小鼠亦
达到 1∶64 000 以上。选择效价最高的 3 号免疫小
kD
116
200
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
6.5
㓖18kDM 1 2
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
㓖18kDM 1 32
1 2 4 8 16㹰␵〰䟺ᓖ×10332 64 128 2561#ሿ啐2#ሿ啐3#ሿ啐4#ሿ啐ƸA 450nm 2.01.51.00.50.0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1142
异物刺激后，很多昆虫均能有效诱导溶菌酶、抗菌肽、
凝集素和血素等血淋巴抗菌蛋白的增加，以增强机
体的免疫防卫能力，维持内环境的稳定［13］。美洲大
蠊是重要的卫生昆虫，有研究报道发现美洲大蠊在
大肠杆菌诱导后，其血淋巴的抗菌活性增强，被认
为是诱导后其体内溶菌酶、抗菌肽、凝集素、血素
等抗菌蛋白增加［14］。李远辉等［15］运用不同的方法
获得美洲大蠊提取液，证实其对大肠杆菌、金黄色
葡萄球菌和绿脓杆菌均有抑菌活性。因此，本研究
在获得美洲大蠊 i 型溶菌酶 PaI 编码序列的基础上，
通过体外表达获得溶菌酶 PaI 蛋白并制备抗 PaI 多
克隆抗体对其功能的研究具有重要的意义。
大肠杆菌原核表达系统由于其遗传背景清楚、
转化及表达效率高、成本低廉，被广泛地用于异源
蛋白的体外表达［16，17］。但在使用大肠杆菌对高等
生物功能基因进行重组表达过程中，重组蛋白往往
以无活性的包涵体形式存在，这主要是因为在重组
蛋白的大量表达过程中，缺乏某些蛋白质正确折叠
所需要的酶和分子伴侣等，或因环境不适无法形成
正确的次级键等［18］。为了获得有活性的重组蛋白，
需要将包涵体中的重组蛋白变性溶解，然后再加以
复性，使重组蛋白分子重新折叠形成正确的空间结
构［19，20］。本研究构建了重组表达载体 pET28a-PaI，
转 入 大 肠 杆 菌 Rosetta（DE3） 感 受 态 细 胞 中， 经
IPTG 诱导后成功表达目的蛋白，但重组蛋白以包涵
体形式存在。经高浓度尿素变性纯化并通过梯度尿
素复性后，获得的目的蛋白可用于后续功能的研究。
抗 PaI 抗体是在翻译水平研究 i 型溶菌酶表达
模式的关键试剂，但目前国内外尚未见该抗体的产
品或抗体制备的研究报道。常规制备多克隆抗体可
采用免疫家兔或小鼠获得，与免疫家兔相比，免疫
小鼠制备免疫血清具有蛋白用量少、周期短、免疫
效价高、成本低等优点［21］。因此，本研究利用原核
表达获得的 PaI 重组蛋白免疫 Balb/c 小鼠，获得的
抗血清能与 PaI 蛋白特异性结合，可用于 PaI 在美
洲大蠊体内表达水平的研究，为美洲大蠊 i 型溶菌
酶基因功能的研究奠定了基础。
4 结论
本研究获得了美洲大蠊 i 型溶菌酶（PaI）成熟
肽编码序列，成功构建重组表达质粒 pET28a-PaI，
并在大肠杆菌中表达，亲和层析纯化获得大小约 18
kD 的目的蛋白，并成功制备了鼠抗 PaI 多克隆抗体，
ELISA 检测显示抗血清效价较高，Western blotting 验
证其具有较好的特异性。
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kD
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
㓖18kDMA 1 32 kD97.266.444.329.020.1
14.3
MB 1 32
A：小鼠免疫前的对照血清；B：小鼠免疫后抗血清。M：蛋白分子质量标准；1：
pET28a-PaI 诱导前 ；2 ：pET28a-PaI 诱导后 ；3 ：纯化复性后的重组 PaI 蛋白
图 7 Western blotting 检测分析鼠抗 PaI 抗体的特异性
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（责任编辑 马鑫）