全 文 ：·综述与专论· 2012年第9期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2012-03-15
基金项目 : 山东省自然科学基金项目（Q2008D07）, 山东省高等学校科研发展计划（J10LC08）
作者简介 : 陈静 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 发酵工程 ; E-mail: chenjinga008@163.com
通讯作者 : 侯运华 , 男 , 副教授 , 研究方向 : 丝状真菌分子生物学 ; E-mail: houyunhua@sohu.com
阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase EC）又称肉桂
酸酯酶，是指能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和
多糖阿魏酸酯中的酯键，并释放阿魏酸的一种羧酸
酯酶。1987 年首先从蓝色链霉菌属中发现了此酶，
自 1991 年被纯化出来以后已经从真菌和细菌中发现
并纯化出了多种阿魏酸酯酶［1］。在植物细胞壁中，
阿魏酸与木聚糖和木质素等以酯键或醚键相互交联，
形成致密的网络结构，防止外界环境对植物细胞壁
的降解。阿魏酸酯酶可以降解这些相互交联的酯键，
在植物细胞壁的降解过程中起了关键的作用。在造
纸的制浆过程，传统的化学漂白法会在后续的步骤
中产生大量的白泥，不但占据空间难以降解，而且
没有很好的经济价值［2］。阿魏酸酯酶对禾本科植
物细胞壁交联结构解聚有明显效果，在造纸制浆过
程中促进木质素的降解，因此可替代氯用于纸浆漂
白［3］。在饲料生产和酿造工业中，阿魏酸酯酶同样
有助于植物原料的处理，提高生产效率［4-6］。
目前，尽管发现了多种产阿魏酸酯酶的菌株，
但是还没有见到能直接用于工业化生产的报道。通
常从自然环境中直接筛选的菌株生产和分泌能力都
很有限，经过发酵条件优化等策略，产量的提高效
果不太明显，所用的摸索时间也较长。鉴于此，利
用分子生物学手段构建基因工程菌株便成为了一个
很好的方向。已经有部分研究者成功构建了产阿魏
酸酯酶的工程菌株并对其产酶活性进行了系统研究。
本文就此方面的研究进展进行综述。
1 阿魏酸酯酶的微生物来源及分类
1987 年，Mackenzie 等［7］ 在 橄 榄 色 链 霉 菌
（Streptomyces olivochromogenes） 中发现阿魏酸酯酶可
以从麦麸中释放出阿魏酸，此后阿魏酸酯酶被认为
属于半纤维素水解酶系。研究表明，丝状真菌和细
菌均能向胞外分泌产生阿魏酸酯酶，其中曲霉属的
丝状真菌在所有能分泌阿魏酸酯酶的微生物中占了
近 1/3。
目前发现的产阿魏酸酯酶的微生物主要有黑曲
霉（Aspergillus niger）、绳状青霉（Penicillium funicu-
阿魏酸酯酶基因工程菌研究进展
陈静 朱汇源 侯运华 周燕燕 胡泓宇
（山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250353）
摘 要： 阿魏酸酯酶能水解阿魏酸、多聚阿魏酸与木聚糖以及木质素之间形成的酯键，有利于植物细胞壁的降解。介绍阿
魏酸酯酶的微生物来源、阿魏酸酯酶基因工程菌构建和阿魏酸酯酶与其他酶相互协同作用等的研究进展。
关键词： 阿魏酸酯酶 协同作用 克隆与表达 工程菌构建
Review on Gene Engineering Strains of Feruloyl Esterases
Chen Jing Zhu Huiyuan Hou Yunhua Zhou Yanyan Hu Hongyu
（Food and Bioengineering Department of Shandong Polytechnic University，Ji’nan 250353 ）
Abstract: Feruloyl esterase can increase the rate and extent of cell wall degradability by catalyzing esters bonds between ferulates
dimers，oligomers and oxylans，lignin. This paper reviewed the research progress and trend in recent studies related to main enzyme-producing
microorganisms，gene engineering strains and the synergic reaction between feruloyl esterase and other enzymes.
Key words: Feruloyl esterase Synergistic reaction Cloning and expression Establishment of engineering strains
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期36
losum）、黄柄曲霉（Aspergillus flavipes）、泡盛曲霉
（Aspergillus awamori）、 米 曲 霉（Aspergillus oryzae）、
塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、构巢曲霉（Aspe-
rgillus nidulans）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和
米黑根毛霉（Talaromyces stipitatus）等丝状真菌。此
外，在细菌如阿佛曼菌（Streptomyces avermitilis）、
热纤梭菌（Clostridium thermocellum）、发酵乳酸杆菌
（Lactobacillus fermntum）和荧光假单胞菌（Pseudom-
onas fluorescens）等菌中也发现了该酶［8］。
不同微生物来源的阿魏酸酯酶其理化性质、基
因序列和酶作用机理均存有明显差异，即便是同属
的微生物所分泌的阿魏酸酯酶在性质上差别也较大，
这就为阿魏酸酯酶的分类带来较大的不便。
依据阿魏酸酯酶的蛋白质序列和作用底物特异
性，可将该酶分为 4 大类，即 A、B、C、D。4 类阿
魏酸酯酶都有自己独特的作用位点和喜好。其中 A
类对含甲氧基的酚类衍生物具有特殊的嗜好，并且
对以 1-5 酯键连接在阿拉伯糖残基上的阿魏酸具有
专一催化性 ；B 类在 A 类基础上更倾向于 ρ-香豆酸
和咖啡酸等含有 1-2 个羟基的底物 ；C、D 两类阿魏
酸酯酶除了在催化分离 5-5阿魏酸二聚体的能力上
有较小差异外，对人工合成的羟基肉桂酸则表现出
了范围较广的专一性［9］。A 类与 B 类的不同之处在
于A类对苯环上含有较大取代基的疏水底物更专一。
另外，A、D 的产物与 B、C 相比含有少量的阿魏酸
二聚体［10，11］。A 类可作用于人工合成的阿魏酸甲酯、
芥子酸甲酯及香兰酸甲酯中的酯键，B 类可水解人
工合成的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯及香兰酸甲酯但
对芥子酸甲酯没有效果。从 NCBI 的搜索结果发现，
现已公布的阿魏酸酯酶基因序列 A 类的占多数，并
且经 A 类的酶作用可以获得阿魏酸等副产物，因此
A 类的阿魏酸酯酶有更大的发展空间。除了以上 4
类，还发现了多种具有阿魏酸酯酶活性的其他水解
酶，但结构和功能与阿魏酸酯酶存在差别，因此有
关阿魏酸酯酶的分类情况有待进一步研究。
2 阿魏酸酯酶基因工程菌的研究
2. 1 阿魏酸酯酶的序列相似性
阿魏酸酯酶蛋白保守序列的分析有助于该
酶基因的克隆和分析。Shin 等［12］研究发现 4 类
阿魏酸酯酶均有各自特定的保守序列 ：A 类有典
型的 GHSLG 保守序列 ；C 类有共同的 GCSTG 序
列，并且 C 类阿魏酸酯酶的序列有一个 13 个氨基
酸 构 成 的 保 守 区（SYYLGCSTGGRQG）， 而 A 类
型的酶中也有相似的 16 个氨基酸组成的保守序列
（ALTVTGHSLGASLAAL）。后来研究发现 C 类的阿
魏酸酯酶还有另外 2 个高度保守区（TGRFLSTGNGG
和 GFATVGANNGHNGTS）。研究表明酯酶基序所在
的保守序列可能与底物作用的专一性相关。对 NCBI
数据库搜索分析发现不同的物种分泌产生的阿魏酸
酯酶基因序列差异很大，A 类阿魏酸酯酶序列和其
他三类相比较同源性比较高，D 类阿魏酸酯酶同源
性较低。即使是同种类型的阿魏酸酯酶蛋白序列，
在不同的物种中保守的序列很短，这些特点给阿魏
酸酯酶基因的克隆和表达带来了困难和障碍，增加
了基因克隆的难度。
阿魏酸酯酶蛋白保守序列的分析表明该蛋白的
保守性比较低，但是不同来源的阿魏酸酯酶除了保
守氨基酸序列类似外，在其他方面也具有相似性。
如刘晶晶等［13］研究分析发现，虽然不同种类的
FAE 氨基酸残基序列相差很多，最大的可相差 300
个残基，但是各种酯酶的信号肽的长度却较一致，
都在 17-21 个氨基酸残基之间，第一个氨基酸残基
很保守都为甲硫氨酸。对不同酯酶的信号肽分类后
发现，信号肽的聚类情况和酯酶的分类也是一致的，
A、B 两类酯酶明显分开聚类，且从进化的角度看，
A 与 B 之间的亲缘关系较远，而 A 与 C 之间的亲缘
关系则较近。
2.2 阿魏酸酯酶基因的克隆与表达
到目前为止，已经有多个阿魏酸酯酶编码基因
获得克隆并进行了外源表达。例如，Moukouli［14］克
隆了尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中的阿魏酸
酯酶基因 FoFaeC-12213，并测定了其序列。通过与
NCBI 数据库进行同源性分析后，发现该基因与已
报道的 C 型阿魏酸酯酶有较高的相似性。Koseki［15］
在米曲霉（Aspergillus oryzae）里面克隆出 2 种不同
类别的阿魏酸酯酶 AoFaeB 和 AoFaeC，通过对其
序列分析以及底物特异性研究，证实所分离的阿魏
酸酯酶分别属于 B 型和 C 型。此外，克隆表达的
2012年第9期 37陈静等 ：阿魏酸酯酶基因工程菌研究进展
基因 AoFaeB 能在 pH 范围 3-11 内保持稳定，且在
pH<3 的酸性环境下仍保持很稳定。除了丝状真菌
外，细菌阿魏酸酯酶基因也成功获得克隆，如李佳
宝等［16］从 Cellulosilyticum ruminicola中克隆了 3 种
阿魏酸酯酶，并对各种酶的作用特性如最适温度、
pH 和底物特异性进行了相关研究。Topakas 等［17］
克隆了 Myceliophthora thermophila的阿魏酸酯酶基
因并在 P. pastoris X-33 中得到表达，并利用 HH 3D
技术服务器模拟了该酶的 3D 模型。Kofi［18］克隆了
泉生热袍菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）基
因 TTE1809 并在大肠杆菌成功表达，结果发现重组
TtFAE 在高温 80℃下活性可持续 80 min。
从表达系统方面来看，对阿魏酸酯酶的外源表
达系统主要集中在 E. coli表达系统和 P. pastoris表达
系统。其中大肠杆菌系统是最经典也是最简单的高
效表达体系，但是它缺少真核基因的表达所必须的
细胞翻译后的修饰，往往不能折叠形成正确功能的
蛋白质，容易在细胞内部形成无活性的包涵体。这
些缺陷大大限制了大肠杆菌系统的应用。毕赤酵母
系统是真核微生物表达系统，它具备生长速度快，
营养简单及具有使外源蛋白正确修饰体系的特点，
而且具有操作方便，生产成本低的优点，因此许多
酶制剂均采用该表达体系进行外源基因的表达。近
几年随着丝状真菌转化和表达体系的不断深入研究，
已经有采用黑曲霉、巴西青霉和泡盛曲霉为外源基
因的宿主对外源基因进行表达的报道［19-21］。
Blum 等［3］已经利用大肠杆菌作为受体成功
表达了热纤梭菌的阿魏酸酯酶，并对其酶学特性
和酶的空间结构进行了研究。研究发现热线梭菌
产的阿魏酸酯酶空间结构与已报道的黑曲霉 FAEA
的 FAE-III 结构高度相似。Sang［22］克隆了阿魏酸
酯酶基因 estF27，并在大肠杆菌 BL21 中成功表达，
该酶在 pH6.8 和 40℃表现出较高的活性，并且在
pH5.0-10.0范围内表现出极强的稳定性。Fazary等［23］
克隆了泡盛曲霉（Aspergillus awamori）的阿魏酸酯
酶基因并将其在大肠杆菌进行了表达。Record 等［24］
在大肠杆菌中表达了阿魏酸酯酶，发现表达量仅为
黑曲霉中的 1/10。这是由于 FAE 在大肠杆菌内表达
后不能形成正确空间折叠的蛋白，仍需筛选、重新
折叠已表达的蛋白［25］。
张帅兵等［26］利用实验室保藏的黑曲霉菌株
（Aspergillus niger CIB-423. 1）， 通 过 RT-PCR 技 术
克隆了编码阿魏酸酯酶 A 的 cDNA，并在毕赤酵母
GS115 中进行了外分泌表达。Valeri［27］克隆了构巢
曲霉的阿魏酸酯酶基因 fae-I 并在 P. pastoris中得到
了高效表达。Moukouli［14］克隆了阿魏酸酯酶 FoFaeC
的基因，并在宿主细胞 P. pastoris中表达，结果显示，
用甲醇诱导表达的重组蛋白的酶活比原酶高 7 倍多，
其最适 pH 和最适温度分别是 6℃和 65℃。Dominic
等［28］利用毕赤酵母表达载体把黑曲霉的 fae 基因导
入啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，阿魏酸
酯酶得到了有效表达，在培养基中分泌的酶量为 2
mg/L，经纯化酶活达 8 200 U/μg，以柳枝稷为底物
测得最适 pH6-7，最适温度是 50℃。尽管毕赤酵母
表达体系是真菌类阿魏酸酯酶的良好表达体系，但
是毕赤酵母仍然存在代时长，需要甲醇诱导等缺点，
所以构建新的适应性强、生产能力强、能大规模应
用工业化生产的宿主和表达体系是今后研究的重点
和方向。
另外，有一些真菌自身就能分泌表达阿魏酸酯
酶，因此也可直接用丝状真菌作为表达宿主体系。
由于大多数阿魏酸酯酶都是曲霉属微生物产生的，
因此利用曲霉作为表达体系更接近于菌体本身。如
Knoshaug 等［20］将青霉的阿魏酸酯酶基因导入到泡
盛曲霉中，并对重组表达的阿魏酸酯酶在降解玉米
秸秆方面进行了研究，发现重组阿魏酸酯酶能明显
加快玉米秸秆的降解速率，并且具有良好的热稳定
性。Record 等［24］以黑曲霉为受体菌，对重组 FAEB
进行同源高效表达，并根据其耐高温性质进行制浆
应用研究发现，FAEB 在经过 2 h 的高温处理后其酶
活力减少程度低于 10%，这使得重组 FAEB 能满足
造纸工业应用的要求。
3 阿魏酸酯酶与其他酶的协同作用的研究
近几年，关于植物细胞壁水解酶的协同作用研
究主要集中在纤维素酶与半纤维素酶、木质素酶、
脂肪酶或淀粉酶协同方面，以期提高其酶解效率。
关于阿魏酸酯酶与纤维素酶以及协同作用的研究比
较少，曾薇和陈洪章［29］在研究阿魏酸酯酶和纤维
素酶在水解汽爆稻草的协同作用中发现，阿魏酸酯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期38
酶和纤维素酶同时作用时，阿魏酸酯酶对纤维素酶
解的促进作用并不是两种酶单独作用效果的简单叠
加，而是二者在酶解过程中相互促进的协同作用。
Yu 等［30］在研究纤维素酶水解燕麦麸制备低聚糖时
发现，当添加阿魏酸酯酶后，还原糖产率有较大地
提高。
目前对阿魏酸酯酶与木聚糖酶的协同作用的研
究较为成熟，尤其是关于黑曲霉阿魏酸酯酶的研究。
Faulds 等［31］研究发现，黑曲霉阿魏酸酯酶 AnFaA
在降解麦麸的过程中，单独用 AnFaeB 作用麸皮时，
仅仅检测到少量的阿魏酸，而加入木聚糖酶后，阿
魏酸的含量具有明显增强的趋势。此外，黑曲霉和
其他丝状真菌所产的木聚糖酶也具有良好的协同作
用。例如，FaeA 在与里氏木霉（Trichoderma reesei）
分泌的木聚糖酶共同作用的时候，降解麦秆的效率
比单独使用阿魏酸酯酶的效率有明显提高［32］。这些
研究充分表明阿魏酸酯酶和内切木聚糖酶在处理半
纤维素底物时具有良好的协同促进作用。
在其他丝状真菌中发现的阿魏酸酯酶等脱支酶
和木聚糖酶也具有相同的协同作用，如 Yudmil 等［33］
在研究微生物半纤维素酶系对不同底物处理时发现，
同时使用乙酰木聚糖酶、阿魏酸酯酶和 ρ-茴香豆
酸酯酶能大大增强了木聚糖酶的降解活性。李夏兰
等［34］对桔青霉分泌的阿魏酸酯酶对麦槽的降解进
行了研究发现，在纯化的 FAE（5 U/g 麦糟）中，不
加木聚糖酶时，其阿魏酸量的释放量为 7.2%，当加
木聚糖酶时，阿魏酸的释放量能达 21.9%，是单独
处理的 3 倍多，这充分说明木聚糖酶和阿魏酯酶对
阿魏酸的释放具有协同促进作用。Topakas 等［35］在
研究尖孢镰刀菌的阿魏酸酯酶时，也发现该酶具有
协同作用。它能和嗜热侧孢霉分泌的木聚糖酶起到
协同作用。在利用去淀粉麦麸作底物时，阿魏酸酯
酶 FAE-II（1.5 mU/20 mg 麦麸）不加木聚糖酶的情
况下，作用 1 h 也没有检测到阿魏酸的释放，但是
如果同时加入 10 U 木聚糖酶时，作用 1 h 则能检测
到阿魏酸的释放，释放的阿魏酸最大含量是 19%，
而对应的不加木聚糖的底物中没有检测到阿魏酸。
在细菌所产的阿魏酸酯酶中也具有与真菌类
似的相互协同作用。例如，王小坤等［36］研究嗜酸
乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）阿魏酸酯酶在降
解麸皮中的作用时发现 ：向经纯化的阿魏酸酯酶
中加入木聚糖酶或者 α-L-阿拉伯呋喃糖酶作用于麸
皮，阿魏酸的释放量从 0 增加至 12.4 nmol 或 3.64
nmol。当 3 种酶同时作用时阿魏酸的释放量增至
15.7 nmol，说明木聚糖酶在协同作用中起主要作用，
α-L-阿拉伯呋喃糖酶起辅助作用。Kofi［18］克隆并表
达的泉生热袍菌 TtFAE 与木聚糖酶在降解黑小麦
麸皮过程表现出了协同性。李佳宝等［16］发现利用
Cellulosilyticum ruminicola分泌的阿魏酸酯酶 FAE-I
与 FAE-II 降解玉米时能够增强木聚糖酶的活性，这
暗示两种酶具有协同促进效应。
4 展望
阿魏酸酯酶特定的降解作用使其在食品、药品、
饲料、造纸等行业有着巨大的应用潜能。目前已经
分离纯化了多种阿魏酸酯酶，并对它们的理化性质、
空间结构、基因序列相似性、作用机理等作了部分
研究。不同菌株产生的阿魏酸酯酶，不论是性质还
是作用差别都比较大，不容易应用。尽管利用基因
克隆策略构建了部分重组工程菌株，但是成功应用
于工业生产的较少。从目前看，还需要进一步通过
筛选和诱变获得高产菌株，开发新的受体细胞，从
而满足生产实践的需求。由于在食品、药品、化妆
品等行业对该酶的安全性要求较高，因此有关产酶
微生物的安全性能还需研究和确定。阿魏酸酯酶具
有广阔的应用前景，但是离商品应用还有一段很长
的距离，仍需要对阿魏酸酯酶进行深入地研究。
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（责任编辑 狄艳红）