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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):116-121
芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属多年
生宿根草本花卉［1］。经过长期的系统演化，芍药种
子形成了独特的上下胚轴双重休眠特性，表现为秋
季降温时下胚轴伸长，长出胚根，经过冬季低温后
上胚轴休眠被破除，春季升温后胚芽出土萌发，严
重影响其实用观赏价值［2］。目前关于芍药种子休眠
机理的研究仅集中于生理层面，这种特殊的双重休
眠分子机理仍不清楚。同时，下胚轴休眠是芍药种
子休眠的第一步，研究下胚轴休眠机理可以为进一
步研究上胚轴休眠奠定基础。因此，研究种子下胚
轴休眠分子机理，挖掘调控种子下胚轴休眠相关的
基因对芍药种子休眠分子机理进行探讨具有重要的
理论和实际意义。
cDNA-AFLP 技术是近年来发展起来的一种重
收稿日期 ：2014-09-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31240028，31470696）
作者简介 ：孙晓梅，女，博士，教授，研究方向 ：园林植物遗传育种 ；E-mail ：xiaomei7280@126.com
芍药种子下胚轴休眠相关基因的 cDNA-AFLP 分析
孙晓梅  韩宁宁  杨宏光  杨盼盼
（沈阳农业大学林学院，沈阳 110866）
摘 要 ： 旨在探讨芍药种子下胚轴的休眠机理，采用 cDNA-AFLP 技术对层积 0 d 和根部露白两个时期的芍药种子进行基因
差异表达分析。利用 256 对引物组合进行扩增，筛选获得 3 600 个差异表达转录衍生片段（TDFs），成功回收到 1 200 个 TDFs，选
取 500 个 TDFs 对其克隆测序，共得到 42 个有效序列。经 BLAST 比对发现，其中 30 个 TDFs 与已知功能基因同源，分别参与芍药
种子下胚轴休眠过程中的基因表达调控、信号转导、逆境胁迫、物质与能量代谢等过程，9 个 TDFs 与功能未知基因及假想蛋白同源，
另有 3 个 TDFs 为无同源序列，可能是新的未知基因，这些基因有助于更好地阐明芍药种子下胚轴休眠机理。
关键词 ： 芍药 ；种子 ；下胚轴 ；休眠 ；cDNA-AFLP ；差异表达基因
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.018
cDNA-AFLP Analysis of Dormancy-related Genes in Seed Hypocotyl of
Paeonia lactiflora
Sun Xiaomei Han Ningning Yang Hongguang Yang Panpan
（College of Forestry，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866）
Abstract: To explore the dormancy mechanism of seed hypocotyl of Paeonia lactiflora and isolate dormancy-related genes from P.
lactiflora, a cDNA-AFLP technology was used to identify differentially expressed genes between the stages of seeds with stratification for 0 d and
germination. A total of 3 600 differentially expressed transcript-derived fragments（TDFs）were screened by selective PCR amplification using
256 primer combinations, and 1 200 TDFs were recovered successfully. Then selected 500 TDFs were cloned and sequenced, and 42 effective
sequences were obtained. Bioinformatics analysis with BLAST showed that 30 TDFs were homologous to the known functional genes, which
involved in gene expression regulation, signal transduction, stress responding, material and energy metabolism etc. during the dormancy of seed
hypocotyl of P. lactiflora. Nine TDFs were similar to genes of unknown functions and hypothetical proteins, and another 3 TDFs had no sequence
homology to GenBank entries and might be new unknown genes, which could help us to clarify the mechanism of seed hypocotyl dormancy of P.
lactiflora.
Key words: Paeonia lactiflora ；seed ；hypocotyl ；dormancy ；cDNA-AFLP ；differentially expressed gene
2015,31(6) 117孙晓梅等：芍药种子下胚轴休眠相关基因的 cDNA-AFLP 分析
要的转录基因组学研究工具［3］，因其可靠性高，重
复性好，且不需要预先知道序列信息，所需仪器设
备简单，被广泛应用于目标性状形成相关的基因分
离和鉴定。周志钦［4］利用 cDNA-AFLP 技术对马铃
薯块茎从休眠到发芽整个生理过程中差异表达的基
因进行分析，初步确定了其主要差异表达基因及其
表达的模式。 Juana 等［5］筛选到 201 个与拟南芥种
子萌发相关的差异表达转录衍生片段（differentially
expressed transcript-derived fragments，TDFs）， 对 其
中 48 个克隆测序，有 35 个片段在 GenBank 数据库
中发现同源序列，剩余的功能未知。罗静等［6］利
用该技术获得 32 个与已知芽休眠解除高度同源的
TDFs，差异表达的基因功能主要涉及代谢、逆境响
应、细胞分化及信号转导。
本实验通过 cDNA-AFLP 技术对芍药种子下胚
轴休眠相关的差异表达基因进行分析，获得与该性
状形成相关基因的序列信息，筛选与芍药种子下胚
轴休眠相关的基因，旨在为揭示芍药种子休眠分子
机理提供理论依据，进而促进芍药产业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用芍药种子于 2013 年 8 月下旬从沈阳农业
大学植物园收获，为芍药品种中的‘粉玉奴’（‘Fen
Yu Nu’）作母本与‘粉中楼’（‘Fen Zhong Lou’）作
父本的杂交种子，千粒重为 233.54 g。
选取层积 0 d 和根部露白两个时期的芍药种子
去除种皮，用无菌刀片切成薄片，锡纸包裹后于液
氮中速冻，-80℃下保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 芍药种子
总 RNA 的提取采用北京 TIANGEN 公司的 RNAprep
pure Plant Kit，并参照其说明书进行，其总 RNA 的
纯度、浓度及完整性采用 ES-2 型微量紫外可见吸
光 - 荧光光度计和 1.2% 琼脂糖凝胶电泳进行测定 ；
双链 cDNA 采用大连 TaKaRa 公司的 M-MLV RTase
cDNA Synthesis Kit 并参照说明书合成，其浓度采用
1.0% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.2 cDNA-AFLP 分 析 cDNA-AFLP 分 析 参 考
Vuylsteke 的方法进行［7］。双链 cDNA 用 EcoR Ⅰ和
Mse Ⅰ酶切后连接接头，连接产物稀释 10 倍用于预
扩增，将预扩增产物稀释 10 倍，取 5 μL 作为选择
性扩增的模板，采用 256 对引物组合对两个时期的
芍药种子进行了 cDNA-AFLP 差异表达分析，扩增
产物经 6% 的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，银染检测。
接头和引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成，
引物序列见表 1。
表 1 接头和引物序列
引物 序列 序列
接头 AP1 5-CTCGTAGACTGCGATCC-3 AP2 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
AP3 3-CATCTGACGCATGGTTAA-5 AP4 3-TACTCAGGACTCAT-5
预扩增 E00 5-GACTGCGTACCAATTC-3 M00 5-GATGAGTCCTGAGTAA-3
选择性扩增 E-NN 5-GACTGCGTACCAATTCNN-3 M-NN 5-GATGAGTCCTGAGTAANN-3
注 ：其中 AP 代表接头 ；E00 和 M00 为预扩增的引物 ；E-NN 和 M-NN（NN 表示两个任意碱基）为选择性扩增的引物
1.2.3 差异片段的回收、克隆及序列测定 用灭菌
刀片将差异片段切下，放入离心管中，加入 40 μL
灭菌双蒸水，95℃水浴 30 min，15℃ 12 000 r/min 离
心 10 min。取 5 μL 上清液作模板，用相应的选扩引
物来进行二次扩增。PCR 反应程序为 ：94℃ 3 min ；
94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环 ；72℃
7 min。 经 1.2% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离、 回 收 和
纯化。将目的片段连接到 pGM-T 载体上，转化到大
肠杆菌中，选取经过检测为阳性克隆的菌液，进行
测序。
1.2.4 序 列 分 析 对 所 得 的 序 列 在 NCBI 应 用
BLAST 程序进行同源性比对分析，预测其功能，筛
选出与芍药种子下胚轴休眠相关的基因。
2 结果
2.1 cDNA-AFLP分析
利用 256 对 EcoR Ⅰ和 Mse Ⅰ引物组合对层积 0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6118
d 和根部露白两个时期的芍药种子 cDNA 进行选择
性扩增，均得到较好的扩增效果，表明 cDNA-AFLP
分析技术对芍药差异表达基因的筛选是一种相对有
效的方法。共得到 9 595 个可以分辨的差异条带，
平均每对引物扩增出 37 个 TDFs，片段大小分布在
100-1 000 bp 之间，其中小于 100 bp 的片段忽略不
计，共得到 1 200 个片段。部分选择性扩增产物聚
丙烯酰胺凝胶电泳结果（图 1）显示，两个时期的
芍药种子的条带大部分相同，有差异的条带较少。
条带包含 4 种类型 ：Ⅰ类为在对照和露白中均有条
带，约占 60%，是维持芍药正常生长发育必需的基
因 ；Ⅱ类仅在对照中出现条带，约占 4%，是导致休
眠的基因，Ⅲ类仅在露白出现条带，约占 5%，是促
进萌发的基因，为特有的差异片段，Ⅱ类和Ⅲ类是
由于不同时期种子存在背景的差异 ；Ⅳ类在对照和
露白中都没有条带，约占 2%，可能是引物的原因。
达序列，需进一步分析验证。本研究得到的 30 个
TDFs 可能成为与下胚轴休眠相关的候选基因，功能
涉及代谢、逆境响应、细胞分化及信号转导等（图 2）。
3 讨论
休眠是植物的一种天然特性，也可视为是对环
境的一种适应性，用休眠的方式来避免不宜环境的
影响，直到环境条件适合后代存活时再启动萌发，
为植物的后续生长奠定基础，然而种子休眠过程中
分子机制极为复杂，打破种子休眠而萌发的分子机
制目前尚未明确。本实验以具有下胚轴休眠的芍药
种子为试材，通过 cDNA-AFLP 差异分析对芍药种
子休眠的分子机制进行基础性研究。实验结果表明，
30 个差异序列对应蛋白质编码基因，其余 12 个差
异序列中有 9 个与微卫星、转座子表现出显著的差
异性，有 3 个与任何基因库都不同源。许多与转座
子相似，或具有重复序列的特点。转座子和未知序
列在种子休眠萌发过程中表达量很高。
种子下胚轴休眠过程中，基因表达、酶活性及
激素积累方面均有不同，同时通过信号转导系统传
递信号，启动相关基因的表达，开启相关代谢途径。
TDF6 编码的蛋白质与肌醇半乳糖苷酶同源，参与植
物体内的基础代谢，该酶的主要功能是合成棉子糖
家族寡糖（RFOs）。在低温胁迫时，RFOs 会迅速增
加，提高体内的糖含量，改变细胞的渗透压，增强
种子对休眠的适应性［8］。参与淀粉合成的 ADP-葡
萄糖焦磷酸化酶（TDF36）无明显变化。TDF16 编
码的蛋白与半胱氨酸蛋白酶同源，半胱氨酸蛋白酶
可以降解底物中的天冬氨酸残基，可以调控植物的
程序性细胞死亡（PCD）活性，与植物休眠相关［9］。
有报道表明，植物处于休眠时，由于活性氧的原因，
导致无功能蛋白质的积累，需要利用泛素化过程及
时处理这些蛋白［10］。泛素结合酶 E2（TDF25）参与
植物蛋白降解途径，泛素化的蛋白能被 26S 蛋白酶
体降解，释放的泛素，再循环利用。热激蛋白（HSP）
与植物休眠之间存在一定的关系。热激蛋白又称热
休克蛋白（TDF13），不仅在热刺激条件下表达［11］，
在种子的萌发期也有相应的 HSP 表达。热激诱导的
HSP70 在休眠阶段富集打破休眠，使其萌发。F-box
蛋白（TDF17）在生长素的信号传导、生长发育以
C
D
III㊫
II㊫
IV㊫I㊫AB
从左至右 ：每两个泳道为同一对引物。每两个泳道从左至右依次为 ：对照、
根部露白。A 和 B 分别为对照、根部露白的起始泳道 ；C 和 D 分别为对照、
根部露白的终止泳道
图 1 部分选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶图谱
2.2 序列比对与功能分析
为了探索芍药种子下胚轴休眠的分子机理，对
部分差异片段进行测序与功能预测。从 1 200 个差
异片段中选取 500 个 TDFs 进行回收、克隆测序，
得到 42 个有效序列。表 2 为差异序列同源检索结果。
经 BLAST 比对显示，30 个（72%）TDFs 与已
知功能基因同源，9 个（21%）TDFs 与功能未知基
因及假想蛋白同源，其余 3 个（7%）TDFs 未检索
到相似序列或可信度太低，可能是未知基因的表
2015,31(6) 119孙晓梅等：芍药种子下胚轴休眠相关基因的 cDNA-AFLP 分析
及对生物钟节律的调节等许多传导途径中发挥作用。
信号转导包括从接收到休眠信号到各个基因表达的
整个级联反应，是植物休眠分子机制的重要组成部
分。在生长素依赖的方式中，F-box 蛋白生长素受体
同 Aux/IAA 阻遏物相互作用［12］。线粒体磷酸转移子
（TDF5）是位于线粒体内膜上的转运子［13］，与许多
表 2 差异片段的序列比对结果
编号 登录号 同源性 基因来源 E 值 长度 /bp
TDF1 XM_002522545.1 endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein（putative） Ricinus communis 4e-54 224
TDF2 XM_007209764.1 hypothetical protein Prunus persica 8e-17 245
TDF3 JX020418.1 microsatellite（GATA291） Bellamya aeruginosa 0.62 198
TDF4 XM_004136902.1 no homology - - -
TDF5 JX500324.1 phosphoglycerate kinase Hippobroma longiflora 3e-18 214
TDF6 FJ607306.1 galactinol synthase Medicago falcata 2e-17 399
TDF7 NM_123430.1 succinate dehydrogenase［ubiquinone］iron-sulfur subunit 2 Arabidopsis thaliana 1e-25 295
TDF8 XM_002272228.2 homeobox- leucine zipper protein Vitis vinifera 5e-10 365
TDF9 FJ906844.1 proteinase inhibitor Jatropha curcas 2e-08 172
TDF10 FQ382074.1 clone SS0ABG73YC18 Vitis vinifera 2e-88 180
TDF11 XM_002512632.1 Transaldolase（putative） Ricinus communis 1e-70 265
TDF12 XM_002270807.2 transcription factor GTE8 Vitis vinifera 8e-13 356
TDF13 X15333.1 heat-shock protein Oxybasis rubra 1e-19 257
TDF14 XM_007014114.1 xyloglucan endotransglycosylase 6 Theobroma cacao 5e-11 249
TDF15 JX020371.1 microsatellite（GATA201） Bellamya aeruginosa 0.18 163
TDF16 XM_007044822.1 cysteine proteinases superfamily protein Theobroma cacao 3e-36 204
TDF17 XM_007019026.1 F-box protein Theobroma cacao 1e-23 316
TDF18 JX019663.1 microsatellite（CAG524） Bellamya aeruginosa 1.5 234
TDF19 XM_007009677.1 ATP synthase D chain，mitochondrial Theobroma cacao 1e-25 480
TDF20 XM_007024759.1 serine and sphingolipid biosynthesis protein isoform 1 Theobroma cacao 1e-24 312
TDF21 EF520862.1 Adh1a Paeonia rockii 3e-18 179
TDF22 XM_002303806.2 hypothetical protein Populus trichocarpa 4e-39 258
TDF23 BT133582.1 unknown Medicago truncatula 4e-30 154
TDF24 XM_007031302.1 zinc finger family protein Theobroma cacao 6e-05 402
TDF25 XM_007036095.1 ubiquitin-conjugating enzyme E2 Theobroma cacao 0.020 289
TDF26 XM_006387722.1 hypothetical protein Populus trichocarpa 1e-41 152
TDF27 EF145588.1 unknown Populus trichocarpa 2e-15 201
TDF28 BT142855.1 unknown Lotus japonicus 9e-14 189
TDF29 XM_007137762.1 hypothetical protein Phaseolus vulgaris 0.067 223
TDF30 AB839181.1 ATP-binding cassette transporter subfamily A Acacia mangium 0.030 288
TDF31 XM_002321400.2 NADH-dependent glutamate synthase family protein Populus trichocarpa 2e-42 175
TDF32 JN555977.1 microsatellite（clone TXH345） Bellamya aeruginosa 0.041 192
TDF33 AJ430199.1 chloroplast atpE gene Paeonia veitchii 2e-31 333
TDF34 AY436773.1 senescence-associated protein（putative） Pyrus communis 2e-121 401
TDF35 AM478102.2 hypothetical protein Vitis vinifera 3e-27 210
TDF36 AY685672.1 ADP-glucose pyrophosphorylase Gossypium arboreum 4e-13 267
TDF37 DQ629463.1 small subunit rRNA Cinnamomum camphora 1e-20 252
TDF38 XM_002276202.2 no homology - - -
TDF39 XM_007010032.1 UDP-Glycosyltransferase superfamily protein isoform 5 Theobroma cacao 0.048 344
TDF40 XM_006474355.1 galactinol-sucrose galactosyltransferase 6 Citrus sinensis 1e-64 320
TDF41 XM_004162091.1 no homology - - -
TDF42 JX018946.1 microsatellite（clone TC104） Bellamya aeruginosa 0.13 183
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6120
重要的机体活动息息相关，影响植物的生长、发育
及性状，参与酶代谢、物质合成及转运。在植物解
除休眠过程中，表达量明显升高，促进 ATP 的合
成，提高植物体内 ATP/ADP 的比值，从而使解除休
眠过程中所需的相关蛋白大量合成，彻底打破休眠。
木葡聚糖基转移酶（TDF14）通过催化转糖苷，调
节细胞壁的弹性和延展性来影响植物的生长发育功
能［14］。TDF24 与锌指蛋白同源，是一类能够调控基
因表达的转录因子［15］。锌指蛋白与基因表达调控、
细胞分化、胚发育等密切相关，主要与核酸相互作用，
通过调控靶基因的表达与基因结合来调节种胚发育，
使其萌发。UDP-糖基转移酶（TDF39）广泛存在于
植物体中，将活性糖基从核苷糖转移到植物激素分
子上［16］。种子休眠过程中，该酶是细胞维持代谢平
衡的主要酶之一，参与信号的转导，对打破休眠维
持正常的生长发育具有重要作用。
部分分离的序列也未与公共数据库的序列表现
出相似性。实验中发现一些新序列，都具有唯一性。
在种子休眠过程中，许多转座子有助于新序列的
注释和调控机理分析。这一结果说明，虽然芍药种
子下胚轴的休眠是对其生长发育生命周期中一个相
对静止的时期，但整个过程均有不同类型的基因参
与表达。从这一多样性上可以看出芍药种子休眠在
分子水平上的复杂性，同时也在分子方面为前面提
到的众多因子影响芍药种子下胚轴休眠提供了理论
依据。
本实验是根据 BLAST 比对得到的同源序列，对
可能与下胚轴休眠相关的 TDFs 进行初步功能预测，
后续的研究是将得到的相关序列通过 RACE 技术，
获得目的基因全长，并进一步利用原核表达的方法
进行功能验证，为芍药种子下胚轴休眠分子机理最
终阐明奠定理论基础。
4 结论
利用 cDNA-AFLP 技术对芍药种子休眠时期的
基因表达谱进行分析，分离出 30 个与下胚轴休眠相
关的差异片段，对其进行克隆测序及功能预测，涉
及基因表达调控、能量代谢、逆境响应、信号转导
等方面。
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สഐ䈳᧗㺘䗮 Gene expression regulation㜭䟿ԓ䉒 Energy metabolism䘶ຳ㛱䘛৽ᓄ Stress responding⢙䍘ԓ䉒 Nutrient metabolismᯠ䱥ԓ䉒 Metabolismؑਧ䖜ሬ Signaltran sduction
DNA৺㳻ⲭ࣏㜭䈳᧗ DNA and protein function
微卫星序列 Microsatellite
未知功能 Unknown
无同源性 Nohomology
10%5% 5%
7%
12%
14%
7%7%
21%
12%
图 2 芍药种子下胚轴休眠差异表达基因的功能分析
2015,31(6) 121孙晓梅等：芍药种子下胚轴休眠相关基因的 cDNA-AFLP 分析
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（责任编辑 马鑫）