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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
Hg2+ 是毒性最强的重金属污染物之一。近年来，
含汞工业废水的排放使其广泛分布于水体环境中。
它在生物物质循环和能量交换中难以被降解，并能
够通过食物链的生物放大作用，对人体健康产生威
胁，过度的 Hg2+ 暴露会引起脑部、肾脏损伤及多种
认知和行动的紊乱［1］。因此，建立新型高灵敏、高
选择性的 Hg2+ 检测方法对于汞污染的预防和管理具
有重要的意义。Hg2+ 的荧光检测方法因其操作简单、
收稿日期 ：2013-02-17
基金项目 ：上海海洋大学博士启动基金项目（A-2400-10-0129），上海自然科学基金项目（11ZR1415400）
作者简介 ：吴继魁，博士，讲师，研究方向 ：生物传感器 ；E-mail ：jkwu@shou.edu.cn
一种基于汞特异性 DNA 和 SYBR GREEN I 荧光检测
Hg2+ 方法的建立
吴继魁1 卫碧文2 林莉2 毛芳1 周冬香1 熊振海1
（1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306 ；2. 上海出入境检验检疫局，上海 200135）
摘 要 ： 以富含胸腺嘧啶（thymine）的 Hg2+ 特异性 DNA 为识别元件，利用 SYBR GREEN I 分子光“开关”的特性，建立
了一种高灵敏、高选择性荧光均相检测 Hg2+ 的新方法。该检测体系由两条非标记、含有 5 个 thymine-thymine（T-T）错配碱基对的
DNA 探针组成。T-T 错配使两条 DNA 探针以单链形式存在于溶液中，而 Hg2+ 通过 T-Hg2+-T 配位作用可以与两条 DNA 探针结合并
形成稳定的双链结构。在优化条件下，荧光强度与 Hg2+ 浓度在 0-100 nmol/L 范围呈线性，检测限为 2 nmol/L（S/N=3），而其他金
属离子也不会对 Hg2+ 检测造成干扰。该方法简单快速，有望应用于水体中 Hg2+ 的检测。
关键词 ： Hg2+ DNA 探针 荧光检测 SYBR GREEN I
Highly Sensitive and Selective Detection of Hg2+ in Aqueous
Solution with Mercury-specific DNA and SYBR GREEN I
Wu Jikui1 Wei Biwen2 Lin Li2 Mao Fang1 Zhou Dongxiang1 Xiong Zhenhai1
（1. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306 ；2. Shanghai Entry-Exit Inspection and
Quarantine Bureau，Shanghai 200135）
Abstract: A novel “signal-on” assay for sensitive and selective detection of Hg2+ in aqueous solution based on mercury-specific DNA and
a molecular light switch complex, SYBR GREEN I, was reported in the present work. This Hg2+ specific sensor system composed of two label-
free DNA probes with five T-T mis-matches, which could form stable DNA duplexes by thymine-Hg2+-thymine（T-Hg2+-T）in the presence of
Hg2+. The fluorescence of SYBR GREEN I is weak in aqueous solution, and significant fluorescence can be observed when intercalating into
DNA duplexes. By monitoring Hg2+-dependent fluorescence intensity enhancement, highly sensitive and selective determination of Hg2+ has been
achieved. Under the optimum conditions, the fluorescence intensity was proportional to the concentration of Hg2+ in the range of 5-100 nmol/L.
A detection limit of 2 nmol/L Hg2+ was achieved. The presence of other metal ions did not interfere with the detection of Hg2+. This approach is
simple and rapid, which can be used to monitor the Hg2+ concentration in drinking water.
Key words: Hg2+ DNA probe Fluorimetry SYBR GREEN I
灵敏度高以及适于野外现场分析等优点而备受人们
瞩目［2，3］。近年来，基于有机小分子［4-7］、纳米粒
子［8-10］、共轭聚合物［11］、脱氧核酶［12］和蛋白质［13］
等建立的 Hg2+ 荧光检测新方法相继被报道，但是这
些方法仍存在响应速度慢、选择性不高等缺点。
最近，Ono［14］小组发现 Hg2+ 能够与含有胸腺嘧
啶（thymine，T）的两条单链 DNA 结合形成稳定的
双螺旋结构，并且 T-T 对 Hg2+ 具有较高的选择性识
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期222
别。因此，T-Hg2+-T 配位化学已成为近年来构建荧
光检测 Hg2+ 新方法的研究热点［15，16］。目前，大多
数的方法采用荧光双标记，操作复杂，成本高［17， 18］。
本研究拟以两条非标记、含有 5 个 thymine-thymine
（T-T）错配碱基对的 DNA（9 bp）探针为识别元件，
利用 SYBR GREEN I（SG）分子光“开关”的特性，
建立一种简单快速、高灵敏、高选择性荧光均相检
测 Hg2+ 的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 DNA 探针 1（5-CTCTTTCTC-3）
和 DNA 探针 2（5-GTGTTTGTG-3）均由上海生工
生物技术有限公司定制合成。羟乙基哌嗪乙硫磺酸
（HEPES） 和 SYBR GREEN I 购 自 Sigma-Aldrich 公
司。SYBR GREEN I 工作液（100×）用超纯水稀释
SYBR GREEN I（10 000×） 制 得，SYBR GREEN I
工 作 液 浓 度 约 为 2.03×10-4 mol/L［19］。Hg （NO3） 2、
其他金属盐及化学试剂购自上海国药集团化学试剂
有限公司。
荧光光谱仪（F4600，日本日立）；圆二色光谱
仪（J-810，日本佳司科）；超纯水仪（美国密理博）。
1.2 方法
1.2.1 Hg2+ 的检测 在含有 6.6×10-8 mol/L DNA 探
针 1、2 的 10 mmol/L HEPES（pH7.4，100 mmol/L
NaNO3）缓冲溶液中，加入不同浓度的 Hg
2+，室温
放置 3 min ；然后再向上述溶液中加入 1 μL 的 SYBR
GREEN I（100×），混合溶液的最终体积为 1.5 mL。
该混合溶液孵育 2 min 后，利用 F4600 荧光光谱仪
在 510-650 nm 范围内扫描上述混合溶液的荧光光
谱，激发和发射狭缝宽度均为 5 nm，SYBR GREEN
I 的激发波长设定为 475 nm。利用 523 nm 处的荧光
强度进行定量分析。
1.2.2 圆二色（CD） 光谱检测 在含有 2.0×10-6
mol/L DNA 探 针 1、2 的 10 mmol/L HEPES（pH7.4，
100 mmol/L NaNO3） 缓 冲 溶 液 中， 加 入 1.0×10
-5
mol/L Hg2+，室温放置 5 min。然后对上述混合溶液
在 Hg2+ 加入前后用 1 cm 比色皿在 250-350 nm 范围
内测定圆二色光谱，平均扫描 3 次。
2 结果与分析
2.1 Hg2+检测体系的工作原理
Hg2+ 检测体系的工作原理，如图 1 所示。两种
单链 DNA 探针（探针 1 和探针 2）链长为 9 个碱
基，其中含有有 5 个 T-T 错配，而两者 3’、5’ 端
的碱基完全互补。在没有 Hg2+ 存在时，由于这两条
DNA 链的熔链温度（14.1℃）比室温低［10］，所以在
室温下两者不能形成 DNA 双链，以单链形式存在
于溶液中。SG 与单链 DNA 的结合较弱，整个检测
体系呈现出较弱的荧光信号。当 Hg2+ 存在时，两条
DNA 探针中 T-T 错配部分由于可以和 Hg2+ 作用形成
T-Hg2+-T 碱基对，使两条 DNA 探针能够形成稳定的
双链结构。SG 嵌入双链 DNA 的双螺旋结构中，在
523 nm 处释放出较强荧光信号。利用检测体系在该
波长处的荧光强度变化可以实现 Hg2+ 的定量检测。
为验证上述 Hg2+ 检测体系的可行性，对 SG、
SG + DNA 探 针 1、2 混 合 物、SG + DNA 探 针 1、2
混合物 + Hg2+ 3 个溶液的荧光强度进行了比较研究，
如图 2 所示。当只有 SG 存在时，溶液的荧光信号很
弱（曲线 a）；当 SG 和 DNA 探针 1、2 混合物共存
时，SG 通过静电相互作用与单链 DNA 结合，释放
出比单独 SG 稍强的荧光信号（曲线 b）；而 SG 、
DNA 探针 1、2 混合物和 Hg2+ 三者的混合溶液释放
的荧光信号强度约为 SG 和 DNA 探针 1、2 混合物
溶液的 10 倍（曲线 c）。此结果表明，Hg2+ 的存在
确实促进了 DNA 双链的形成，SG
与 DNA 双链的嵌插作用才释放出强的荧光信
号。为进一步验证 T-Hg2+-T 配合物形成引起的 DNA
探针单、双链构象改变，对 DNA 探针 1、2 混合物
加入 Hg2+ 前后的圆二色光谱进行了考察，如图 3 所
示。DNA 探针 1、2 混合物的圆二色谱在 279 nm 附
近有一个正峰（曲线 a），向上述混合物加入 Hg2+ 后，
正峰消失，在 269 nm 附近又出现一个新的负峰（曲
线 b），这是典型 DNA 双链的圆二色特征峰，证明
了 Hg2+ 与 T-T 错配形成 T-Hg2+-T 配合物，促使两条
单链 DNA 探针形成了稳定的 DNA 双链。
2.2 Hg2+检测体系的灵敏度
为验证该检测体系定量分析 Hg2+ 的可行性，考
察了不同 Hg2+ 浓度下检测体系在 523 nm 处的荧光强
2013年第4期 223吴继魁等 ：一种基于汞特异性 DNA 和 SYBR GREEN I 荧光检测 Hg
2+ 方法的建立
度变化。如图 4 所示，检测体系在 523 nm 处的荧光
强度随着 Hg2+ 浓度的增大而增强。（IF-I0）/I0 与 Hg
2+
浓度在 5-100 nmol/L 范围内呈线性关系，线性相
关系数为 0.9976（图 4 插图）。按 3 倍信噪比（S/N）
计算得出检出限为 2 nmol/L。
2.3 Hg2+检测体系的选择性
考察了 10 种常见金属离子对 Hg2+ 检测的干扰。
由图 5 可以看出，当以 1 μmol/L 上述金属离子替代
Hg2+ 加入检测体系时，检测体系均表现出较小的荧
光信号变化（灰色柱）。当将这些金属离子与 Hg2+
共存时，对 Hg2+ 的荧光信号影响较小（黑色柱）。
上述结果表明，该检测体系对 Hg2+ 具有良好的选择
性，多种金属离子的存在也不会对 Hg2+ 的检测产生
干扰，这应该归功于 T-T 与 Hg2+ 特异性结合，形成
稳定的 T-Hg2+-T 配合物。
3 结论
基于 Hg2+ 特异性 DNA 探针和 SG 的分子“开关”
特性，建立的一种新的 Hg2+ 荧光检测方法，简单快
速，无需对 DNA 探针进行荧光标记，不依赖仪器。
采用 Hg2+ 介导的两条 DNA 探针“拉链式”检测模式，
大大提高了检测系统的抗干扰能力。该检测体系在
5-100 nmol/L 浓度范围内实现了 Hg2+ 检测，其检测
限为 2 nmol/L。该检测系统有望应用于水体中 Hg2+
的快速检测。
参 考 文 献
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sensor for mercury in water, cells, and tissue［J］. Angew Chem, Int
Ed, 2007, 46 ：6658-6661.
high fluoresence
low fluoresence
Hg2+
2
1
SG
SG
Probe1
Probe2
A
N
N
N
N
S
N N
OO
O O
Hg2+
SBRY Green I
B
ThymineHg2+Thymine
图 1 基于拉链式 DNA 探针和 SYBR Green I 检测汞离子的原理图（A），以及 SG 和 T-Hg2+-T 的结构示意图（B）
图 3 2 μmol/L DNA 探针在加入 10 μmol/L Hg2+ 前（a）、
后（b）的圆二色谱图 2 荧光光谱
a ：SG ；b ：SG 和 DNA 探针的混合物 ；c ：SG、DNA 探针和 Hg2+ 的混合物
12 a
b
8
4
El
lip
tic
ity
md
eg
0
4
8
12
240 260 280 300 320 340 360
Wavelength nm 520
300
b
a
c
FL
ln
te
ns
ity
a.u
.
200
100
0
540 560 580 600 620 640
Wavelength nm
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期224
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（责任编辑 李楠）
300
15
10
5
0
0 20 40
Hg2+ nmol/L
[Hg2+]
60 80 100 120
200
100
FL
ln
te
ns
ity
a.u
.
520 540 560
Wavelengh nm 580 600 620 640
0
I F
I F
0 /I F
0
图 4 检测体系对不同浓度的 Hg2+ 的荧光响应
插图为 523 nm 处的荧光强度与 Hg2+ 浓度的线性关系图
15
10
5
0
Ag+
I F
I F
0 /I F
0
Al3+ Cd2+
䠁ᆀ⿽㊫
Co2+Cr3+Cu2+Mg2+Ni2+ Pb2+ Zn2+Hg2+Mix+Hg2+
图 5 检测体系的选择性考察