全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
诺尼（Morinda citrifolia L.）系茜草科植物，又
称为海巴戟天、诺丽、 萝梨、四季果或印桑椹等，
是一种发源于南太平洋岛屿的热带常绿多年生阔叶
灌木或小乔木，富含多种营养成分［1］，在我国的西
沙群岛分布有诺尼野生种资源，同时在我国海南省
有一定规模的引种。诺尼果被称为“超级水果”，它
富含 160 余种营养成分，已有研究证明诺尼的果实、
叶片、种子、花、茎、根及树皮均具有良好的药用
及保健功效［2］。在美国等发达国家诺尼保健食品已
被人们用来辅助治疗包括癌症、糖尿病、高血压、
消化不良及免疫力低下等多种疾病［3］。
收稿日期 ：2013-03-28
基金项目 ：中国食品发酵工业研究院科技发展基金（博士基金）项目（2012KJFZ-BS-01）
作者简介 ：刘洋，男，博士，工程师，研究方向 ：微生物分子生物学与生态学 ；E-mail ：ly81150@163.com
通讯作者 ：程池，男，教授级高级工程师，博士生导师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：cheng100027@163.com
西沙野生诺尼种子内生细菌群落多样性的初步研究
刘洋1  李辉1  李金霞1  曹艳花1  姚粟1  白飞荣1  谭望桥2  程池1
（1. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027 ；2. 海南诺尼生物工程开发有限公司，海口 570125）
摘 要 ： 通过构建 16S rDNA 克隆文库的非培养方法对我国西沙野生诺尼种子内生细菌群落结构多样性进行研究，共涉及
Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes 及 Actinobacteria 四大类群，包含 33 个属，42 个 OTU，优势菌属（丰度）依次为 Enterob-
acter sp.（17.55%）、Bacillus sp.（16.79%）、Acinetobacter sp.（6.11%）、Pseudomonas sp.（6.11%）及 Piscinibacter sp.（6.11%）。这是
国内外首次利用非培养方法针对诺尼种子内生细菌群落多样性进行研究的报道。
关键词 ： 诺尼 种子 内生细菌 群落多样性 非培养方法
Investigation on Diversity of Endophytic Bacterial Community in Xisha
Wild Noni（Morinda citrifolia L.）Seed
Liu Yang1 Li Hui1 Li Jinxia1 Cao Yanhua1 Yao Su1 Bai Feirong1 Tan Wangqiao2 Cheng Chi1
（1. China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027 ；
2. Hainan Noni Biological Engineering Development Co.，Ltd.，Haikou 570125）
Abstract:  Using the 16S rDNA clone library technique, a priliminary study was conducted on the community diversity of endophytic
bacteria in seeds of Xisha wild Noni. The results indicated that the endophytic bacterial communities contained 42 Operational Taxonomic Units
（OTUs）in their clone libraries respectively, involving 33 genus from 4 groups of Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria.
The dominant bacterium（abundance）were Enterobacter sp.（17.55%）, Bacillus sp.（16.79%）, Acinetobacter sp.（6.11%）, Pseudomonas
sp.（6.11%）and Piscinibacter sp.（6.11%）. This was the first report of the study on endophytic bacterial communities in the Noni seeds with
culture-independent method.
Key words:  Noni Seed Endophytic bacteria Bacterial community Culture-independent method
植物的种子不仅是植物的延续器官和重要的农
业生产资料［4］，同时还是多种有益细菌和病原菌的
传递载体，已有诸多研究证实植物种子表面及种子
内部蕴藏着多种微生物群落，其能够影响植物的生
长发育、健康程度、品质产量及其功效性成分产生
等多种性状［5］。然而目前，国内外对于与种子相联
合微生物的了解还很有限，其中对与保健品植物原
材种子相联合的微生物更知之甚少，由此不利于在
植源性保健食品加工生产过程中实施必要的微生物
控制与强化工艺，影响保健品产品的产量与质量，
相关研究工作亟待开展。
2013年第10期 143刘洋等 ：西沙野生诺尼种子内生细菌群落多样性的初步研究
本研究拟通过构建 16S rDNA 文库的微生物非
培养（culture-independent）方法，对我国重要的植
源性保健食品原材——西沙野生诺尼种子内生细菌
群落多样性进行研究，旨在为进一步了解诺尼植物
与其内生细菌之间的相互作用关系奠定微生物生态
学研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
西 沙 野 生 诺 尼 成 熟 果 实， 于 2012 年 12 月 采
集自中国海南省三沙市永兴岛，具体位置为北纬
16.83 ，东经 112.34 。在无菌条件下剥离诺尼种子，
种子样品于 4℃保存。
1.2 方法
1.2.1 样品表面灭菌 称取 5 g 种子样品，并用无
菌水冲洗，之后依次用 70% 乙醇，次氯酸钠溶液
（2.5% 有 效 Cl-） 和 70% 乙 醇 浸 泡 3 min、5 min 和
30 s，再用无菌水淋洗 6 次，并于无菌条件下晾干 ；
同时取最后一次淋洗水 120 μL 涂于 LB 固体培养基
平板上，28℃培养 72 h，以检测表面灭菌效果［5］。
1.2.2 样品基因组 DNA 的提取 采用改进的 CTAB
法［6］提取样品基因组 DNA。取 5 g 表面灭菌的诺尼
种子置无菌研钵中，快速将其研磨成粉末装入 5-6
个 1.5 mL 离心管中 ；加入 600 μL CTAB 抽提缓冲液
（2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl pH8.0 ；1.4 mol/L
NaCl ；20 mmol/L EDTA ；1.5% polyvinyl-pyrrolidone，
PVP ；0.5% 2-mercaptoethanol）充分混匀，60℃水浴
45 min，期间颠倒离心管数次，使样品充分接触缓
冲液发生反应；加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24∶1），
充分混匀，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min ；上清液转移
至一新的无菌离心管中，重复步骤 3 一次 ；将上清
液转移至一新的无菌离心管中，加入 RNase（使用
前 100℃煮沸 10 min）使终浓度达 50 μg/mL，37℃
水 浴 30 min ；加 入 蛋 白 酶 K 至 终 浓 度 100 μg/mL，
37℃水浴处理约 45 min ；加入等体积氯仿 -异戊醇
（24∶1），充分混匀，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min。
上清液转移至一新的无菌离心管中，加入 2/3 体积
冰冷的异丙醇，混匀，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min，
弃上清液 ；沉淀用 70% 的乙醇脱盐离心，弃上清液
并进行自然风干，DNA 溶于 30 μL 无菌双蒸水中，
-20℃保存。将提取的诺尼种子总 DNA 稀释至 50 ng
作为模板，进行内生细菌的 16S rDNA PCR 扩增试验。
1.2.3 样品种子内生细菌的 PCR 扩增 以提取获
得的诺尼种子基因组 DNA 作为模板，采用 799f 和
1492r 为 引 物 扩 增 细 菌 16S rDNA， 正 向 引 物 799f
（5-AACAGGATTAGATACCCTG-3），反向引物 1492r
（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。50 μL PCR 反应
体系 ：50 ng DNA 模板，1×Taq reaction buffer，引物
各 20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq 酶（Ferments）。
反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94 ℃变性 1 min，
52℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃
延伸 10 min。PCR 产物约为 750 bp［7］。
1.2.4 16S rDNA 克隆文库的构建 16S rDNA 克隆文
库的构建参照刘洋等方法进行［5］。取 200 μL PCR 产
物于 2.0% 的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将位于
750 bp 左右的条带切下，并进行回收。纯化回收试
剂为 TIANgel Midi Purification Kit（Tiangen，China），
按说明书操作。之后将回收得到的 750 bp 左右的
DNA 片段与载体 pGEM-T Easy 进行连接（Transgen，
China）。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 Top10
（Transgen，China），涂布于含氨苄（100 μg/mL），X-gal
和 IPTG 的 LB 板上过夜培养，进行蓝白斑筛选。随
机挑取白色菌落摇菌，取 500 μL 菌液用甘油 -70 ℃
冻存。在无菌条件下，取少量菌液进行 PCR，引物
为 T7（5-TAATACGACTCACTATAGGG-3） 和 SP6
（5-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3），体系和程
序同上。1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
1.2.5 克隆文库评价 采用 C 值和 aRarefactWin 软
件对克隆文库进行分析和评价［6］。C 值理论上代表
了 16S rDNA 克隆文库中所包含的微生物的种类占
样品中全部微生物种类的比例［8，9］。反映了克隆文
库对样品内生细菌种群的代表程度。数值越大，代
表性越强。公式为 Cx ＝ 1-n1/N，其中 N 代表 16S
rDNA 克隆文库的库容，n1 则代表在 16S rDNA 克隆
文库仅出现过一次的 OTU 的数量。Rarefaction curve
是用已知的各种 OTU 的相对比例来推算抽取 n 个克
隆时出现 OTU 数量的期望值，然后根据一组 n 值与
其相对应的 OTU 数量的期望值所做出的曲线，当曲
线趋于平缓或达到平台期时可以认为库容已足够。
1.2.6 测序及相关分析 随即挑取 150 个克隆，并
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期144
采 用 ABI 3730 型 DNA 测 序 仪 测 序（ABI，USA）。
将测序得到的结果在 EzTaxon server 2.1 进行比对［10］，
确定与已知序列的同源关系，序列相似性达到 97%
以上的归为同一个操作分类单元（OTU，operational
taxonomic units）。
2 结果
2.1 种子基因组DNA的提取
将表面灭菌的最后一次的洗涤水涂 LB 平板培
养 72 h 后，未见菌落生长，另外，以其作为 PCR 模板，
用细菌 16S rDNA 的通用引物进行 PCR 扩增，结果
无可见条带，说明表面灭菌有效。以表面灭菌后的
种子为材料，用 CTAB 法提样品的基因组 DNA，将
得到的 DNA 样品用 1% 浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，
获得大小为 23 kb 左右的条带，其中包含诺尼种子
和内生细菌两者的基因组 DNA（图 1）。
值和稀释曲线都显示了这该克隆文库的库容已基本
足够，即该文库已能够代表样品内生细菌群落的多
样性。
23.1
kb
M 1
M ：λDNA/Hind III Marker ；1 ：西沙野生尼诺种子总 DNA
图 1 西沙野生诺尼种子样品总 DNA 电泳结果图
2.2 种子内生细菌16S rDNA片段的扩增
以 基 因 组 DNA 为 模 板， 采 用 引 物 799f 和
1492r，扩增得到特异的内生细菌的 16S rDNA，电泳
结果显示，PCR 产物为两条带，一条在 1 000-2 000
bp 之间，为诺尼线粒体 18S rDNA ；另外一条在 750
bp 左右，是包含有内生细菌 16S rDNA 的目的条带
（图 2-a），该片段经回收纯化后（图 2-b），构建 16S
rDNA 克隆文库。每个文库挑取 150 个克隆进行目的
片段扩增，除去假阳性菌株并进行序列测定，经序
列比对分析后，将每个 OTU 的代表克隆序列信息提
交至 GenBank，登录号为 KC478784-KC478825。
2.3 克隆文库评价
本研究采集的西沙野生诺尼种子样品内生细菌
共 包 括 42 个 OTU， 该 文 库 的 C 值 为 81.68%。16S
rDNA 克隆文库的稀释曲线已趋于平缓（图 3）。C
2000
bp
M M
bp
1000
750
a b
2000
1000
750
M ：D2000 Marker
图 2 西沙野生诺尼种子内生细菌 16S rDNA 片段扩增（a）
及纯化（b）结果
45
35
25
15
5
0
0 20 40 60 80ݻ䲶ᮠⴞ
O
TU
ᮠⴞ
100 120 140
10
20
30
40
图 3 西沙野生诺尼种子内生细菌 16S rDNA 克隆文库的稀
释曲线
2.4 种子内生细菌16S rDNA多样性及其系统发育
分析
西沙野生诺尼种子内生细菌群落分属变形菌
门（Proteobacteria）、 厚 壁 菌 门（Firmicutes）、 拟 杆
菌 门（Bacteroidetes） 及 放 线 菌 门（Actinobacteria）
四大类群，其中 Proteobacteria 包含 91 个 clone，丰
度 为 69.47%， 并 划 归 28 个 OTU ；Firmicutes 包 含
36 个 clone， 丰 度 为 27.48%， 并 划 归 10 个 OTU ；
Bacteroidetes 与 Actinobacteria 各包含 2 个 clone，丰
度均为 1.53%，各划归 2 个 OTU。
该 群 落 优 势 菌 属（ 丰 度 ） 依 次 为 肠 杆 菌 属
（Enterobacter sp.）（17.55%）、芽孢杆菌属（Bacillus
sp.）（16.79%）、 不 动 杆 菌 属（Acinetobacter sp.）
（6.11%）、 假 单 胞 菌 属（Pseudomonas sp.）（6.11%）
及 Piscinibacter sp.（6.11%）。该群落中占明显优势
的菌种（参比 GenBank 数据库中同源性最高的菌种）
2013年第10期 145刘洋等 ：西沙野生诺尼种子内生细菌群落多样性的初步研究
分别为克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）（14.50%）、
霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）（9.92%）、路
氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）（7.63%），具体信
息详见表 1。
表
1
野
生
诺
尼
种
子
内
生
细
菌
16
S
rD
N
A
克
隆
分
布
分
类
N
o.
o
f O
T
U
s
ge
nu
s
R
ep
re
se
nt
at
-
iv
e
cl
on
e
N
o.
o
f
cl
on
es
to
ta
l c
lo
ne
s
（
%
）









C
lo
se
st
N
C
B
I
m
at
ch
In
de
nt
it
y
（
%
）
G
en
B
an
k
A
cc
-
es
si
on
N
o.
P
ro
te
ob
ac
te
ri
a
28
A
ci
ne
to
ba
ct
er
Z
7
7
5.
34
A
ci
ne
to
ba
ct
er
p
it
ti
i L
M
G
1
03
5（
T
）（
H
Q
18
01
84
）
10
0
K
C
47
87
85
Z
41
1
0.
76
A
ci
ne
to
ba
ct
er
s
ol
i B
1（
T
）（
E
U
29
01
55
）
10
0
K
C
47
87
97
A
qu
ab
ac
te
ri
um
Z
59
1
0.
76
A
qu
ab
ac
te
ri
um
fo
nt
ip
hi
lu
m
C
S-
6（
T
）（
E
F
62
66
87
）
97
..4
K
C
47
88
02
Z
12
7
1
0.
76
A
qu
ab
ac
te
ri
um
p
ar
vu
m
B
6（
T
）（
A
F
03
50
52
）
98
.4
K
C
47
88
20
B
re
vu
nd
im
on
as
Z
12
6
1
0.
76
B
re
vu
nd
im
on
as
d
im
in
ut
a
A
T
C
C
1
15
68
（
T
）（
G
L
88
30
89
）
99
.9
K
C
47
88
19
C
ed
ec
ea
Z
27
7
5.
34
C
ed
ec
ea
d
av
is
ae
D
SM
4
56
8（
T
）（
A
F
49
39
7 6
）
99
.5
K
C
47
87
92
C
he
la
to
co
cc
us
Z
10
7
1
0.
76
C
he
la
to
co
cc
us
d
ae
gu
en
si
s
K
10
6（
T
）（
E
F
58
45
07
）
99
.9
K
C
47
88
15
D
el
ft
ia
Z
20
1
0.
76
D
el
ft
ia
a
ci
do
vo
ra
ns
A
C
M
4
89
（
T
）（
A
F
07
87
74
）
99
.9
K
C
47
87
88
E
nt
er
ob
ac
te
r
Z
13
1
10
7.
63
E
nt
er
ob
ac
te
r
lu
dw
ig
ii
D
SM
1
66
88
（
T
）（
A
J8
53
89
1）
99
.6
K
C
47
88
22
Z
10
2
13
9.
92
E
nt
er
ob
ac
te
r
ho
rm
ae
ch
ei
A
T
C
C
4
91
62
（
T
）（
A
F
H
R
01
00
00
79
）
99
.9
K
C
47
88
11
K
le
bs
ie
ll
a
Z
29
2
1.
53
K
le
bs
ie
ll
a
ox
yt
oc
a
JC
M
1
66
5（
T
）（
A
B
00
47
54
）
10
0
K
C
47
87
93
Li
m
no
ba
ct
er
Z
96
1
0.
76
Li
m
no
ba
ct
er
th
io
ox
id
an
s
C
S-
K
2（
T
）（
A
J2
89
88
5）
10
0
K
C
47
88
07
Lu
te
ib
ac
te
r
Z
46
1
0.
76
Lu
te
ib
ac
te
r
an
th
ro
pi
C
C
U
G
2
50
36
（
T
）（
F
M
21
25
61
）
99
.6
K
C
47
88
00
M
et
hy
lo
ba
ct
er
iu
m
Z
26
2
1.
53
M
et
hy
lo
ba
ct
er
iu
m
p
op
ul
i B
J0
01
（
T
）（
C
P
00
10
29
）
99
.7
K
C
47
87
91
M
et
hy
lo
ce
ll
a
Z
17
1
0.
76
M
et
hy
lo
ce
ll
a
pa
lu
st
ri
s
K
（
T
）（
Y
17
14
4）
97
.1
K
C
47
87
8 7
O
ch
ro
ba
ct
ru
m
Z
52
3
2.
29
O
ch
ro
ba
ct
ru
m
in
te
rm
ed
iu
m
L
M
G
3
30
1（
T
）（
A
C
Q
A
01
00
00
03
）
10
0
K
C
47
88
01
P
an
to
ea
Z
11
4
3.
05
P
an
to
ea
d
is
pe
rs
a
L
M
G
2
60
3（
T
）（
D
Q
50
43
05
）
10
0
K
C
47
87
86
P
el
om
on
as
Z
10
5
7
5.
34
P
el
om
on
as
p
ur
aq
ua
e
C
C
U
G
5
27
69
（
T
）（
A
M
50
14
39
）
10
0
K
C
47
88
13
P
is
ci
ni
ba
ct
er
Z
10
6
8
6.
11
P
is
ci
ni
ba
ct
er
a
qu
at
ic
us
I
M
C
C
17
28
（
T
）（
D
Q
66
42
44
）
98
.6
K
C
47
88
14
P
se
ud
om
on
as
Z
10
3
3
2.
29
P
se
ud
om
on
as
a
er
ug
in
os
a
L
M
G
1
24
2（
T
）（
Z
76
65
1）
10
0
K
C
47
88
12
Z
13
3
4
3.
05
P
se
ud
om
on
as
o
ry
zi
ha
bi
ta
ns
I
A
M
1
56
8（
T
）（
A
M
26
29
73
）
10
0
K
C
47
88
23
Z
11
1
1
0.
76
P
se
ud
om
on
as
p
le
co
gl
os
si
ci
da
F
P
C
95
1（
T
）（
A
B
00
94
57
）
99
.9
K
C
47
88
16
Sc
hl
eg
el
el
la
Z
6
1
0.
76
Sc
hl
eg
el
el
la
a
qu
at
ic
a
w
cf
1（
T
）（
D
Q
41
73
36
）
99
.3
K
C
47
87
84
Sh
ig
el
la
Z
97
1
0.
76
Sh
ig
el
la
d
ys
en
te
ri
ae
A
T
C
C
1
33
13
（
T
）（
X
96
96
6）
99
.9
K
C
47
88
08
Z
99
1
0.
76
Sh
ig
el
la
fl
ex
ne
ri
A
T
C
C
2
99
03
（
T
）（
X
96
96
3）
99
.9
K
C
47
88
09
So
li
m
on
as
Z
42
1
0.
76
So
li
m
on
as
s
ol
i D
C
Y
12
（
T
）（
E
F
06
78
61
）
95
.9
K
C
47
87
98
Sp
hi
ng
om
on
as
Z
12
8
1
0.
76
Sp
hi
ng
om
on
as
fo
rm
os
en
si
s
C
C
-N
fb
-2
（
T
）（
H
M
19
35
17
）
95
.5
K
C
47
88
21
St
en
ot
ro
ph
om
on
as
Z
69
6
4.
58
St
en
ot
ro
ph
om
on
as
p
av
an
ii
I
C
B
8
9（
T
）（
F
J7
48
68
3）
10
0
K
C
47
88
05
F
ir
m
ic
ut
es
10
B
ac
il
lu
s
Z
10
0
19
14
.5
0
B
ac
il
lu
s
cl
au
si
i K
SM
-K
16
（
A
P
00
66
27
）
10
0
K
C
47
88
10
Z
15
0
3
2.
29
B
ac
il
lu
s
li
ch
en
if
or
m
is
A
T
C
C
1
45
80
（
T
）（
A
E
01
73
33
）
10
0
K
C
47
88
25
B
ha
rg
av
ae
a
Z
45
5
3.
82
B
ha
rg
av
ae
a
ce
ce
m
be
ns
is
D
SE
10
（
T
）（
A
M
28
64
23
）
10
0
K
C
47
87
99
E
nt
er
oc
oc
cu
s
Z
12
5
1
0.
76
E
nt
er
oc
oc
cu
s
ca
ss
el
if
la
vu
s
C
E
C
T
96
9（
T
）（
A
J4
20
80
4）
99
.9
K
C
47
88
18
Z
39
2
1.
53
E
nt
er
oc
oc
cu
s
di
sp
ar
A
T
C
C
5
12
66
（
T
）（
A
F
06
10
07
）
10
0
K
C
47
87
96
La
ct
oc
oc
cu
s
Z
25
1
0.
76
La
ct
oc
oc
cu
s
ga
rv
ie
ae
A
T
C
C
4
91
56
（
T
）（
A
P
00
93
32
）
10
0
K
C
47
87
90
P
ae
ni
ba
ci
ll
us
Z
13
7
2
1.
53
P
ae
ni
ba
ci
ll
us
h
un
an
en
si
s
F
eL
05
（
T
）（
E
U
74
10
36
）
99
.7
K
C
47
88
24
St
ap
hy
lo
co
cc
us
Z
66
1
0.
76
St
ap
hy
lo
co
cc
us
c
ap
ra
e
A
T
C
C
3
55
38
（
T
）（
A
B
00
99
35
）
99
.6
K
C
47
88
03
St
re
pt
oc
oc
cu
s
Z
32
1
0.
76
St
re
pt
oc
oc
cu
s
in
fa
nt
ar
iu
s
su
bs
p.
in
fa
nt
ar
iu
s
A
T
C
C
B
A
A
-1
02
（
T
）（
A
B
JK
02
00
00
17
）
99
.9
K
C
47
87
94
Z
67
1
0.
76
St
re
pt
oc
oc
cu
s
or
al
is
A
T
C
C
3
50
37
（
T
）（
A
D
M
V
01
00
00
01
）
99
.9
K
C
47
88
04
B
ac
te
ro
id
et
es
2
H
ym
en
ob
ac
te
r
Z
12
2
1
0.
76
H
ym
en
ob
ac
te
r
pe
rf
us
us
A
2-
50
A
（
T
）（
H
M
03
28
97
）
99
.7
K
C
47
88
17
Sp
hi
ng
ob
ac
te
ri
um
Z
90
1
0.
76
Sp
hi
ng
ob
ac
te
ri
um
m
ul
ti
vo
ru
m
I
A
M
14
31
6（
T
）（
A
B
10
07
38
）
99
.0
K
C
47
88
06
A
ct
in
ob
ac
te
ri
a
2
K
oc
ur
ia
Z
34
1
0.
76
K
oc
ur
ia
r
os
ea
D
SM
2
04
47
（
T
）（
X
87
75
6）
99
.9
K
C
47
87
95
P
ro
pi
on
ib
ac
te
ri
um
Z
24
1
0.
76
P
ro
pi
on
ib
ac
te
ri
um
a
cn
es
K
P
A
1 7
12
02
（
A
E
01
72
83
）
99
.6
K
C
47
87
89
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期146
3 讨论
种子不仅是植物的繁殖器官，是植物个体发育
的一个特定而重要的阶段，而且还是携带着双亲本
基因的雏形植物体［4］，同时种子还是多种有益细菌
和病原菌的传递载体，其表面及内部蕴藏着多种微
生物群落，直接或间接地影响着植物诸多方面的性
状［5］。近年来，关于与种子相联合的微生物的研究
如雨后春笋般蓬勃发展，本研究组邹媛媛等［11］曾
统计了已报道的在大麦、水稻、大豆、油菜、棉花、
甜菜和番茄等植物中与种子相联合的细菌种类，共
计 50 余个属，100 余个种，其中大部分为革兰氏阴
性菌。
然而，相比较植物根际微生物，关于与种子联
合的微生物的研究还相对较少［12］，且目前主要集中
于传统粮食作物及常见蔬菜等农作物［11］，对于诺尼
等重要的植源性保健食品原材种子微生物的研究在
国内外尚属空白。更值得一提的是，诺尼保健食品
目前在国内外主要采取自然发酵生产，其固有的内
生微生物群落在生产过程中发挥的作用不容忽视，
而全面系统地把握诺尼内生微生物群落结构，是进
一步了解其生物学功能的前提条件。因此，本研究
不仅具有理论创新意义，而且具有潜在的实践指导
价值。
本研究利用非培养方法自西沙野生诺尼种子中
鉴定得到 Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes 及
Actinobacteria 四大类群，共涉及 33 个菌属、42 个
OTU。由此可见，西沙野生诺尼种子内生细菌群落
多样性丰富，群落结构较为复杂。同时，几乎所有
鉴定得到的优势菌属 Enterobacter sp.，Bacillus sp.，
Acinetobacter sp. 及 Pseudomonas sp. 中均存在植物促
生细菌种类［13-15］，能够直接或者间接促进植物的生
长发育。
本研究鉴定得到的西沙野生诺尼种子内生细菌
群落中潜在的优势菌种 Bacillus clausii、Enterobacter
hormaechei 及 Enterobacter ludwigii 均 是 目 前 工 业 生
产中所使用的发酵生产菌种。Bacillus clausii 能够
固态发酵产碱性果胶酶，能够用于棉纤维的生物
精炼、植物韧皮纤维脱胶、造纸、咖啡和茶发酵、
处理含果胶废水和洗涤剂等领域［16］；Enterobacter
hormaechei 能够通过液体发酵生产青霉素酶，目前该
酶已主要用于对食品中青霉素残留量的快速定量测
定［17］；Enterobacter ludwigii 合成 ACC 脱氨酶及 IAA
嗜铁素，制备植物生长素，并且可以在盐碱胁迫环
境中有效地促进植物对营养物质的吸收、调节植物
生长以及提高植物在逆境条件下抗逆的能力［18］。
本研究利用非培养方法对我国西沙野生诺尼种
子内生细菌群落多样性进行初步研究，不仅能够丰
富植植物种子微生态学的研究内容，而且为下一步
有效筛选与诺尼植物促生作用和功效性成分相关的
内生菌提供参考资料，同时能够为今后开展不同基
因型及不同发育时期的诺尼种子内生细菌区系的研
究奠定基础。本研究对诺尼产业化种植环节中合理
应用益微菌剂、产品原材选取过程中合理选择诺尼
的品种及生长时期，以及诺尼产品自然发酵生产中
合理实施微生物控制与强化提供了新的思路。
4 结论
我国西沙野生诺尼种子内生细菌群落中微生物
类群丰富，群落结构较为复杂，其中包含能够促进
植物生长的有益促生细菌及工业生产所使用的发酵
功能菌，这是国内外首次利用非培养方法针对诺尼
种子内生细菌群落多样性进行的研究，具有重要的
理论研究与实践指导价值。
致谢 ：本研究得到了海南省三沙市政府的大力
支持与帮助，在此表示衷心地感谢。
参 考 文 献
［1］ 褚大为 . 来自伊甸园的礼物——热带野果萝荔的故事［M］.
上海 ：上海科学普及出版社 , 2002 ：1-2.
［2］ 张伟敏 , 魏静 , 施瑞诚 . Noni 果的活性成分和生理功能的研究
进展［J］. 天然产物研究与开发 , 2007, 19 ：1087-1091.
［3］ Wang MY, West BJ, Jensen CJ, et al. Morinda citrifolia（Noni）：
A literature review and recent advances in Noni research ［J］. Acta
Pharmacol Sin, 2002, 23（12）：1127-1141.
［4］ 管康林 . 种子生理生态学［M］. 北京：中国农业出版社 , 2009：
1-7.
［5］ 刘洋 , 左山 , 邹媛媛 , 等 . 杂交玉米农大 108 及其亲本种子内生
细菌群落多样性的研究［M］. 中国农业科学 , 2011, 44（23）：
2013年第10期 147刘洋等 ：西沙野生诺尼种子内生细菌群落多样性的初步研究
4763-4771.
［6］ Liu Y, Zuo S, Zou Y, et al. Investigation on diversity and population
succession dynamics of endophytic bacteria from seeds of maize（Zea
mays L., Nongda108）at different growth stages ［J］. Annals of
Microbiology, 2013, 63 ：71-79.
［7］ Liu Y, Zuo S, Xu L, et al. Study on diversity of endophytic bacterial
communities in seeds of hybrid maize and their parental lines ［J］.
Archives of Microbiology, 2012, 194 ：1001-1012.
［8］ Good IJ. The Population frequencies of species and the estimation of
population parameters ［J］. Biometrika, 1953, 40（3-4）：237-264.
［9］ Mullins TD, Britschgi TB, Krest RL, et al. Genetic comparisons
reveal the same unknown bacterial lineages in atlantic and pacific
bacterioplankton communities ［J］. Limnol Oceanogr, 1995, 40（1）：
148-158.
［10］ Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon ：a web-based tool for the
identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene
sequences ［J］. Int J Syst Evol Micr, 2007, 57 ：2259-2261.
［11］ 邹媛媛 , 刘洋 , 王建华 , 等 . 种子微生物生态学研究进展［J］.
生态学报 , 2011, 31（10）：2906-2914.
［12］ Cankar K, Kraigher H, Ravnikar M, et al. Bacterial endophytes
from seeds of Norway spruce（Picea abies L. Karst）［J］. FEMS
Microbiol Lett, 2005, 244（2）：341-345.
［13］ Lucy M, Reed E, Glick BR. Applications of free living plant growth-
promoting rhizobacteria ［J］. Antonic van Leeuwenhoke, 2004,
86 ：1-25.
［14］ Sturz AV. The role of endophytic bacteria during seed piece decay
and potato tuberization ［J］. Plant Soil, 1995, 175 ：257-263.
［15］ Videira SS, de Araujo JL, da Silva Rodrigues L, et al. Occurrence
and diversity of nitrogen-fixing Sphingomonas bacteria associated
with rice plants grown in Brazil ［J］. FEMS Microbiol Lett, 2009,
293（1）：11-19.
［16］ 张保国 , 白志辉 , 李祖明 , 等 . 克劳氏芽孢杆菌 S-4 菌株固态
发酵产碱性果胶酶 ［J］. 食品与发酵工业 , 2005, 31（3）：8-11.
［17］ 岳喜庆 , 王桐 , 单提波 , 等 . 霍氏肠杆菌 WM1 产青霉素酶发
酵条件的研究［J］. 中国酿造 , 2010, 8 ：91-93.
［18］ 郭长虹 , 马嘉敏 , 康慧颖 , 等 . 一株苜蓿根际促生菌 MJM-11
及其应用 ：中国 , 201210278954［P］.
（责任编辑 马鑫）