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Isolation of Diesel Degrading Strain Acinetobacter sp. AK5 and Its Degrading Performance

柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的筛选及其降解性能研究



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
由于全球性广泛的石油开采、运输、使用和处
置,石油及其产品的泄漏已经成为世界性的环境问
题。在土壤、海洋和大气环境中的石油污染日益严重。
据统计全世界每年有 1×109 t 原油及其产品进入环
境中,污染土壤、地下水、河流和海洋[1,2]。当前,
海洋的石油污染日趋加剧,石油的主要成分包括烷
烃、芳香烃和多环芳烃等,石油进入海洋水体后,
会产生大面积的油膜,石油污染影响景观,破坏物
理环境,油膜能黏附鱼卵与幼鱼,使其死亡。同时
收稿日期 :2014-01-07
基金项目 :江苏省自然科学基金面上项目(BK2012557)
作者简介 :徐晓宇,女,硕士,研究方向 :环境微生物 ;E-mail :iist@jiangnan.edu.cn
柴油降解菌 Acinetobacter sp. AK5 的筛选及
其降解性能研究
徐晓宇  陈敬华
(江南大学医药学院,无锡 214122)
摘 要 : 从污水处理厂的活性污泥中分离到一株柴油降解菌,通过生理生化鉴定和 16S rDNA 序列分析,鉴定该菌为不动杆
菌 Acinetobacter sp. AK5。检测了不同 pH 值、NaCl 浓度、培养时间和各种柴油浓度下 Acinertobacter sp. AK5 的柴油降解情况。结果表明,
该菌的最适生长初始 pH 值为 5-9,适合 NaCl 浓度为 3%-4%,柴油浓度为 5 g/L 时,该菌 7 d 柴油降解率可达 99%,柴油浓度为
20 g/L 时,7 d 柴油降解率也可达 67%。AK5 在人工海水培养基中及无机盐培养基中生长状态良好,在海水和淡水石油污染的生物
修复中具有很好的应用前景。
关键词 : 柴油 降解 不动杆菌 降解率
Isolation of Diesel Degrading Strain Acinetobacter sp. AK5 and
Its Degrading Performance
Xu Xiaoyu Chen Jinghua
(School of Pharmaceutical Science,Jiangnan University,Wuxi 214122)
Abstract:  A diesel degradable bacterial strain was isolated from activated sludge and identified as Acinetobacter sp. AK5 through
physiological, biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis. Experiments of the different pH values, NaCl concentrations, culture
time and diesel concentrations were detected to evaluate the diesel degradability by Acinetobacter sp. AK5. The results show that the optimal
initial pH scope for the bacterial growth is from 5 to 9, the optimum NaCl concentrations is between 3% and 4%. When the diesel concentration
is 5 g/L, the 7 d diesel degradation rate can reach 99%, while when the concentration of diesel is 20 g/L, 7 d diesel degradation rate can be 67%.
The Acinetobacter sp. AK5 can grow well in artificial seawater medium and inorganic salt culture medium, therefore it has promising application
prospect in seawater and freshwater oil pollution treatment.
Key words:  Diesel Degradation Acinetobacter Degradation rate
油膜减少了太阳辐射投入海水的能量和进入海水中
氧的数量,阻隔了海水和空气的相互作用和热交换,
阻止海水蒸发,造成水生动物缺氧死亡,从而降低
了海洋的自净能力,影响海洋生物的光合作用和生
物链循环,进而使海洋生态系统遭到严重破坏,导
致受污染的海洋生态系统经过几十年都难以修复[3]。
石油烃污染的处理方法有物理法、化学法和生
物法。其中生物处理方法相对于物理和化学方法具
有费用低、无二次污染等优点。目前,国内外针对
2014年第8期 147徐晓宇等 :柴油降解菌 Acinetobacter sp. AK5 的筛选及其降解性能研究
石油烃的微生物降解首先集中于单纯或混合微生物
培养物对石油烃的降解动力学及其降解情况[4-6],
近几年,添加表面活性剂[7-9]、添加碳源[10-12]和其
它技术[13-16]在提高微生物的石油烃降解效率的研
究也有报道。国内外学者也进行了很多关于海洋石
油降解菌的筛选研究[17-19],本研究从污水处理厂的
活性污泥中筛选出一株高效柴油降解菌,并对其进
行鉴定,研究其在人工海洋培养基中的柴油降解条
件以及降解特性,旨在为其在海洋石油污染治理方
面的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源 从无锡某生活污水处理厂二沉池
中采集活性污泥,用无菌采样瓶带回实验室,4℃保
存备用。
1.1.2 培养基 菌株传代用培养基(LB 培养基):
蛋白胨 10.0 g/L ;酵母粉 5.0 g/L ;NaCl 10.0 g/L ;pH
7.0-7.2。
无机盐培养基 :柴油 10.0 g/L ;KH2PO4 2.0 g/L ;
K2HPO4 2.0 g/L ;KNO3 1.0 g/L ;(NH4)2SO4 2.0 g/L ;
NaCl 1.0 g/L ;MgSO4·7H2O 0.2 g/L ;CaCl2·H2O 0.02
g/L ;FeCl2·7H2O 0.01 g/L
[6];微量元素液 1 mL,维
生 素 B1 0.004 g/L,pH7.0-7.2,121℃ 湿 热 灭 菌 20
min 后补加微量元素液混合液 2 mL(经 0.22 μm 滤
膜 过 滤 除 菌 )。 微 量 元 素 液 配 方 :H3BO3 0.1 g/L ;
MnCl2·4H2O 0.1 g/L ;ZnSO4·H2O 0.1 g/L ;FeCl3·6H2O
0.1 g/L ;CaCl2 1.0 g/L ;CuCl2·2H2O 0.05 g/L。
人工海水培养基(MMC):NaC1 24 g,KC1 0.7
g,MgSO4·7H2O 0.7 g,NH4NO3 1 g,KH2PO4 2 g,
Na2HPO4·12H2O 3 g, 蒸 馏 水 1 L,pH7.4, 并 补 加
柴油 10 g 作为唯一碳源(0.45 m 滤膜过滤除菌)配
制。121℃湿热灭菌 20 min 后补加微量元素液混合
液 2 mL(经 0.22 μm 滤膜过滤除菌)。微量元素溶液:
MgSO4·7 H2O 4 g,CuSO4·5H2O 1 g,MnSO4·H2O 1 g,
FeSO4·7H2O 1 g,CaC12 1 g,蒸馏水 1 L。
1.2 方法
1.2.1 柴油降解菌的富集和分离
1.2.1.1 菌源富集 配制无机盐培养基,250 mL 的
三角烧瓶加入 100 mL 培养基,灭菌后,加入活性污
泥,加入 1 mL 柴油,放入恒温振荡培养箱以转速
120 r/min,30℃恒温培养。取上述培养 3 d 后的混合
培养液进行接种驯化,30℃、150 r/min 恒温振荡培
养 7 d。驯化时,先取 5 mL 富集后的培养液到含有
最低柴油浓度的新鲜驯化培养液中,培养 7 d,然后
从中取出 5 mL 培养液加入含有较高原油浓度的驯化
培养液中,再次培养 7 d。重复 3 次。
1.2.1.2 单菌株的分离 将筛选出的能以柴油为唯
一碳源生长的混合菌分别接种到柴油浓度为 0.5% 的
人工海水培养基中,在恒温摇床上进行振荡培养,
在 LB 固体培养基上利用平板划线方法进行单菌株
的分离。
1.2.2 柴降解菌株的鉴定 将一株降解能力较好的
菌株命名为 AK5,将该菌株划线接种 LB 培养平板
上培养后挑取单菌落,于斜面培养进行培养 24 h,
革兰氏染色后并进行生理生化鉴定。用 DNA 快速提
取试剂盒提取菌株 AK5 基因组 DNA,采用 16S 通用
引物(27F :5-AGAGTTTGAAGAGTTTGATCCTGGC-
TCAG-3 ;1492R :5-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3)
对 AK5 的 16S rDNA 序 列 进 行 PCR 扩 增, 反 应 体
系(25 μL)为 :模板 DNA 1 μL,Taq 10× 缓冲液
5 μL,dNTP 100 mol/L,DNA 聚合酶 2.5 U,上下游
引物各 1 μL。PCR 反应条件为 :94℃预变性 5 min ;
94℃ 变 性 30 s,55℃ 退 火 45 s,72℃ 延 伸 1.5 min,
循环 30 次 ;72℃延伸 10 min。电泳割胶回收后,将
PCR 产物与 pMD19-T 载体连接,转化到大肠杆菌
JM109 感受态细胞中,通过蓝白斑筛选阳性重组子,
送华大基因测序。将测得的 16S rDNA 序列在 NCBI
的 GenBank 进行比对,对获得的同源序列进行分析,
采用 Neighbor-Joining(N-J)法构建进化树。
1.2.3 柴油降解菌降解特性
1.2.3.1 pH 对 菌 株 柴 油 降 解 的 影 响 将 体 积 分
数 10% 的 AK5 菌液接种到人工海水培养基中,在
30℃,200 r/min,柴油浓度为 10 g/L,pH 分别为 4.0、
5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0,培养 7 d,分别检
测其柴油降解率。
1.2.3.2 NaCl 浓度对菌株柴油降解的影响 将 AK5
菌液按照 10% 体积比接种到 NaCl 分别为 0、1%、2%、
3%、4% 和 5% 的人工海水培养基中,在 30℃,200
r/min,柴油浓度为 10 g/L 的条件下培养 7 d,分别检
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期148
测其柴油降解率。
1.2.3.3 柴油浓度对菌株柴油降解的影响 将 AK5
按照 10% 体积比接种到人工海水培养基中,其柴油
浓度分别为 5、10、15 和 20 g/L,培养 7 d,每天取样,
检测其在不同柴油浓度下的柴油降解率。
1.2.3.4 培养基对 AK5 柴油降解的影响 将 AK5 按
照 10% 体积比分别接种到无机盐培养基和人工海水
培养基中,柴油初始浓度为 5 g/L。每天取样,检测
其不同培养基培养条件下的柴油降解率。
1.2.4 柴油降解率的检测 将 AK5 在含不同石油烃
组分培养液中培养,以紫外分光光度法在 230 nm 波
长下检测柴油浓度[20]计算降解率。
2 结果
2.1 Acineitobacter sp. AK5菌株的形态特征与16S
rDNA序列分析
柴油降解菌 Acinetobacter sp. AK5,菌落圆形,
黄白色,表面光滑,革兰氏染色阴性球杆菌、无鞭毛、
有荚膜、不产芽孢、不发酵葡萄糖、乳糖、甘露糖、
麦芽糖、吲哚试验阴性、甲基红试验结果阴性、VP
试验阴性,有溶血环。经 16S rDNA 测序及 GenBank
比对,并采用 N-J 法构建分子进化树,该菌与不动
杆菌属有 99% 以上的相似性,综合上述分析结果将
此菌株鉴定为不动杆菌菌属,命名为 AK5(图 1)。
2.2 AK5在不同初始pH值下的柴油降解率
柴油降解菌 AK5 在不同初始 pH 条件下的柴油
降解率(图 2)显示,AK5 在初始 pH 为 6 时降解率
最高,可达 90%,而在初始 pH10 时柴油的降解率
则降到 10% 以下。细菌在 pH5-9 的范围内均有较好
的降解率,说明 AK5 适合在中性偏碱性的条件下生
长。而 AK5 在 pH6-9 范围内 7 d 柴油降解率均可以
达到 50% 以上,能更好地适应海洋环境。
2.3 AK5在不同NaCl浓度下的柴油降解率
研究了 NaCl 浓度为 0-5% 条件下柴油降解菌的
降解情况(图 3)表明,在 NaCl 浓度为 0-4% 的条
件下,AK5 均有较好的柴油降解率。其中不含 NaCl
条件下 AK5 的柴油降解率在 62%,3% NaCl 浓度下
AK5 的柴油降解率达 95.6%,但在 NaCl 浓度为 5% 时,
柴油降解率降到 48%,因此 AK5 的最适生长的海水
NaCl 浓度为 3%-4%,其最高耐受范围是 4%,适应
Acinetobacter junii SH205
Acinetobacter baumannii ABNIH3
AK5
Acinetobacter sp. NBRC 100985
Acinetobacter radioresistens SK82
Acinetobacter haemolyticus ATCC 19194
Acinetobacter lwoffii WJ10621
Acinetobacter pittii D499
Acinetobacter calcoaceticus RUH2202
Moraxella catarrhalis BC8 ctg00029
Enhydrobacter aerosaccus SK60
Ralstonia solanacearum Y45
Pseudomonas syringae pv. aceris str
0.01
B
A
图 1 Acinetobacter sp. AK5 的菌落形态(A)与菌株系统
发育树(B)
0
10
20
30
40
50
60
70
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90
100
4 5 6 7 8 9 10 11
pH٬Ḥ⋩䱽䀓⦷ %
图 2 不同 pH 条件下柴油的降解率
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6
NaCl⎃ᓖ % Ḥ⋩䱽䀓⦷ %
图 3 不同 NaCl 浓度下柴油的降解率
2014年第8期 149徐晓宇等 :柴油降解菌 Acinetobacter sp. AK5 的筛选及其降解性能研究
自然海洋环境水体中的 NaCl 浓度。
2.4 不同柴油浓度下AK5的柴油降解率
分别在不同初始柴油浓度下研究柴油降解率,
结果(图 4)表明,AK5 菌株的柴油降解率随着柴
油浓度升高而降低,柴油浓度为 5 g/L 时柴油的降解
率最高,第 1 天降解率就在 42.5%,第 7 天降解率
为 99%。柴油浓度为 20 g/L 时,AK5 的柴油 7 d 降
解率也能达到将近 60%。而 AK5 对质量浓度为 5 g/L
的柴油 3 d 降解率即超过 60%。因此认为 AK5 能更
好地适用于降解高浓度柴油污染水体。
杆菌属(Alcaligenes)等。近年来国内分离到的海洋
石油烃降解菌有 :刘陈立等[21]分离得到的食烷菌
(Alcanivorax sp. B-5);陈碧娥等[22]从湄洲湾污染水
样中分离得到的假单胞菌(Pseudomonas sp. H1),谭
田丰等[23]从胜利油田黄河码头近岸表层海水分离
得到的不动杆菌(Acinetobacter sp. PN3-2)和苏莹[24]
分离到的不动杆菌(Acinetobacter sp. HB-1)和周常
义[25]的 Acinetobacter sp. JMUXMS-100 等。
从已经报道的柴油降解菌的种属分布来看,它
们可以分布在广泛的种属中,但是以 Acinetobacter 居
多,本研究分离得到的菌株也属 Acinetobacter,但是
与其他研究不同的是,本研究获得菌种的来源并非
从受到石油烃污染的海洋环境中获得,而是从城市
生活污水处理厂活性污泥中分离得到,这说明石油
烃类降解菌分布广泛,具有很强的适应性。柴油降
解菌的生长条件和降解能力对后续的应用非常重要,
因此本试验进一步研究了其生长条件和降解特性。
从初始 pH 和 NaCl 浓度来看,AK5 主要是在中性偏
碱性的条件下生长较佳,这与其他研究者分离得到
的柴油降解菌生长条件类似。在 NaCl 浓度为 0-4%
的条件下,AK5 均有较好的柴油降解率,但是从
降解率曲线可以看出,AK5 在 NaCl 浓度为 3%-4%
条件下,其柴油降解率(95.6%)反而高于在不含
NaCl 条件下的降解率(62%),说明该菌非常适合海
洋环境(盐分含量约 3.5%)下应用。
有关 AK5 降解能力的结果表明,其降解能力优
良,在已经报道的一些菌属中,降解效果较佳,表
1 列出了一些公开报道的柴油降解菌的降解条件和
性能。此外,AK5 在人工海水培养基和普通的无机
0
10
20
30
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100
0 1 2 3 4 5 6 7ษޫᰦ䰤 d Ḥ⋩䱽䀓⦷ % 5 g/LḤ⋩10 g/LḤ⋩15 g/LḤ⋩20 g/LḤ⋩
图 4 AK5 在不同初始柴油浓度下的柴油降解率
2.5 在不同培养基条件下AK5的柴油降解情况
分别将 AK5 按照 10% 的接种体积,接种到无
机盐培养基和人工海水培养基中,柴油初始浓度为
5 g/L。每天取样,检测其不同培养基培养条件下的
柴油降解率,结果(图 5)表明,AK5 在上述两种
培养基中均生长良好,在培养前 4 d 中,AK5 在无
机盐培养基中的柴油降解率要高于海水培养基,培
养 1 d 后,无机盐培养基中柴油降解率为 50% 以上,
而人工海水培养基为 40%,但是第 6、7 天,在两种
培养基中的柴油降解率趋于一致,在培养 7 d 后柴
油降解率均达到 99%。由此可见,AK5 在淡水及海
水环境下均生长良好并能够保持较高的柴油降解率,
因此可以用于淡水水体和海洋水体的柴油生物处理。
3 讨论
生物技术修复是海洋受到石油烃污染后采用
的一种主要修复手段,而其中最关键的环节就是
获得具有高效降解活性的降解微生物。目前已知
海洋中最主要的石油烃降解细菌有 :无色杆菌属
(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱
0
10
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1 2 3 4 5 6 7ษޫᰦ䰤 d Ḥ⋩䱽䀓⦷ % ᰐᵪⴀษޫสӪᐕ⎧≤ษޫส
图 5 培养基对 AK5 柴油降解率的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期150
盐培养基中,均具有较好的柴油降解能力,说明该
菌种适合于淡水和海水条件下的应用。
4 结论
本研究从污水处理厂的活性污泥中筛选出一株
高效柴油降解菌,经鉴定为不动杆菌,Acinetobacter
sp. AK5。AK5 在人工海水培养基条件下,在 pH5-9
时,NaCl 浓度 0-4%,柴油浓度 5-20 g/L 的条件下
均能高效降解柴油。其中柴油浓度为 20 g/L 时 7 d
柴油降解率仍可达 67%,优于已报道的海洋微生物。
AK5 在无机盐培养基及人工模拟海水培养基中均生
长良好,在淡水水体及海水水体中的石油烃污染处
理中均有良好的应用前景。
参 考 文 献
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表 1 部分报道的柴油降解菌的降解条件和性能
菌种名 适宜 pH 盐分浓度 降解条件和效率 来源
Acinetobacter sp. HB-1 6.5-7.5 3% 6 d,54.74% [24]
Acinetobacter sp. 7.0 - 3 d,100-500 mg/L 范围内 38.7%-57.2% [25]
Alcanivorax sp. A-11-3 - - 7 d,49.5% [18]
Pseudomonas 5.0 - 1.0 g/L,7 d,80% [19]
Acinetobacter sp. AK5 5-9 0-4% 7 d,5.0 g/L 时,99% ;20 g/L 时,67% 本研究
“-”表示未见报道
2014年第8期 151徐晓宇等 :柴油降解菌 Acinetobacter sp. AK5 的筛选及其降解性能研究
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(责任编辑 马鑫)