全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
收稿日期 : 2012-06-01
基金项目 : 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2010C017）
作者简介 : 王书 , 女 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 发育生物学 ; E-mail: wsh@cafs.ac.cn
通讯作者 : 孙效文 , 男 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 水产生物技术 ; E-mail: sunxw2002@163.com
我国养殖水产品占世界养殖水产品的 70% 以
上，是水产养殖的第一大国。鲤科鱼类养殖业又在
我国水产养殖产量中占有举足轻重的地位，年总养
殖产量在 1 200 万 t 以上，鲤科的几大养殖种如鲤、鲢、
鳙、草和鲫等，每个物种的养殖年产量都超过百万吨，
而鲤鱼是目前淡水鱼年产量超过百万吨的 5 种鱼中
育成品种最多的，也是最能代表中国水产养殖历史
的养殖种。
肌肉发生及分化是动物胚胎早期发育的一个重
要环节，对于了解胚胎发育的全过程具有重大意义，
一直是人们感兴趣的热点问题之一。同哺乳动物
镜鲤骨骼肌酵母双杂交 cDNA 文库的构建及鉴定
王书  张研  蒋丽  赵紫霞  孙效文
（中国水产科学研究院，北京 100141）
摘 要 ： 为了研究蛋白质之间的相互作用，利用 Gateway 技术构建了镜鲤（Cyprinus carpio Linnaeus）骨骼肌酵母双杂交
cDNA 文库。经检测表明，构建的初级 cDNA 文库的库容量为 8×106 CFU ；酵母双杂交 cDNA 文库的库容量为 6.64×106 CFU，插
入片段集中在 1-2 kb 之间，具有较好的多态性。随机挑取的 24 个克隆没有空载体，全部发生了重组。较高的库容量、较长的插
入片段以及较高的重组率保证了文库的完整性和覆盖度。镜鲤骨骼肌酵母双杂交 cDNA 文库的构建为克隆全长目的基因及研究影
响骨骼肌发育的信号传导通路奠定了基础。
关键词 ： 镜鲤 酵母双杂交 Gateway 技术 cDNA 文库
Construction and Identification of a Cyprinus carpio Linnaeus Skeletal
Muscle Yeast Two-hybrid Library
Wang Shu Zhang Yan Jiang Li Zhao Zixia Sun Xiaowen
（Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141）
Abstract:  A yeast two-hybrid cDNA library of Cyprinus carpio Linnaeus skeletal muscle was constructed using the CloneMinerTM cDNA
Library Construction Kit. The results showed that the primary library contains 8×106 independent clones and the yeast two-hybrid library
contains 6.64×106 independent clones. The sizes of most inserts were 1-2 kb in length. All randomly selected 24 clones have recombination.
High storage capacity，longer insert fragment and higher recombination rate ensured the integrity and coverage of the library. Construction of
this yeast two-hybrid library of Cyprinus carpio Linnaeus skeletal muscle laid the foundation for cloning of the full-length genes in Cyprinus
carpio Linnaeus and studies on signal transduction pathway of skeletal muscle growth.
Key words:  Mirror carp Yeast two-hybrid Gateway cDNA library
相类似，鱼类肌肉发生的起始即细胞决定过程受到
Shh［1，2］、Wnts［3，4］、BMPs［5］ 及 FGFs 等多个信号
传导系统的调节，而随后肌细胞的分化是一系列起正
调控或负调控作用的蛋白，如肌肉特异性的转录因
子等，以多种多样的复杂方式（如时空表达、信号
级联反应、转录调控、反馈机制等）精确调控的结
果。近年来随着 RNA 干扰、基因过表达、诱发基因
突变等技术的应用，多种重要的肌细胞生长调控因
子的功能得以阐明。其中，正向调节因子主要有生
肌决定因子家族（MRFs）［6，7］、胰岛素样生长因子
（IGFs）［8-10］、肌细胞增强因子 2（MEF2）［11］等，而
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期128
分化抑制因子（Id）［12］、肌肉生长抑制素 （MSTN）［13］
等则对肌肉的分化有负调控作用。然而，关于这些
基因在信号传导通路中的上下游关系以及是否存在
协同调控等问题，还有待进一步研究和证实。
深入了解肌肉发育过程中的基因互作效应，并
以此为基础改善肉质性状一直是鱼类育种研究的热
点。酵母双杂交系统具有简便、灵敏和高效等特点，
近年来，酵母双杂交方法进一步发展用于细胞内整
体规模的蛋白互作研究，使正常细胞活动依赖的复
杂网络得以揭示，是研究蛋白互作的重要手段。本
研究以镜鲤骨骼肌 mRNA 为模板，利用 Gateway 技
术构建初级 cDNA 文库，并将其成功转换到表达载
体 pDEST22 中，构建了高质量的酵母双杂交 cDNA
文库，旨在为研究影响骨骼肌发育的信号传导通路
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用鱼 健康镜鲤采自中国水产科学研究
院黑龙江水产研究所松浦实验基地，平均体长 17
cm，平均体重 80 g。
1.1.2 主要试剂 CloneMiner II cDNA Library Constru-
ction Kit、Trizol Reagent、FastTrack 2.0 Kit、SuperScri-
ptIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR、Platinum
Taq DNA Polymerase、PureLink Quick Gel Extraction
and PCR Purification Combo Kit、PureLink TM HQ Plas-
mid DNA Purification Kits 均购自 Invitrogen 公司。BD
CHROMA SPINTM-400 Columns 购自 Clontech 公司。
1.1.3 菌株及质粒 菌株 DH10B 购自 Clontech 公司，
载体 pDONR222/pDEST22 购自 Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 称取镜鲤骨骼肌，置于液氮
中备用。总 RNA 提取按照 Invitrogen 公司 RNA 提取
试剂盒说明书进行。提取的总 RNA 用 1% 的琼脂糖
凝胶电泳检测其完整性。取 1 μL RNA 样品稀释后测
定 RNA 浓度及 OD260、OD280。样品 RNA 浓度计算公
式为 ：A260× 稀释倍数 ×40 ng/μL。
1.2.2 mRNA 的分离与纯化 利用 FastTrack 2.0 Kit
中的 oligo（dT） cellulose 分离纯化镜鲤骨骼肌总 RNA
中的 mRNA，紫外分光光度计检测 mRNA 的质量。
1.2.3 初级 cDNA 文库的构建
1.2.3.1 cDNA 第一链的合成 取 3 μg mRNA 作为模
板，加 RNase-free H2O 至 9 μL，再加入带有生物素
标 记 的 attB2-Oligo（dT） Primer、10 mmol/L （each）
dNTPs 各 1 μL，混匀，65℃反应 5 min 使 RNA 变性，
45℃冷却 2 min，再加入 5×First Strand Buffer 4 μL，
DTT（0.1 mol/L）2 μL，RNase-free H2O 1 μL，45℃放
置 2 min ；最 后 加 入 SuperScriptIII RT 3 μL， 混 匀，
45℃反应 60 min 合成第一链 cDNA。
1.2.3.2 cDNA 第二链的合成 在 1st Strand cDNA 合
成液中加入以下试剂进行 2nd Strand cDNA 的合成反
应（总反应体系为 150 μL）：RNase-free H2O 92 μL，
5×Second Strand Buffer 30 μL，10 mmol/L （each）
dNTPs 3 μL，E.coli DNA Ligase （10 U/μL） 1 μL，E.coli
DNA Polymerase I （10 U/μL） 4 μL，E.coli RNaseH （2
U/μL） 1 μL，16℃反应 2 h。之后加入 T4 DNA Poly-
merase 2 μL，混匀，16℃反应 5 min 后用 0.5 mol/L
EDTA 终止反应，酚 / 氯仿抽提，乙醇沉淀，cDNA
溶解于 18 μL RNase-free H2O 中。
1.2.3.3 与三框重组接头连接（3 种接头分别各连接
一份） 取新合成的双链 cDNA 6 μL，加入 RNase-free
H2O 12 μL，5×Adapter buffer 10 μL，attB1 Adapter
（1 μg/μL）10 μL，0.1 mol/L DTT 7 μL，T4 DNA Ligase
（1 U/μL） 5 μL，16℃连接过夜。
1.2.3.4 cDNA 分离与回收 经过加接头的 cDNA 需
要进行分级分离以除去小片段 cDNA。操作方法按
照 BD CHROMA SPINTM-400 Columns 说明书进行。
1.2.3.5 BP 重组反应及电转化大肠杆菌 DH10B 将
带有 aatB 接头的 cDNA 通过 BP 反应重组到 pDONR-
222 载体上，并电转化大肠杆菌 DH10B 感受态细胞，
37℃ 250 r/min 复苏 1 h 后，培养物加入甘油至终浓
度 20%，存于 -80℃，此即为初级文库菌液。
1.2.4 初级 cDNA 文库的质量鉴定
1.2.4.1 库容量的鉴定 从初级文库菌液（1 mL）
中取 10 μL，稀释 1 000 倍后取出 50 μL 涂布 LB 平
板（含 50 μg/mL Kan），37℃倒置培养过夜，总克隆
数 CFU= 平板上的克隆数 × 稀释倍数 ×103/ 涂布体
积（μL）
1.2.4.2 平均插入片段及重组率计算 使用 pDONR-
222 载体上的通用引物 M13F 和 M13R 对随机挑取的
2012年第11期 129王书等 ：镜鲤骨骼肌酵母双杂交 cDNA 文库的构建及鉴定
图 1 镜鲤骨骼肌总 RNA 提取
M. 1 Kb Plus DNA Ladder （Invitrogen）；1， 2. 不同浓度的镜鲤骨骼肌总 RNA
M 1 2
2000
bp
1650
1000
850
650
28S
18S
M. 1Kb Plus DNA Ladder （Invitrogen）；1. 分离到的 mRNA
图 2 mRNA 电泳检测结果
M 1
2000
bp
1650
1000
850
650
25 个克隆进行菌落 PCR 鉴定，电泳检测插入片段的
大小。
1.2.5 酵母双杂交文库构建
1.2.5.1 初级文库的质粒抽提 将验证合格的初级
文库接种于 50 mL 肉汤培养基中，30℃过夜培养，
当细胞浓度约为 1.5×1010cells/mL（1 A600≈2.5×10
10
cells/mL）时，终止培养。参照 PureLink TM HQ Plasmid
DNA Purification Kits 使用说明抽提文库质粒，测 OD
值并电泳检测。
1.2.5.2 LR 重组反应及电转化大肠杆菌 DH10B 通
过 LR 重组反应将文库 cDNA 从入门载体 pDONR222
转 换 到 表 达 载 体 pDEST22 上， 反 应 体 系 如 下 ：
pDONR222 文 库 质 粒（300 ng/μL） 1 μL，pDEST22
（3 000 ng/μL） 1 μL，LR Clonase II mix 6 μL， 加 dd
H2O 至总体积 20 μL，25℃反应 16-20 h。在反应体
系中加入 ProreinaseK 以失活重组酶，乙醇沉淀 LR
重组产物，cDNA 溶解于 8 μL TE 中。电转化法转化
大肠杆菌 DH10B，37℃复苏 1 h，加入甘油至终浓
度 20% 存于 -80℃，此即为酵母双杂交文库菌液。
1.2.6 酵母双杂交文库的质量鉴定 方法同 1.2.4，
插入片段采用 pDEST22 上的通用引物进行扩增。
2 结果
2.1 镜鲤骨骼肌总RNA提取
1% 琼脂糖凝胶电泳快速检测所提镜鲤骨骼肌
总 RNA，可以清晰的看到 28S 和 18S 两条 RNA 条带，
28S RNA与18S RNA两条带的亮度比接近2 1 （图1），
A260/A280 值为 1.96。说明所提取的总 RNA 具有较好
的纯度和完整性，可以用于 cDNA 文库的构建。
分离纯化 mRNA，经电泳分析（图 2），mRNA 在较
大范围内弥散分布，28S 和 18S rRNA 已基本上被去
除，浓缩后的 mRNA 没有降解。mRNA 在反转录酶
和 DNA 聚合酶作用下分别得到一链和二链 cDNA。
cDNA 片段与三框 attB1 重组接头分别连接后，使用
BD CHROMA SPINTM-400 凝胶过滤柱去除小于 500
bp 的 cDNA 短片段，电泳结果表明片段大小符合构
建文库的要求，可以进行后续试验。
2.3 初级cDNA文库质量鉴定
将稀释过的细胞转化菌液涂布平板，37℃培
养过夜后，经计算，初级 cDNA 文库的库容量为
8×106CFU。文库的库容量是指构建的 cDNA 文库中
包含的独立的重组子克隆数，它决于来源细胞中表
达出的 mRNA 种类和每种 mRNA 序列的拷贝数，是
体现文库质量的最重要指标。随机挑取 25 个单克隆
菌落进行 PCR 扩增，初级文库 cDNA 插入片段主要
分布在 1-2 kb 之间，平均插入片段大于 1.5 kb，具
有良好的多态性。全部 25 个菌落均为有插入片段的
阳性克隆。结果（图 3）表明，初级 cDNA 文库具有
较高的库容量、较长的插入片段以及较高的重组率。
2.4 酵母双杂交cDNA文库质量鉴定
经计算，酵母双杂交 cDNA 文库的库容量为
6.64×106CFU。随机挑取 24 个克隆进行菌落 PCR
鉴定，电泳结果（图 4）显示，插入片段大于 2 kb
的有两个克隆，小于 1 kb 的有一个克隆，其余均集
中在 1-2 kb 之间，具有较好的多态性。24 个克隆中
没有空载体，表明全部发生了重组。文库的代表性
及重组片段的序列完整性达到了用于目的基因分离
筛选和克隆表达的要求。
2.2 镜鲤骨骼肌mRNA的分离与反转录
利用 FastTrack 2.0 试剂盒的 oligo（dT） cellulose
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期130
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16MW
17 18 19 20 21 22 23 24 25 MW
MW. 1 kb Plus DNA Ladder （Invitrogen）； 1-25. 随机挑取的
初级 cDNA 文库中 25 个克隆的 PCR 产物
图 3 镜鲤骨骼肌初级 cDNA 文库插入片段的 PCR 检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16MW
17 18 19 20 21 22 23 24MW
MW. 1 kb Plus DNA Ladder （Invitrogen）；1-24. 随机挑取的酵母
双杂交 cDNA 文库中 24 个克隆的 PCR 产物
图 4 镜鲤骨骼肌酵母双杂交 cDNA 文库插入
片段的 PCR 检测
用（结果未发表），说明本系统在一定程度上有效解
决了假阳性这个普遍存在的问题。
3.2 肌肉分化及发育相关的重要基因：
MyoD 是 bHLH 类转录因子，该家族成员的发
现加深了人们对肌肉发育机制的认识。MyoD 与靶基
因启动子区的 E-box 序列相结合，在肌肉特异性基
因转录调控中起总开关的作用。它在脊椎动物胚胎
期肌肉发育，其他类型细胞转化为成肌细胞，成肌
细胞分化为肌管以及骨骼肌的形成和分化过程中起
重要作用。关于 MyoD 基因功能研究最经典的实验是，
在小鼠、鸡和人的成纤维细胞和脂肪细胞中过表达，
可使成纤维细胞和脂肪细胞转化为成肌细胞，并且
形成肌管［14］。
胰岛素样生长因子（IGFs）在肌肉细胞的分
化和生长过程中具有重要的正向调节作用。目前已
经在斑马鱼、虹鳟、罗非鱼等多种鱼类中克隆出
了 IGF-I 和 IGF-II 的 cDNA 序列。IGF-I 能体外刺激
虹鳟肌细胞分化［9］，IGF-II 能启动级联反应，促进
MyoD 诱导的肌肉特异性基因的转录。大西洋鲑中
IGF-I 的上调表达可促使其骨骼肌快速生长［10］。
MSTN （myostatin） 是近年来发现的一类重要的
肌细胞生长调控因子［13］，它能通过抑制生肌决定因
子（myogenic determinating factors，MDFs）家族成员
转录活性负向控制肌细胞的生长发育，它的表达量
与肌肉重量的变化呈负相关。在 myostatin 敲除的老
鼠体内，肌纤维发生广泛的增生和肥大，导致骨骼
肌肌肉质量显著增加，其平均体重超过正常老鼠的
261%［15］。myostatin 基因的功能在牛、羊、猪等物
种中也得到了鉴定，如 myostatin 编码序列发生突变
的比利时蓝牛呈现肌肉质量显著增加的表型，被称
为“双肌症状”（doubling muscling）［16-18］。
肌细胞增强因子 2（MEF2）属于 MADS 类转录
因子。MEF2 失活的果蝇，成肌细胞的分化没有受
到影响，但是横纹肌与平滑肌的分化受到抑制，暗
示 MEF2 在肌肉发生的终极分化中起作用。肌细胞
中 MEF2 活性蛋白的总量并不与其 mRNA 量成正比，
它具有众多激酶修饰位点，其磷酸化程度决定了自
身的活性。MEF2 可通过结合不同蛋白去调节不同
靶基因的转录，已知的结合蛋白有 TGF-β 信号通路
3 讨论
3.1 镜鲤骨骼肌酵母双杂交文库的构建与质量
鉴定
Invitrogen 公司的 CloneMiner 酵母双杂交系统采
用了 Gateway 技术，筛选到的阳性 cDNA 克隆可以
通过重组快速地转到各个表达系统进行表达或分析，
为后期开展功能研究提供了便利。此外，该系统的
BD 和 AD 融合载体均利用 ARS/CEN 位点来严格控
制拷贝数，防止过表达带来的假阳性问题，用分别
由不同启动子控制的 3 个报告基因（HIS3、URA3
和 LacZ）来筛选阳性克隆，也有效降低了假阳性率。
在本研究的后续试验中，以 MSTN （myostatin）为诱
饵蛋白，筛选到了 5 个互作蛋白，通过酵母回转及
体外 GST pull-down 试验均验证了它们之间的相互作
2012年第11期 131王书等 ：镜鲤骨骼肌酵母双杂交 cDNA 文库的构建及鉴定
中的 Smad 蛋白和 HDACII 等蛋白。
3.3 酵母双杂交文库构建的意义
通过构建酵母双杂交文库，一方面，可以对文
库的 EST 进行测序，根据测序结果直接设计引物或
者探针调取 cDNA 序列，丰富鲤鱼基因数据库。另
一方面，肌肉发生与分化是一个非常复杂的网络调
控过程，从细胞决定到分化成熟受到众多信号通路
及转录因子的调控。本研究下一步拟针对上述这些
蛋白构建诱饵载体，大规模筛选酵母双杂交文库，
发现更多的蛋白互作及转录因子的互作伴侣蛋白，
寻找信号传导网络可能的关键节点，加强对这一生
命现象的认识，以期通过现代分子育种技术，挑选
出具有优良肉质性状基因的种群大量繁殖，提高肉
类生产的产量和品质。
4 结论
利 用 Gateway 技 术 成 功 构 建 了 镜 鲤（Cyprinus
carpio Linnaeus）骨骼肌酵母双杂交 cDNA 文库。文
库的库容量为 6.64×106 CFU，随机挑取的克隆全部
发生重组，插入片段在 1-2 kb 之间，具有较好的多
态性，完全符合文库构建指标要求，可以用来进行
大规模的互作蛋白筛选试验。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
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