全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):64-68
烟草制品作为特殊消费品，公众对转基因烟草
比其他转基因作物更加敏感，烟草作为转基因研究
的模式植物，国内外很多科研单位已成功培育抗虫、
抗病等多种表现优异的转基因烟草［1］，这些实验材
料一旦发生不规范释放和利用，将对消费者利益和
我国烟草制品的国际形象造成重大影响。
国际上对烟草转基因检测的遗传元件主要为
35S 启 动 子（ 烟 草 花 叶 病 毒 CaMV 35S 启 动 子 ）、
NOS 终止子（农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子）、
NPT II 筛选标记基因（来自大肠杆菌，编码新霉素
磷酸转移酶，卡那霉素抗性的标记基因）［1，2］，我
们在对烟草转基因研究中常用遗传元件的筛查中［1］，
统计出这 3 种元件在烟草转基因研究中的使用频
率为 90%，属于高频使用外源基因元件，在我国，
GB/T24310-2009 《烟草及烟草制品 转基因检测方
法》［3］将这 3 种遗传元件作为转基因烟草检测中共
收稿日期 ：2014-10-30
基金项目 ：贵州省科技支撑计划农业攻关［黔科合 NY（2013）3020 号］
作者简介 ：余婧，女，硕士，农艺师，研究方向 ：烟草转基因检测及烟草生物技术 ；E-mail ：yujingbio@126.com
通讯作者 ：赵杰宏，男，博士，副研究员，研究方向 ：烟草生物技术 ；E-mail ：zhaojiehong@126.com
多重 PCR 技术快速检测烤后烟叶转基因成分
余婧1，2  郭玉双1  林世锋1  余世洲1 赵杰宏1
（1. 贵州省烟草科学研究院 烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵阳 550081 ；2. 贵州烟叶复烤有限责任公司铜仁复烤厂，铜仁 554300）
摘 要 ： 为提高烟叶转基因成分检测效率，建立了烤后烟叶中 3 种外源基因成分的多重 PCR 检测技术体系，通过优化该反
应体系中的 Mg2+、dNTP、rTaq 酶、引物浓度及退火温度等参数，实验最适条件为将 4 对相等摩尔浓度引物预先按 1∶1∶1∶1（V/V）
混合，在 Mg2+ 为 1.5 mmol/L、dNTP 为 125 μmol/L、rTaq 酶 1 U、混合引物 1 μmol/L，DNA 100 ng，退火温度 65℃，循环数 35 个的
反应条件下，在一次 PCR 反应中便可同时检测烟草内源基因 NR，外源基因 35S 启动子、NOS 终止子、NPT II 筛选标记基因。优
化后的反应体系能够有效地检测出转基因烤后烟叶百分比含量为 0.9%（V/V）的转基因成分。
关键词 ： 多重 PCR ；烤后烟叶 ；转基因成分
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.010
A Multiplex PCR for Rapid Detection of Genetically Modified
Ingredient in Flue-cured Tobacco
Yu Jing1，2 Guo Yushuang1 Lin Shifeng1 Yu Shizhou1 Zhao Jiehong1
（1. Tobacco Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco，Guizhou Academy of Tobacco Science of CNTC，Guiyang 550081 ；
2. Tongren Factory of Guizhou Tobacco Leaf Redrying Co.，Ltd，Tongren 554300）
Abstract: In order to improve the efficiency of detecting genetically modified ingredient（GMI）, we established a multiplex PCR
detecting 3 exogenous gene ingredients in flue-cured tobacco. By optimizing the concentrations of Mg2+, dNTP, rTaq, and primer as well as
annealing temperature in the multiplex PCR system, the result showed that the optimal conditions for the experiment were ：4 pairs of primers
pre-mixed in ratio of 1∶1∶1∶1（V/V）, Mg2+ 1. 5 mmol/L, dNTP 125 μmol/L, rTaq polymerase 1 U, mixed primers 1 μmol/L, DNA 100 ng
annealing temperature 65℃, and 35 reaction cycles ；under the above conditions, the system detected 1 tobacco endogenous gene NR, exogenous
gene 35S promoter, NOS terminator and selectable marker NPT II gene by 1 PCR reaction. In this study, the optimized multiplex PCR could
efficiently detect the GMI of 0.9%（V/V）in transgenic flue-cured tobacco.
Key words: multiplex PCR ；flue-cured tobacco ；GMO ingredient
2015,31(7) 65余婧等 ：多重 PCR 技术快速检测烤后烟叶转基因成分
有序列标志。因此，在检测烟叶中是否含有转基因
成分时，可先行检测 35S、NOS、NPT II 基因是否存
在来确定烟叶中是否含转基因成分。而 NR 基因为
烟草内源基因硝酸还原酶，在 PCR 检测中用以评价
DNA 提取质量的可用性［4］。
在转基因检测方法中，PCR 方法以其灵敏度高
而得到广泛认可，定性 PCR 技术是转基因检测中最
成熟的技术之一，并且多数国家将该方法制定为标
准检验方法，但是，大多数定性 PCR 检测采用单
一 PCR 技术，需分别对每个靶标进行检测，花费时
间较多［5］。多重 PCR 方法是单一 PCR 方法的改进，
该技术在一次 PCR 反应中同时加入多对引物，只需
一次 PCR 反应便能同时检测两种以上靶标序列，较
单一 PCR 更为快捷和经济［6］，在病毒检测、细菌检测、
转基因检测中得到广泛应用［7］。高玉龙等［8］曾提
出用于转基因烟草检测的多重 PCR 方法，但该方法
是将 35S 与 NR，NPT II 与 NOS 分别进行二重 PCR
检测，并未在同一反应内同时实现 4 种基因成分的
检测。本实验以烤后烟叶为供试材料，旨在建立通
过一个 PCR 反应内便能同时检测烟草内源基因 NR、
外源基因 35S 启动子、NOS 终止子及 NPT II 筛选标
记基因的多重 PCR 方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 转基因阳性烤后烟叶，非转基因
烤后烟叶由本实验室研制提供，其中转基因阳性烟
叶为 T3 代 Southern 检测单拷贝阳性植株，含 NPT
II、35S、NOS 三种已知转基因成分。烤后烟叶 DNA
提取参照 GB/T 24310-2009 《烟草及烟草制品 转基因
检测方法》［3］，DNA 浓度统一调至 100 ng/μL 后，转
基因烟叶 DNA 与非转基因烟叶 DNA 按 1∶99（V/V）
比例混合，制成转基因含量为 1% 的供试 DNA。
1.1.2 试剂 rTaqTM（货号 R001A，内含 A 试剂：dN-
TP mixture，浓度为各 2.5 mmol/L，B 试剂 ：10×PCR
buffer，Mg2+ 浓 度 为 15 mmol/L，C 试 剂 ：rTaq 酶，
5 U/μL）、100 bp DNA Ladder Marker、6×Loading
Buffer 为 TaKaRa 公 司 产 品， 核 酸 染 料 GelRedTM
10 000×in water 为 BIOTIUM 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参照国标［3］引物在 NCBI 中检索
基因原序列，通过 Primer Premier V5.0 设计引物，用
软件中的 Multiplex/Nested Primers 功能，筛选出引物
间干扰最小的引物组合，再利用 Olige 6.0 对设计引
物 Tm 值进行评估，确定最终引物序列，引物由上
海捷瑞生物工程有限公司合成。
表 1 引物序列及扩增产物
扩增基因 引物序列（5-3） Tm 值 /℃ 产物大小
NPT II
TCACTGAAGCGGGAAGGGACTG 73.3
490
GCGATACCGTAAAGCACGAGGAA 72.9
35S
CTACCCGAGCAATAATCTCCAGG 69.5
345
TGCTCCACCATGTTGACGAAG 68.7
NOS
CCGGTCTTGCGATGATTATCAT 68.9
199
AGTAACATAGATGACACCGCGC 66.9
NR
CGCTGATAACTGGATTGAACGC 69.7
137
GGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC 70.7
1.2.2 单 一 PCR 检 测 单 一 PCR 反 应 体 系 为 ：
10×PCR buffer 2 μL（Mg2+ 终 浓 度 1.50 mmol/L），
dNTP 1 μL（dNTP 终浓度 125 μmol/L），上下游引物
各 1 μmol/L，DNA 模板 1 μL，rTaq 酶 0.2 μL，ddH2O
补足 20 μL。PCR 反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 30，65℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，35 个
循环 ；72℃延伸 5 min。PCR 产物加 5 μL 6×Loading
Buffer，取 8 μL 经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 多重 PCR 体系反应体系建立及优化 以上
述单一 PCR 体系为初始反应体系，将 4 对引物稀
释成相等摩尔浓度后预先按 1∶1∶1∶1（V/V）混
合，对 Mg2+、dNTP、rTaq 酶和混合引物浓度进行
优 化，Mg2+ 浓 度 ：0.75、1.50、2.25、3.00、3.75 和
4.50 mmol/L；dNTP 浓度：100、125、150、175、200、
225、250 和 275 μmol/L；rTaq 酶浓度：1.0、1.5、2.0、
2.5 和 3.0 U；混合引物浓度：0.50、0.75、1.00、1.25、
1.50、1.75 和 2.00 μmol/L。 反 应 体 系 均 为 20 μL。
PCR 产 物 加 5 μL 6×Loading Buffer， 取 8 μL 经 2%
琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 多重 PCR 反应条件优化 根据 1.2.3 优化的
反应体系，分别对退火温度和循环数进行优化。退
火温度梯度 ：57.5、60.0、62.5、65.0 和 67.5℃ ；循
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.766
环数 ：27、29、31、33 和 35 个循环。反应体系均
为 20 μL。PCR 产 物 加 5 μL 6×Loading Buffer， 取
8 μL 经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 多重 PCR 检测限确定 根据 1.2.3 及 1.2.4 优
化后的多重 PCR 反应体系及条件，按 1.1.1 将转基
因烟叶 DNA 及非转基因烟叶 DNA 混合为转基因成
分含量分别为 0.9%、0.7%、0.5%、0.3% 和 0.1% 的
DNA 样品，确定多重 PCR 的检测限。
2 结果
2.1 单一PCR及引物特异性验证
对转基因及非转基因烟叶内源基因 NR 的扩增
结果（图 1）显示，在 137 bp 处有明显的特异性扩
增条带，说明提取的烟叶 DNA 模板可用于 PCR 检测。
对外源基因 NPT II、35S、NOS 的扩增结果可知，转
基因烟叶分别在约 490 bp、345 bp 和 199 bp 处出现
明显的特异性扩增条带，而非转基因烟叶未见扩增
条带，且空白对照均无条带，说明本实验设计的引
物具有较好的特异性，符合 PCR 检测需要，可用于
下步的多重 PCR 检测试验。
带非常很弱，基本不可见，而其他泳道中不同 Mg2+
浓度的扩增效果均没有泳道 2 理想，说明 10×PCR
buffer 中 Mg2+ 对多重 PCR 反应影响显著，在 Mg2+ 浓
度为 1.5 mmol/L 时扩增效果最佳。图 3 结果所示，
在泳道 1-7 中，不同 dNTP 浓度的扩增条带亮度均
较为一致，无显著的非特异性扩增条带，但是，当
dNTP 浓 度 达 到 275 μmol/L 时，NPT II 及 NR 基 因
特异扩增条带可见，但 35S 及 NOS 反应条带亮度明
显很弱。图 4 及图 5 中，rTaq 酶浓度及混合引物浓
度在一定范围内的变化并未对结果有显著影响，但
rTaq 酶浓度偏高时，在约 600 bp 处有非特异性扩增
条带出现。
M：100 bp Ladder DNA Marker；1-6：Mg2+ 浓度分别为 0.75、1.50、2.25、3.00、
3.75 和 4.50 mmol/L
图 2 多重 PCR 中不同 Mg2+ 浓度扩增结果
M ：100 bp Ladder DNA Marker ；1-8 ：dNTP 浓 度 分 别 为 100、125、150、
175、200、225、250 和 275 μmol/L
图 3 多重 PCR 中不同 dNTP 浓度扩增结果
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
600
1500
500
400
300
200
100
M ：100 bp Ladder DNA Marker，；1-3、4-6、7-9、10-12 分别为 NPT II 筛选
标记基因、35S 启动子、NOS 终止子、NR 基因的单一 PCR 产物，其中 1、4、
7、10 为转基因含量 1% 烤后烟叶 DNA，2、5、8、11 为非转基因烤后烟叶
DNA 对照，3、6、9、12 为空白对照
图 1 单一 PCR 扩增结果
2.2 反应体系各组分对多重PCR的影响
在加入不同浓度的 Mg2+ 后，转基因烟叶多重
PCR 反 应 扩 增 结 果（ 图 2） 显 示， 泳 道 2 中， 在
Mg2+ 浓 度 为 1.5 mmol/L 时，4 个 基 因 的 扩 增 条 件
亮度较为一致且清晰可见，而泳道 1 及泳道 6 中，
Mg2+ 分 别 为 0.75 mmol/L 及 4.5 mmol/L 时， 反 应 条
bp
M 1 2 3 4 5 6
600
1500
500
400
300
200
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8
600
1500
500
400
300
200
100
综合以上因素、实验成本及单一 PCR 扩增结果，
优化后的反应体系为 4 对引物预先稀释成相等摩尔
浓度后按 1∶1∶1∶1（V/V）混合，在反应中加入
Mg2+ 1.5 μmol/L、dNTP 125 mol/L、rTaq 1 U、混合引
2015,31(7) 67余婧等 ：多重 PCR 技术快速检测烤后烟叶转基因成分
物 1 μmol/L。
2.3 不同反应条件对多重PCR的影响
图 6 中，退火温度为 65℃时扩增效果最佳，而
65℃以下退火温度的扩增效果均不理想，部分条带
不清晰，而退火温度为 67.5℃时，35S 及 NOS 的特
异性扩增条件不可见，这是由于在较高退火温度条
件下这两对引物的 Tm 值较低所致。图 7 中，35 个
循环的反应条件为最佳循环数。
M ：100 bp Ladder DNA Marker ；1-5 ：循环数分别为 27、29、31、33 和 35
个循环
图 7 多重 PCR 中不同循环数扩增结果
M ：100 bp Ladder DNA Marker ；1-5 ：退 火 温 度 分 别 为 57.5、60.0、62.5、
65.0 和 67.5℃
图 6 多重 PCR 中不同退火温度扩增结果
M ：100 bp Ladder DNA Marker ；1-5 ：rTaq 酶浓度分别为 1.0、1.5、
2.0、2.5 和 3.0 U
图 4 多重 PCR 中不同 rTaq 酶浓度扩增结果
M ：100 bp Ladder DNA Marker ；1-7 ：混合引物浓度分别为 0.50、0.75、1.00、
1.25、1.50、1.75 和 2.00 μmol/L
图 5 多重 PCR 中不同混合引物浓度扩增结果
bp
M 1 2 3 4 5
600
1500
500
400
300
200
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7
600
1500
500
400
300
200
100
bp
M 1 2 3 4 5
600
1500
500
400
300
200
100
bp
M 1 2 3 4 5
600
1500
500
400
300
200
100
2.4 多重PCR检测限的确定
根 据 2.2 及 2.3 的 多 重 PCR 优 化 结 果， 最 终
确 定 该 反 应 的 最 优 条 件 为 ：体 系 中 加 入 Mg2+ 1.5
mmol/L、dNTP 125 μmol/L、rTaq 酶 1 U、混合引物
1 μmol/L，DNA 100 ng。反应条件为 ：退火温度为
65℃，循环数 35 个。为确定本体系的检测限，设置
了转基因含量分别为 0.9%、0.7%、0.5%、0.3% 和
0.1% 的多重 PCR 检测，图 8 中结果所示，在转基因
烟叶含量为 0.9% 的反应体系中，烟草内源基因 NR
及 3 个外源基因均得到有效扩增，但在 0.7% 含量以
下时，外源基因目的条带并不明显。因此，该多重
PCR 反应体系检测限为 0.9%。在本体系中，若内
源基因 NR 得不到有效扩增，则表明所提取的烤后
bp
M 1 2 3 4 5 6
600
1500
500
400
300
200
100
M：100 bp Ladder DNA Marker；1-5：烟叶转基因成分含量分别为 0.9%、0.7%、
0.5%、0.3% 和 0.1% ；6 ：非转基因烟叶
图 8 多重 PCR 中转基因含量检测限扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.768
烟叶 DNA 可能含有 PCR 反应抑制物，即外源基因
无特异扩增条带时也不能说明该样品便是转基因阴
性的。
3 讨论
多重 PCR 是在同一体系中加入多对引物进行
扩增，不同引物浓度及比例、Mg2+、dNTP 等都会对
PCR 结果造成不同程序的影响，因此设计引物时要
充分考虑各引物扩增片段大小、相互干扰、退火退
度等，在选择引物时需用分子生物学软件进行筛选，
同时需要对反应体系及条件进行优化［9］，由于烤后
烟叶 DNA 降解严重，DNA 提取质量是 PCR 检测的
关键［10］，否则会得到假阴性结果，因此用多重 PCR
检测烤后烟叶转基因成分时，有必要对内源基因同
时进行 PCR 扩增，我们选择了烟草内源硝酸还原酶
基因 NR 作为内源参照基因［3］，以判断所提取 DNA
是否适于 PCR 反应。
本实验所建立的多重 PCR 体系为定性检测，在
烤后烟叶转基因检测中具有较好的复重性和稳定性，
检测极限为 0.9%，而在有关多重定性 PCR 检测转
基因作物的报道中［11，12］，仅对所测靶标进行定性检
测，并未明确提出其检测限，在提到检测限的文献中，
邱良焱等［5］所建立的多重 PCR 体系检测限为 0.9%，
Guo 等［13］检测限为 80 个拷贝，烟草的基因组约 10
pg DNA［14］，按此推算，本实验检测灵敏度为 90 个
拷贝，与其他学者的检测极限基本相符。
值得指出的是，使用不同的阳性对照材料对检
测极限会有不同极限值，本实验中所使用的转基因
阳性烟叶为 T3 代，Southern 检测为单拷贝的材料，
但在严格的外源转基因检测中，用于定量的阳性植
物材料应是拷贝数单一且稳定，不显示等位基因变
化的 DNA 序列来作为阳性对照［15］，因此，在目前
尚未有烤后烟叶转基因 PCR 检测标准物质的情况下，
本实验中的检测极限还需多家单位进行协同实验。
4 结论
以烤后烟叶为材料，建立了在一个 PCR 反应
管内便能同时检测烟草内源基因 NR、外源基因 35S
启动子、NOS 终止子及 NPT II 筛选标记基因的多重
PCR 方法，初步建立的体系检测限为 0.9%（V/V），
为烤后烟叶转基因成分筛查提供了技术支撑。
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（责任编辑 狄艳红）