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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
胚 胎 干 细 胞（embryonic stem cells，ESCs） 是
一种未分化的具有自我更新能力的细胞，在胚胎发
育和基因功能研究、药物筛选和新药开发、转基
因动物种质培育以及组织修复和细胞治疗等领域
显示出巨大优势和应用前景［1-3］。自 1996 年 Pain
等［4］首次在体外长期培养禽类胚胎干细胞（chicken
embryonic stem cells，cESCs）获得成功以来，分离
和培养禽类多能干细胞已成为转基因禽培育、珍稀
禽类保种和脊椎动物早期发育研究模型制备的重要
收稿日期 ：2013-01-22
基金项目 ：“重大新药创制”科技重大专项课题（2012ZX09301003-001-005）
作者简介 ：何文俊，男，博士，研究方向 ：干细胞与再生医学 ；E-mail ：520hewenjun@163.com
通讯作者 ：陈昭烈，研究员，研究方向 ：细胞工程 ；E-mail ：chenzl23@sina.com
鸡胚胎干细胞的体外培养和鉴定
何文俊1，2  刘红1  叶玲玲1  李世崇1  王启伟1  陈昭烈1
（1. 军事医学科学院生物工程研究所细胞工程研究室，北京 100071 ；2. 解放军总医院第一附属医院
创伤外科研究室，北京 100048）
摘 要 ： 从鸡 X 期胚胎中分离胚盘细胞，以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）为滋养层，高糖
DMEM 为基础培养基并添加 10 ng/mL bFGF、20 ng/mL hIGF-1、2 ng/mL mSCF、2 ng/mL hIL-11 和 1 000 U/mL LIF 等细胞因子对细
胞进行培养，获得典型的呈集落生长的鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells，cESCs）克隆。免疫组化显示，呈集落生长
的 cESCs 克隆具有较高的内源性 AKP 活性并表达多能性标志 SSEA-1 和 Oct-4。RT-PCR 分析进一步证实其表达 cESCs 特异性基因
cENS-1。结果表明，该培养体系可用于 cESCs 的分离并维持其在体外生长并保持未分化状态。
关键词 ： 鸡 胚胎干细胞 胚盘细胞 体外培养 鉴定
Culture and Characterization of Chicken Embryonic
Stem Cells in vitro
He Wenjun1，2 Liu Hong1 Ye Lingling1 Li Shichong1 Wang Qiwei1 Chen Zhaolie1
（1. Department of Cell Engineering，Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071 ；2. Wound Healing
and Cell Biology Laboratory，the First Affiliated Hospital，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048）
Abstract:  The blastoderm cells isolated from the stage X embryos of chicken were cultured on feeder layer of mouse embryonic fibroblasts
（MEF）with high glucose DMEM supplemented with 10 ng/mL bFGF, 20 ng/mL hIGF-1, 2 ng/mL mSCF, 2 ng/mL hIL-11 and 1 000 U/mL LIF.
Typical chicken embryonic stem cells（cESCs）colonies with high endogenous AKP activity were observed in the culture system. The cESCs
derived from blastoderm cells expressed pluripotent markers SSEA-1 and Oct-4 as determined by immunocytological analysis. RT-PCR analysis
further confirmed the expression of cENS-1, a gene specifically expressed in cESCs and early embryo. These results demonstrate the feasibility
for using the culture system in isolating cESCs from the stage X chicken embryos and supporting the growth of cESCs with undifferentiating state
in vitro.
Key words:  Chicken Embryonic stem cells Blastodermal cells In vitro culture Characterization
前提［5-7］。随着近年来由禽类胚胎干细胞衍生细胞
系被越来越多地用作治疗性抗体和病毒疫苗的生产
系统，禽类胚胎干细胞分离、培养和建系再次成为
干细胞研究和应用的热点［8-10］。
由于禽类具有独特的生殖生理特点和胚胎发育
过程，鸡的受精卵排出体外时处于胚胎发育的 X 期。
X 期胚胎中的胚盘细胞具有发育的全能性，且能参
与各种组织的形成，从 X 期胚胎中可能会培养出多
能性细胞。本研究从 X 期的鸡胚中分离胚盘细胞，
2013年第7期 95何文俊等 ：鸡胚胎干细胞的体外培养和鉴定
旨在获得典型的呈集落生长的鸡 ESCs 克隆并在体外
培养体系中保持未分化状态。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 白来杭鸡种蛋购自中国农业科学
院北京畜牧兽医研究所。昆明白孕小鼠（孕期 14-
16 d）购自军事医学科学院实验动物中心。
1.1.2 主 要 试 剂 高 糖 DMEM、 胎 牛 血 清（fetal
bovine serum，FBS）、鸡血清、100× 非必需氨基酸
和 TRIzol 购 自 Invitrogen 公 司 ；胰 蛋 白 酶、HEPES
购自 Hyclone 公司，明胶、β-巯基乙醇和 DAPI 购自
Sigma 公司 ；白血病抑制因子（LIF）和 100× 核苷
购自 Millipore 公司，丝裂霉素 C 和链霉蛋白酶购自
Roche 公司，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）购自北京
化学试剂公司，bFGF、hIGF-1、mSCF 和 hIL-11 购
自 Peprotech 公司，抗 SSEA-1 单克隆抗体购自 Santa
Cruz 生物技术公司，抗 Oct-4 多克隆抗体购自 Cell
Signaling 公司，RT-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司。
1.1.3 仪器设备 CO2 培养箱购自 Thermo Forma 公
司，超净工作台购自上海力申科学仪器有限公司，
超纯水制备机购自 MILLI-Q 公司，倒置相差显微镜
和荧光显微镜购自 Nikon 公司，激光扫描共聚焦显
微镜购自 Zeiss 公司，PCR 仪购自 Biometra 公司，电
泳仪购自北京市六一仪器厂，凝胶成像采集系统购
自 United-Bio 公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 处死
孕期 14-16 d 的昆明白孕小鼠，无菌条件下取出胚
胎后去其头部和内脏，PBS 充分洗涤，将其剪碎后
用胰酶溶液（0.25% 胰酶 +0.04% EDTA）分阶段消
化，适时终止消化，吸取上层悬液并离心收集细胞，
计数后以 5×105 cells/mL 重悬于小鼠胚胎成纤维细
胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）生长培养基
（DMEM，10% FBS），接种于 100 mm 组织培养皿中，
37℃孵育至细胞长满。细胞传至第 2 代时，用 10
μg/mL 的丝裂霉素 C 处理 2 h，PBS 冲洗 3 次，加入
适量胰酶溶液消化，收集细胞，重悬于 MEF 生长培
养基中，以 104 cells/cm2 接种于 0.1% 明胶包被的 24
孔培养板中。
1.2.2 X 期胚盘细胞的分离 参照文献［11，12］
使用纸环法分离获得胚盘细胞。取新鲜的未孵化的
白来杭鸡种蛋，新洁尔灭浸洗后再用 75% 酒精消毒。
在超净工作台内小心剥去蛋壳，将卵黄从蛋清中分
离出来。辨别卵黄上的胚盘位置，使胚盘朝上放置，
剪一小块正方形的滤纸，在其中央打一个圆形的孔，
并将其轻轻放在卵黄上，使胚盘暴露在孔的中央。
在滤纸周边剪开卵黄膜，然后将滤纸从卵黄上轻柔
地提起，将贴附有胚胎的滤纸缓慢垂直浸入 PBS 中，
清除胚胎上的卵黄，分离整个胚盘，将其收集到离
心管中，PBS 漂洗，1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞。
1.2.3 cESCs 的培养 参照 van de Lavoir 等［11］和陈
胜峰等［13］的方法并加以改进。X 期胚盘细胞用 ESC
生 长 培 养 基（DMEM、10% FBS、2% 鸡 血 清、1%
非必需氨基酸、1% 核苷、10 mmol/L HEPES、0.16
mmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL 青霉素 / 链霉素、10
ng/mL bFGF、20 ng/mL hIGF-1、2 ng/mL mSCF、2
ng/mL hIL-11、1 000 U/mL LIF）重悬，机械吹打后
以 1 个胚盘 /cm2 的细胞密度接种到 MEF 滋养层上。
每天换液，细胞长满时，用 0.025% 链霉蛋白酶消化
传代，PBS 漂洗后接种于新鲜的 MEF 滋养层上。
1.2.4 cESCs 的鉴定
1.2.4.1 碱性磷酸酶（AKP）染色 细胞用 PBS 漂洗，
冷的 4% 多聚甲醛固定 15 min，再用底物缓冲液（100
mmol/L Tris-HCl pH9.5，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L
MgCl2，0.1% Tween-20） 平 衡， 然 后 加 入 染 色 液
（75 mg/mL NBT 溶于 70% DMF，50 mg/mL BCIP 溶于
100% DMF，染色前分别取 45 μL NBT 溶液和 35 μL
BCIP 溶液溶于底物缓冲液），37℃孵育 30 min。PBS
漂洗后倒置显微镜下观察结果。
1.2.4.2 免疫荧光染色 PBS 漂洗细胞，然后加入
冷的 4% 多聚甲醛固定 15 min。PBS 漂洗，加入 0.3%
Triton X-100 作用 30 min。PBS 漂洗，加入 0.5% BSA
封闭 20 min。吸掉封闭液，加一抗 SSEA-1（1∶50）
或 Oct-4（1∶50），4℃孵育过夜。PBS 漂洗，加二
抗 FITC 标记的羊抗小鼠或兔 IgG（1∶50），室温避
光孵育 1 h。PBS 漂洗，0.1 μg/mL DAPI 复染细胞核
15 min，荧光显微镜下观察。
1.2.4.3 RT-PCR TRIzol 裂解细胞，进行总 RNA 的
提取，具体操作参照 TRIzol 试剂说明书。RT-PCR
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期96
反应总体系 50 μL，RNA 样品各 1 μg，引物序列见
表 1，条件为 50℃反应 30 min。接着进行 PCR 扩增，
程序为 ：94℃预变性 5 min ；95℃变性 30 s，62℃退
火 30 s，72℃延伸 1 min，10 个循环；95℃变性 30 s，
57℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，10 个循环 ；95℃变
性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，20 个循环；
最后再 72℃延伸 5 min。取 5 μL PCR 产物进行 1%
琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪保存图像。
表 1 RT-PCR 引物序列
基因名称 上游引物（5-3） 下游引物（5-3） 片段长度（bp）
cENS-1
GATCTAGATCCTC-
AAATGAAT
TCTTGGGCAACCT-
CTCCCC
594
β-actin
AACACCCCAGCCA-
TGTATGTA
TTTCATTGTGCTA-
GGTGCCA
597
2 结果
2.1 cESCs的培养
鸡Ⅹ期胚盘细胞在 MEF 滋养层上培养 24 h，倒
置显微镜下可见散在分布的圆形或椭圆形细胞集落，
其上附有卵黄颗粒和脂滴（图 1-A）；培养 4 d 后，
细胞集落明显增大、与 MEF 的边界清晰，形成类似
早期胚胎组织的拟胚体，集落内的 cESCs 彼此紧密
接触，界限不清（图 1-B）。cESCs 在体外培养的第
2-4 d 增殖旺盛，此后逐渐进入平台期，原代 cESCs
的体积较小，细胞核相对较大，胞质相对很少。
2.2.2 免疫荧光染色 SSEA-1（stage-specific embry-
onic antigen 1） 是 早 期 胚 胎 阶 段 特 异 性 细 胞 表 面
抗原，转录因子 Oct-4 可能是脊椎动物不同发育阶
段多潜能细胞所特有的特异调控分子，是公认的胚
胎干细胞相关标志。ESCs 特异性标志的免疫荧光染
色显示原代 cESCs 表达 SSEA-1（图 3-B）和转录因
子 Oct-4（图 3-D）。激光共聚焦显微镜（图 4）显
示，SSEA-1 表 达 于 细 胞 膜 上，Oct-4 表 达 于 细 胞
质中。
A B
A ：培养 24 h ；B ：培养 4 d
图 1 在 MEF 滋养层上生长的原代 cESCs（100×）
2.2 cESCs的鉴定
2.2.1 AKP 染色 AKP 的存在是细胞保持未分化状
态的一个重要标志。采用 BCIP/NBT 碱性磷酸酶显
色试剂盒检测集细部落中 cESCs 的 AKP 表达，染色
阳性的细胞呈棕红色，阴性细胞不着色，证实集落
中大部分的细胞保持未分化状态（图 2）。
图 2 原代 cESC 的 AKP 染色鉴定（100×）
A B
C D
A，C ：原代 cESC 的相差显微镜观察 ；B ：图 A 中原代 cESC 的 SSEA-1 免疫
荧光染色鉴定 ；D ：图 C 中原代 cESC 的 Oct-4 免疫荧光染色鉴定
图 3 原代 cESC 的免疫荧光染色鉴定（100×）
2.2.3 cENS-1 的 RT-PCR 分析 鸡胚胎正常干细胞
基因（chicken embroynic normal stem cell gene，cENS）
是 cESCs 和鸡早期胚胎特异表达的基因家族，包括
cENS-1、cENS-2 和 cENS-3。cENS-1 的 RT-PCR 分
析（图 5）显示，原代 cESCs 和 X 期胚盘细胞表达
cENS-1，鸡胚成纤维细胞不表达 cENS-1。
2013年第7期 97何文俊等 ：鸡胚胎干细胞的体外培养和鉴定
3 讨论
cESCs 大多数来源于 X 期未孵化的明区胚盘细
胞［11］。胚盘提取时，在保证胚盘完整的情况下应尽
快将其取出并放入到 PBS 中以除去卵黄和卵黄膜，
得到用于培养的胚盘细胞。刚取出的胚盘细胞间粘
连作用并不是很强，在原代分离时不易用胰蛋白酶
消化，一般借助于机械吹打就可以将细胞分离开来。
而经一段时间的体外培养后细胞间的粘连作用增强，
此时需要借助胰蛋白酶的作用同时辅以机械剥离将
cESCs 分散［14，15］。在 cESC 的传代过程中，一般将
细胞集落分散为 20-40 个细胞的小细胞团并以一定
密度接种，有助于发挥细胞间的协同作用，防止细
胞分化，促进克隆生长。本研究在 cESC 的传代过
程中用链霉蛋白酶替代胰酶消化传代 cESC，不需辅
以机械剥离或过度机械吹打就能有效地分散 cESC。
cESCs 体外培养的关键是保证其维持未分化状
态，常用的方法是合理设计基础培养基、采用滋养
层细胞以及添加细胞因子。cESCs 对能量与营养的
要求很高，故选用高糖 DMEM 为基础培养基，同时
在培养基中添加 L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需
氨基酸、核苷酸等物质。滋养层在 cESCs 的培养过
程中起着重要的作用，既可促进 cESCs 贴壁生长，
又可分泌各种因子抑制 cESCs 分化［16，17］。用于制
作滋养层的细胞主要有 STO 细胞、MEF、同源动物
胚胎成纤维细胞等。小鼠 ESCs 成功建立以来，MEF
被广泛用于多种动物的 ESCs 培养，很多培养基和细
胞因子的添加都是针对 MEF 设计的。此外，cESCs
的生长还需依赖特定的生长因子和细胞因子，如
bFGF、SCF 和 LIF 等。bFGF 和 SCF 可刺激细胞增
殖并防止细胞分化［18，19］。LIF 因子是目前广泛采用
的一种细胞分化抑制因子，对小鼠 ESCs 的生长至关
重要，在维持 cESCs 的多能性特征中也是必需的［17］。
另一个细胞因子 LIF 的家庭成员 IL-11，也有利于鸡
胚盘细胞维持 cESCs 样特征［19］。
基于以上考虑，本研究采用传至 2 代并经丝裂
霉素 C 处理的 MEF 为滋养层，在高糖 DMEM 培养
基中添加 10 ng/mL bFGF、20 ng/mL hIGF-1、2 ng/mL
mSCF、2 ng/mL hIL-11 和 1 000 U/mL LIF 等 细 胞 因
子组成的 cESCs 培养体系 mL。与陈胜峰等［13］和陈
致胜等［20］的同类研究相比较，这一培养体系除采
用 MEF 替代鸡胚成纤维细胞作为滋养层外，还有包
括 hIGF-1 和 hIL-11 在内的种类更为丰富的细胞因子。
研究结果表明这一培养体系能有效地支持 cESCs 的
体外生长并保持未分化状态。
ESCs 的特点是细胞小而圆，排列紧密，核质比
高，并具有较强的内源性 AKP 活性。本研究所分离
培养的 cESCs 也呈集落样生长，集落中的细胞小而
圆，排列紧密，同样具有较高的内源性 AKP 活性。
SSEA-1 表面抗原和转录因子 Oct-4 的存在是 cESCs
保持未分化状态的另一个重要指标［21］。本研究所分
离培养的 cESCs 表达 SSEA-1 和 Oct-4，表明其具有
cESCs 表型。cENS 是 cESCs 有别于其他动物细胞的
特异性基因家族［22］。cENS-1 的 RT-PCR 分析进一步
证实，本研究所培养的 cESCs 还表达鸡 cENS-1。以
上结果表明，来源于 X 期鸡胚的胚盘细胞的 cESCs
A B
C D
A ：Oct-4 ；B ：SSEA-1 ；C ：DAPI ；D ：Merge
图 4 原代 cESCs 的激光扫描共聚焦显微镜观察（1 000×）
M ：Marker ；1 ：H2O ；2 ：cESC ；3 ：St. X ；4 ：CEF
图 5 原代 cESCs 的 RT-PCR 鉴定
cENS-1
M 1 2 3 4 M
β-actin
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期98
具有与其他脊椎动物共享某些 ESCs 特征，物种间胚
胎祖细胞的这些抗原决定簇是高度保守的。
4 结论
从鸡 X 期胚胎中分离胚盘细胞，在 MEF 为滋
养层和高糖 DMEM 为基础培养基并添加 10 ng/mL
bFGF、20 ng/mL hIGF-1、2 ng/mL mSCF、2 ng/mL
hIL-11 和 1 000 U/mL LIF 等细胞因子的培养体系中
获 得 典 型 的 呈 集 落 生 长 的 cESCs 克 隆。cESCs 克
隆具有较高的内源性 AKP 活性并表达多能性标志
SSEA-1 和 Oct-4。采用培养体系能有效的自鸡 X 期
胚胎分离 cESCs 并维持其在体外生长并保持未分化
状态。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）