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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):171-176
脂肪酶（Lipase，EC.3.1.1.3，甘油三酯水解酶）［1］，
又称三酰甘油酰基水解酶，是一类特殊的酯键水解
酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘
油单酯或甘油及游离脂肪酸［2］。在食品［3］、饲料［4，5］、
生物能源（生物柴油）［6］、医药、化妆品［7］等诸多
领域有着很高的研究价值和广阔的应用前景。
微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的 pH 和
温度范围更宽，且在微生物界分布广泛，据不完全
统计，目前已有 65 个属的微生物能够产生脂肪酶［8］，
但是在这些产脂肪酶的微生物中被研究的大多为产
碱性［9］或中性［10］脂肪酶的微生物。随着近年来工
业化的应用与发展，市场上迫切需求能够大量产生
出酸性脂肪酶的微生物。酸性脂肪酶在某些工业化
领域生产中具有特殊的应用价值，如在医药工业中
收稿日期 ：2015-01-27
基金项目 ：甘肃省财政厅项目（2013NY-18）
作者简介 ：赵军，男，硕士，研究方向 ：分子生物学与生物化学 ；E-mail ：956015614@qq.com
通讯作者 ：赵淑琴，女，硕士，实验师，研究方向 ：分子生物学与生物化学 ；E-mail ：zhaosq@gsau.edu.cn
产脂肪酶嗜酸性真菌的筛选、鉴定与产酶条件优化
赵军  赵淑琴  杨孝朴  刘晓丽
（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）
摘 要 ： 旨在筛选获得高产脂肪酶菌株，并鉴定其种属及确定最佳产酶条件。从兰州城区附近采集富含油脂的土壤，通过
维多利亚蓝与罗丹明 B 培养基进行菌株分离初筛。用改进铜皂 - 分光光度法测定酶活力值进行复筛，获得一株产酶能力较强的菌
株 LZ-6。经形态学观察和分子生物学鉴定，该菌株为雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）。经单因素实验与正交实验确定该菌株的
最佳产酶条件为：酵母粉 1%、橄榄油 2%、MgSO4·7H2O 0.05%、（NH4）2SO4 0.1%、K2HPO4 0.2%、温度 30℃、pH5.0、接种量为 2%、
发酵 5 d，在此条件下，产酶活力达 13.35 U/mL，比优化前提高了 1.78 倍。
关键词 ： 真菌 ；脂肪酶 ；筛选 ；鉴定 ；优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.027
Screening and Identification of Eosinophilic Fungal Strain Producing
Lipase and Optimization of Its Lipase-producing Condition
Zhao Jun Zhao Shuqin Yang Xiaopu Liu Xiaoli
（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract:  This experiment was devoted to screen the strains of high-yield lipase, identify the genera, and define the optimal fermentation
conditions. The strains were preliminary screened from greasy soil nearby Lanzhou urban area through Victoria blue and rhodamine B plates. The
strains were re-screened through a copper soap spectrophotography measuring lipase activity while using emulsified olive oil as the substrate,
finally a fungal strain LZ-6 with high-yield lipase was obtained. It was identified as Actinomucor elegans through morphological observation
and molecular identification. The fermentation conditions for lipase production optimized by the single factor experiments and the orthogonal
experiments with strain LZ-6 were ：yeast powder 1%, olive oil 2%, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.1%（NH4）2SO4, 0.2% K2HPO4, fermentation
temperature at 30℃, pH5.0, 2% inoculums volume, and fermentation time of 5 days ；under the optimal condition, the lipase activity of strain
LZ-6 reached 13.35 U/mL, it increased 1.78 times as before optimization.
Key words:  fungi strain ；lipase ；screening ；identification ；optimization
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10172
酸性脂肪酶适宜在胃肠等酸性条件下发挥作用，可
用于治疗胃肠紊乱，消化不良等疾病。在食品加工
业中，酸性脂肪酶在适当条件下生成低级脂肪酸，
可改善食品风味，增加食品香味等。在饲料加工业
生产中，酸性脂肪酶可提高动物对饲料中脂肪成分
的利用率。对于脂肪酶在工业应用中的价值及应用
中需要的特殊酶学性质，寻找出一株能够产生出酸
性脂肪酶的高产菌株，在脂肪酶的研究应用中有重
要价值。本研究从富含油脂的土壤中，筛选出一株
在酸性条件下能够产生出脂肪酶的真菌菌株，同时
对该菌株的产酶条件进行优化，获得其最适产酶条
件，旨在为后续的产酸性脂肪酶菌株的菌种改良及
酸性脂肪酶的开发、生产及应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源 兰州周边县区饭店抽油烟机下的
油污土壤，猪蹄店、烧烤摊等门前的油污土壤及甘
肃农业大学校外餐馆与校内的餐厅油污污染的土壤
中分离得到。
1.1.2 培养基 培养基的配制见参考文献［11，12］。
1.2 方法
1.2.1 菌株的筛选 将采集的土壤进行富集培养，
平板分离初筛（选用维多利亚蓝、中性红、罗丹明
B 3 种指示剂）和摇瓶发酵复筛。初筛时用 3 种显色
培养基进行培养，待菌落长出后，挑选水解圈较大
的菌落为目的菌种，进行多次分离培养，直至显微
镜下观察无其它杂菌时，方可判断为较纯菌种，然
后接种于菌种保藏培养基置于 -70℃冷藏。复筛时用
初筛得到水解圈较大的纯菌种，接种于种子培养基
中 200 r/min 适温培养 24 h 之后转接到复筛培养基中，
200 r/min 适温振荡培养 72 h。通过复筛选出产酶能
力强的菌株，便于进行下一步的实验。
1.2.2 脂肪酶活力的测定 采用改进铜皂 - 分光光
度法［13］测定脂肪酶活力。
脂肪酶酶活力单位定义为 ：在一定条件下，每
分钟释放出 1 μmol 脂肪酸所需要的酶量定义为 1 个
脂肪酶国际单位（U）［14］。
1.2.3 菌种鉴定
1.2.3.1 形态学鉴定 将分离纯化的菌株接种在固
体平板培养基上，培养一定时间后观察菌落的形态、
颜色、是否产生色素等特征，根据《真菌鉴定手
册》［15］进行初步鉴定。
1.2.3.2 分子生物学鉴定 以菌株 LZ-6 基因组 DNA
为模板，采用真菌 ITS 序列通用引物［16］，如 ITS1（序
列为 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和 ITS4（序
列 为 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3） 进 行 PCR
扩增，PCR 扩增产物送苏州金唯智生物科技有限公
司进行测序，将所得序列与 GenBank 数据库中序列
进行 Blast 分析比对，并构建系统进化树。
1.2.4 产脂肪酶菌株的发酵条件的优化
1.2.4.1 单因素实验 通过单因素实验确定产脂肪
酶菌株的最佳氮源、温度、pH 值、接种量。
1.2.4.2 正交实验 根据单因素实验结果对产酶的
影响，为筛选出最优的产酶组合采用正交实验表
L9（3
4）设计正交实验［17］。为减小实验误差，在单
因素实验与正交实验中针对不同因素设置的不同梯
度均做 3 个平行实验。
2 结果
2.1 菌种筛选
在采集 40 份油污土壤样品中经富集、涂布平板
后分离得到 12 株产脂肪酶菌株，通过摇瓶发酵复筛
得到产酶能力较强的菌株一株，命名为 LZ-6，测定
其酶活力值为 7.49 U/mL。该菌在维多利亚蓝筛选培
养基上形成明显水解圈（图 1），故选 LZ-6 作为实
验研究菌株。
图 1 菌株 LZ-6 在维多利亚蓝平板上的水解圈
2.2 菌株鉴定
2.2.1 形态学鉴定 菌株 LZ-6 在罗丹明 B 平板培养
基上 28℃培养 2-5 d。菌落迅速生长，单个菌落近
似圆形，表面湿润，中心颜色较深，菌落初期为白色，
2015,31(10) 173赵军等：产脂肪酶嗜酸性真菌的筛选、鉴定与产酶条件优化
后期长出菌丝变为灰褐色直至黑色，菌丝宽约 5-7
μm（图 2），镜下观察菌丝无横隔，有侧生菌丝，菌
丝柄处可见单个或聚集成堆大小不等的椭圆形、球
型、壁薄、光滑的孢囊孢子，孢子直径约为 3-4 μm
（图 3）。结合以上 LZ-6 菌落形态观察，符合毛霉菌
的相关描述，初步确定 LZ-6 为毛霉。
将得到的扩增序列在 NCBI 网站上进行序列同
源性比对。取与 LZ-6 菌一致性在 99% 以上的序列，
用 MEGA5.0 进行多序列比对并构建基因进化树。
结 果（ 图 5） 显 示， 菌 株 LZ-6 与 菌 株 Actinomucor
elegans（AB113008.1、AM745431.1、JN887460.1、
JN943000.1）位于同一族群，亲缘关系最近，表明
菌株 LZ-6 属于毛霉属的雅致放射毛霉（Actinomucor
elegans）。
图 2 菌株 LZ-6 在罗丹明 B 培养基上的菌落形态
M ：DNA Marker ；1 ：LZ-6 菌株 PCR 产物
图 4 LZ-6 菌株 PCR 产物电泳 图 6 氮源对产酶的影响
图 5 LZ-6 菌株的 ITS rDNA 系统发育树图 3 菌株 LZ-6 在显微镜 10×100 倍下的形态
2.2.2 菌 株 的 分 子 学 鉴 定 以 菌 株 LZ-6 的 基 因
组 DNA 为模板，采用真菌 ITS 序列通用引物 ITS1、
ITS4 进行 PCR 扩增，结果（图 4）显示，在 750 bp
处有一条特异性条带。PCR 产物测序结果表明，片
段大小为 726 bp，符合 ITS 序列特征。
M
2000
bp
2000
1000
750
500
250
100
1
Actinomucor elegans AM745432.1
Actinomucor elegans AY492089.1
Actinomucor elegans AM745430.1
Actinomucor elegans FJ176396.1
Actinomucor elegans AB470907.1
Backusella circina JQ979467.1
Backusella circina JQ979466.1
Mucor mucedo EF059908.1
Mucor mucedo EF059907.1
Actinomucor elegans AY492091.1
Actinomucor elegans AY986469.1
Actinomucor elegans JQ683220.1
Actinomucor elegans AB113008.1
LZ-6
Actinomucor elegans AM745431.1
Actinomucor elegans JN887460.1
Actinomucor elegans JN943000.1
0.001
2.3 菌株产酶条件的优化
2.3.1 单因素实验
2.3.1.1 氮源对 LZ-6 菌株产酶的影响 将菌株在 6
种不同的氮源培养基中进行发酵培养，分别测其发
酵液中脂肪酶的活力值。结果（图 6）表明，菌株
在这 6 种发酵培养基中，酶活力值最高的为酵母粉，
0
2
4
6
8
10
䞥⇽㊹ 㳻ⲭ㜘 ⢋㚹㞿 ⺛䞨䬥 䫬䞨䬥 㝢䞦⍫٬ U·mL-1  ≞Ⓚ⿽㊫
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10174
其次为蛋白胨。因此可知 LZ-6 菌株发酵产酶最适氮
源为酵母粉，与刘光［18］的报道结果相一致。
2.3.1.2 温度对 LZ-6 菌株产酶的影响 设置 26℃、
28℃、30℃、32℃、34℃、36℃六种不同温度梯度，
在这 6 种温度下分别测发酵液中的酶活力值，结果
（图 7）显示，该菌株的适宜产酶温度范围为 30℃-
32℃，30℃时达到最高。
表 1 正交实验因素水平
水平
因素
A 酵母粉 /（g·L-1） B 温度 /℃） C pH D 接种 /%
1 10 28 4 1
2 15 30 5 2
3 20 32 6 3
表 2 正交试验设计
序号 A B C D 酶活值 /（U·mL-1）
1 1（10） 1（28） 1（4） 1（1） 0.3050±0.02
2 1（10） 2（30） 2（5） 2（2） 13.3496±0.34
3 1（10） 3（32） 3（6） 3（3） 4.9301±0.37
4 2（15） 1（28） 2（5） 3（3） 8.6743±0.27
5 2（15） 2（30） 3（6） 1（1） 4.6429±0.18
6 2（15） 3（32） 1（4） 2（2） 0.2013±0.07
7 3（20） 1（28） 3（6） 2（2） 4.8539±0.39
8 3（20） 2（30） 1（4） 3（3） 0.1779±0.01
9 3（20） 3（32） 2（5） 1（1） 10.1342±0.14
K1 18.5847 13.8332 0.6842 15.0821
K2 13.5185 18.1704 32.1581 18.4048
K3 15.1660 15.2656 14.4269 13.7823
T1 6.1949 4.6111 0.2281 5.0274
T2 4.5062 6.0568 10.7194 6.1349
T3 5.0553 5.0885 4.8090 4.5941
R 1.6887 1.4457 10.4913 1.5408
对表 2 中的数据进行直观分析，得知各因素的
极差大小 RC>RA>RD>RB，影响脂肪酶产生的各因素
的主次顺序为 ：C（pH）>A（温度）>D（酵母粉）
>B（接种量）。结合 SPSS 软件中 Duncana 方差分析
法筛选最优组合，可知当酶活力值为 13.349 6 U/mL
时所对应的组合 C2A1D2B2 与其它组合间的差异显著
（P<0.05），最优组合为 ：C2A1D2B2 ，即 pH 为 5、温
度 30℃、酵母粉 10 g/L、接种量为 2% 。在此组合
下酶活力值为 13.349 6 U/mL，比优化前提高 1.78 倍。
0
2
4
6
8
10
12
26 28 30 32 34 36
䞦⍫٬ U·mL-1  ⑙ᓖć
图 9 接种量对产酶的影响
图 8 pH 值对产酶的影响
图 7 温度对产酶的影响
2.3.1.3 pH 对 LZ-6 菌株产酶的影响 将菌株在不同
pH 值的发酵培养基中进行培养，分别测定发酵液中
脂肪酶的活力，结果（图 8）表明当发酵液中的 pH
值为 5 时，LZ-6 菌株的酶活力值达到最大。
0
1
2
3
4
5
4 5 6 7 8 9 10
䞦⍫٬ U·mL-1 
pH٬
2.3.1.4 接种量对 LZ-6 菌株产酶的影响 将菌株按
照不同的接种量，接种于发酵培养基中进行培养，
分别测定发酵液中脂肪酶的活力，结果（图 9）表
明当接种量为 2% 时，该菌株酶活力值达到最大。
2.3.2 正交实验 根据单因素的实验结果，选取酵
母粉、温度、pH 值、接种量 4 种因子，根据其设
置的不同梯度，采用正交表 L9（3
4）进行正交实验，
摇床振荡培养 5 d，以酶活值为指标，探讨产酶培养
基中的最优组合。结果见表 1 和表 2。
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10
䞦⍫٬ U·mL-1  ᧕⿽䟿%
2015,31(10) 175赵军等：产脂肪酶嗜酸性真菌的筛选、鉴定与产酶条件优化
3 讨论
3.1 高产酶菌株的筛选与鉴定
产脂肪酶的微生物分布广泛，主要存在于细菌、
真菌及放线菌中，近年来随着工业化的生产及社会
发展的需要，国内外对产脂肪酶菌株的报道也越来
越多，但多集中在细菌及放线菌上，而真菌报道较
少，目前主要集中在青霉属［19］、酵母属［20］、根霉
属［21］、曲霉属［22］上。因此筛选出一株能够产酸性
脂肪酶的真菌，成为微生物脂肪酶工业化生产中的
迫切需求。本实验通过分离筛选，获得产脂肪酶菌
株，根据 ITS 区基因序列的测序比对，同时结合形
态学鉴定，确定该菌为毛霉属雅致放射毛霉。目前
关于毛霉属菌株的报道主要集中在该属菌株所产的
蛋白酶［23］上，对该属菌株产脂肪酶的研究报道甚
少，而且该菌株具有耐酸性，易成活，发酵成本低
等优势，尤其是在食品加工业［24］上该菌株具有较
大的应用前景与研究价值。
3.2 产脂肪酶菌株的酶活力测定
脂肪酶活力的检测，是脂肪酶在工业生产及科
学实验中的一个重要指标，同时又是脂肪酶产生菌
筛选过程中的一个关键步骤。目前检测脂肪酶活力
的方法有多种，但常用的主要为以下 3 种 ：碱滴定
法［25］、对硝基苯酚法［26］、铜皂法［27］。碱滴定法在
使用时不好掌握其用量，其精确性及合理性常遭人
质疑，而对硝基苯酚法与铜皂法在实验操作中因使
用大量的苯而易对环境造成污染，同时又对人体造
成伤害。本实验采用改进后铜皂 - 分光光度法进行
脂肪酶活力检测，具有较高的精确性与稳定性，在
脂肪酸萃取过程中用异辛烷代替苯，大大降低了实
验过程中对环境造成的污染及对人体造成的伤害。
3.3 不同条件对产酶菌株的影响
氮源对菌株产酶活性的影响，一些研究报道中
多采用蛋白胨为最佳氮源，而本实验中真菌 LZ-6 菌
株以酵母粉为最佳氮源，其产酶活性明显高于蛋白
胨，出现此种原因，可能是因菌株种类不同所导致。
实验中 LZ-6 菌株的适宜发酵产酶温度为 30℃，与
陈文强等［28］报道的真菌的发酵温度在 30℃左右相
一致。本实验中菌株的适宜发酵 pH 值为 5，低于马
宏瑞等［29］报道的 Teratosphaeriaceae Cr12 菌株的最
适发酵 pH 值 5.5，充分显示了该菌株的耐酸性。实
验中接种量为 2% 时酶活力值为最大，当高于 2% 时，
酶活力值下降，可能是由于高接种量导致菌群繁殖
过快，制约了菌株的产酶能力。本实验分离出的嗜
酸性菌株通过单因素实验与正交实验对其产酶条件
进行优化，寻找出最优产酶组合，与其他工业用产
脂肪酶菌株比较，该菌株产酶量相对较低，有待通
过相关诱变方法，基因克隆与表达等操作，进一步
提高产酶量，为酸性脂肪酶的开发、生产及应用奠
定基础。
4 结论
获 得 一 株 嗜 酸 性 产 脂 肪 酶 真 菌， 通 过 形 态
学观察与分子生物学鉴定该菌株为雅致放射毛霉
（Acinomucor elegans）。产酶最佳条件为 ：酵母粉 1%、
橄榄油 2%、MgSO4·7H2O 0.05%、（NH4）2SO4 0.1%、
K2HPO4 0.2%、 温 度 30℃、pH5.0、 接 种 量 为 2%、
发酵 5 d。通过正交实验该菌株 LZ-6 的产酶活力比
优化前提高 1.78 倍。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）