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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):97-102
海岛棉是纤维品质最优的栽培棉种，新疆是我
国唯一的海岛棉商业化生产基地［1］。组织培养以及
以此为基础的转基因技术可充分利用自然界的遗传
资源和加快育种进程等优势，为我国棉花产业的发
展提供了一条新的途径。与其他作物相比，棉花组
织培养仍存在体细胞胚胎发生率低、培养周期长、
畸形胚频率高等方面的问题［2］，目前的研究主要是
针对陆地棉［3］、克劳茨基棉［4］等棉种的再生体系，
而海岛棉是目前报道可再生棉花品系中较难再生的
一种，我国报道的可再生海岛棉品系数量更为有限。
本研究在前人［5-7］的基础上，以 6 个新疆主栽
海岛棉品系为材料，研究激素对诱导愈伤组织和体
收稿日期 ：2015-03-09
基金项目 ：国家转基因生物新品培育重大专项（2013ZX08005-004，2013ZX08005-005）
作者简介 ：丁喜莲，女，硕士研究生，研究方向 ：棉花基因工程 ；E-mail ：dxh620@163.com
通讯作者 ：陈全家，男，教授，研究方向 ：作物遗传育 ；E-mail ：chqjia@126.com
六个海岛棉品系体细胞胚胎发生及再生体系的研究
丁喜莲  曲延英  李琼  郭家雁  陈全家
（新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052）
摘 要 ： 以海岛棉 DJ-1（373）、天长 2 号（376）、5917（380）、阿长 -599（381）、塔 07-152（383）、S0717（408）6 个品
系的下胚轴为外植体，通过双因素随机区组设计的方法筛选出的两组最佳激素组合，诱导出愈伤组织，并成功获得再生植株。研
究结果表明，0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT 为海岛棉 380、383 和 381 愈伤组织最佳诱导条件，0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT 为海岛棉
373、376 和 408 愈伤组织最佳诱导条件 ；诱导出的愈伤组织接种于 KNO3 加倍的培养基可产生胚性愈伤组织 ；将其接种于含有 0.1
mg/L KT 和 0.05 mg/L IBA 的培养基中可促进体细胞胚胎的发生和成熟，利用畸形苗的培育可缩短再生体系的周期，6 个品种在 6-8
个月内均能获得再生植株。
关键词 ： 海岛棉 ；激素组合 ；胚性愈伤
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.016
The Study of Regeneration System from Different Sea Island Cotton
（Gossypium barbadense L.）Cultivars
DING Xi-lian QU Yan-ying LI Qiong GUO Jia-yan CHEN Quan-jia
（College of Agriculture，Xinjiang University，Urumqi 830052）
Abstract: The hypocotyls of 6 sea island cotton cultivars, i. e. , DJ-1（373）, Tianchang 2（376）, 5917（380）, Achang-599（381）,
Ta 07-152（383）, and S0717（408）were used as explant materials ；calli were successfully induced with two optimized combinations of
plant growth regulator（PGR）screened by the method of double factors randomized block, and the plants were regenerated successfully. The
results showed that, the best PGR combination to induce callus for 380, 383, and 381 was 0.1 mg/L 2, 4-D + 0.1 mg/L KT, while that for 373,
376, and 408 was 0.3 mg/L NAA + 0.1 mg/L KT. The induced calli inoculated into the medium of double KNO3 generated embryogenic ones, and
inoculating them into the medium of 0.1 mg/L KT and 0.05 mg/L IBA promoted the somatic embryogenesis and their maturing. The culture of
malformed seedlings shortened the cycle of regeneration system, and the regenerated plants were all obtained from 6 cultivars in 6 to 8 months. A
stable and efficient regeneration system without genotype limit was established.
Key words: sea island cotton ；plant growth regulator ；embryogenic callus
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.198
细胞胚胎发生能力的影响，旨在获得体细胞胚胎和
再生植株，为拓宽海岛棉再生体系基因型奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 新疆海岛棉品系 ：DJ-1（373）、
天 长 2 号（376）、5917（380）、 阿 长 -599（381）、
塔 07-152（383）、S0717（408），材料均由新疆农业
大学生物技术重点实验室提供。
1.1.2 基本培养基配方 海岛棉再生体系基本培养
基配方见表 1。培养基各成分均按比例溶解均匀，
所用的激素和氨基酸均在灭菌前加入，配置好的
培 养 基 用 2 mol/L NaOH 调 节 pH 至 5.8-6.0，121℃
高压蒸汽灭菌 20 min。所有培养物均置于培养室
（28±2℃，光照强度 2 000 Lx，16 h 光照）培养。
表 1 海岛棉愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生培养基配方表
培养基 基础培养基配方
MS0 1/2 MS + 30 g/L glucose + 4.5 g/L Agar
MS1 MSB + 30 g/L glucose + 7.5 g/L MgCl2 + 1.5 g/L
gelrite + 0.1 mg/L 2，4-D + 0.1 mg/L KT
MS2 MSB + 30 g/L glucose + 7.5 g/L MgCl2 + 1.5 g/L
gelrite + 0.3 mg/L NAA + 0.1 mg/L KT
MS3 MSB + 30 g/L glucose + 7.5 g/L MgCl2 + 2.0 g/L gelrite
MS4 MSB + 30 g/L glucose + 7.5 g/L MgCl2 + 1.8 g/L gelrite + 1.9 g/L
KNO3 + 0.1 g/L Asn + 0. 1 g/L Gln
MS5 MSB（without NH4NO3）+ 30 g/L glucose + 7.5 g/L MgCl2 + 1.8 g/L gelrite + 1.9 g/L
KNO3 + 0.1 g/L Asn + 0. 1 g/L Gln
MS6 MSB + 30 g/L glucose + 6.0 g/L gelrite
注 ：MSB ：包括 MS 无机盐［8］和 B5 维生素［9］，肌醇 ；KT ：6- 糖基氨嘌呤 ；NAA ：α-萘乙酸 ；2，4-D ：2，4- 二氯苯氧乙酸 ；Asn ：天门冬酰胺 ；Gln ：谷氨酰胺
1.2 方法
1.2.1 无菌苗制备 将不同品系的种子经浓硫酸脱
绒后，用水冲洗干净晾干。取适量种子进行处理 ：
首先用 75% 酒精进行表面消毒 3 次，每次 30-45 s ；
然后在 30% H2O2 中浸泡 4-5 h 后用无菌水冲洗 4-5
遍，28℃暗培养箱中无菌水浸泡过夜，直至种子“露
白”；在无菌条件下去除种皮，将种仁接种于 MS0 培
养基中促使种子萌发，（28±2）℃暗培养 3 d 后放
于培养室中继续培养 3 d，获得 6 d 龄无菌苗备用。
1.2.2 愈伤组织诱导和增殖 取下胚轴中间段，弃
去靠近子叶呈绿色及靠近胚根呈白色部位，将下
胚轴切成 0.5-0.8 cm 小段，每 6 个小段接分别种于
含 30 mL 左右的愈伤诱导培养基 MS1 和 MS2 中，每
20-25 d 于新鲜培养基继代 1-2 次。30 d 时统计各棉
花品系出愈率 ：ࠪ᜸⦷% ᧕⿽ⲴཆἽփᮠ ×100%䈡ሬࠪ᜸Ք㓴㓷ⲴཆἽփᮠ
1.2.3 胚性愈伤组织的诱导和增殖 待下胚轴与愈
伤组织产生较明显的隔离层以后，去除下胚轴，将
愈伤组织接种到分化培养基 MS3，每 12-18 d 于新鲜
培养基继代培养一次。该阶段在愈伤组织块边缘可
分化出胚性愈伤组织，称为“初生性胚性愈伤组织”，
为 6 个海岛棉品系的分化阶段建立一个“剥离胚性
愈伤”的优化处理阶段。处理 A1：在 MS4 培养基上，
将已成功获得再生品系的胚性愈伤与之放于同一培
养瓶中。处理 A2 ：将初生性胚性愈伤组织剥离接种
于 MS5 培养基上，降低 NH4
+/NO3
- 比例促进体胚发生。
30 d 后，观察统计各棉花品系的胚性愈伤组织情况。
每个培养基中的最初接种量为 0.2 g 左右，每个处理
均为 50 瓶，计算胚性愈伤组织出愈率 ：ࠪ᜸⦷% ᙫ༴⨶⬦ᮠ50 ×100%䈡ሬࠪ㜊ᙗ᜸Ք㓴㓷Ⲵ⬦ᮠ
1.2.4 不 同 海 岛 棉 品 系 胚 性 愈 伤 组 织 细 胞 学 观
察 挑选继代培养 3 次后的胚性愈伤组织，参照代
鑫［10］的方法做石蜡切片，在 Olympus 显微镜下观
察并照相。
1.2.5 体细胞胚胎的获得 将增殖后的淡黄色、颗
粒状的胚性愈伤组织转接到体细胞胚分化培养基
MS5（铺垫无菌滤纸）上，并设置不同浓度的激素组
合，CK 为对照组，C1 为 MS5+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L
2，4-D，C2 为 MS5+0.1 mg/L KT+0.05 mg/L IBA， 每
25-28 d 继代一次，继代培养 3 次后，统计体细胞胚
2016,32(1) 99丁喜莲等：六个海岛棉品系体细胞胚胎发生及再生体系的研究
胎发生数和子叶胚发生率。
1.2.6 体细胞胚胎的成熟及植株再生 将未成苗的
体细胞胚胎每 12-15 d 继代培养一次，每次继代时
将不同时期的体细胞胚胎分开培养，直至获得完整
子叶胚，将其接种到 MS6 培养基进行生根培养，获
得完整植株。
2 结果
2.1 愈伤组织的诱导和生长
外植体接种到 MS1 和 MS2 之后，4-6 d 左右两
端切口开始膨大，开始形成愈伤组织 ；30 d 后可观
察到大量的愈伤组织。本研究所用的 2 种激素组合
均可以诱导形成愈伤组织，在前期的预实验中，采
用双因素区组设计的方法分别筛选出 KT/2，4-D 与
KT/NAA 的最适浓度，结果表明 0.1 mg/L 2，4-D+0.1
mg/L KT 激素组合和 0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT 激素
组合诱导愈伤组织的效果最佳。愈伤组织诱导率在
6 个品系之间有所差异，变幅为 22%-95%（表 2）。
同一个品系在不同的激素组合处理下，诱导出的愈
伤组织状态和诱导率也有很大差异，通过实验结果
分析，KT+2，4-D 的激素组合处理下，愈伤组织多
为黄色或黄绿色，海岛棉品系 380、381 和 383 出愈
率较高，分别为 91%、89% 和 92%，且状态较好 ；
KT+NAA 的激素组合处理下，海岛棉品系 373、376
和 408 出愈率较高，分别为 95%、87% 和 92%，外
植体上有数量不等的不定根形成。
表 2 不同激素组合下 6 个棉花品系愈伤组织诱导情况
品系 培养基 外植体数 出愈率 /%
愈伤组织状况
颜色 质地
373
MS1 289 37 yellow compact
MS2 289 95 light green loose
376
MS1 293 58 yellow compact
MS2 293 87 light green loose
380
MS1 298 91 yellow green loose
MS2 298 79 yellow compact
381
MS1 244 89 light green loose
MS2 244 62 yellow compact
383
MS1 259 92 light green loose
MS2 259 85 yellow compact
408
MS1 205 22 yellow compact
MS2 205 91 yellow green loose
2.2 胚性愈伤组织的诱导和增殖
由图 1 可知，A1 处理下，6 个品系在 20-25 d
左右即可诱导出新的胚性愈伤组织，且出愈率分别
为 42%、24%、58%、34%、74% 和 78% ；而 A2 处
理下，在 40 d 左右才能观察到极少量的胚性愈伤组
织，且诱导率 0%、1%、4%、2%、6% 和 2%。因此，
将新挑出的初生性胚性愈伤组织接种到 MS4 培养基，
并在同一个培养瓶中放入已获得的其他品系的胚性
愈伤，可大大提高此棉花品系出现胚性愈伤的速度
和可能性，且此方法适用于本实验的 6 个不同基因
型的海岛棉品系 ；因此可以推断出 ：通过胚性愈伤
组织次生代谢物的影响，可以加快初生性胚性愈伤
组织向胚性愈伤组织分化的进程。
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ࠪ᜸⦷/%
373 376 380 381 383 408
A1
A2
图 1 各海岛棉品系愈伤处理情况
2.3 不同海岛棉品系胚性愈伤组织细胞学观察
由图 2 可以看出，胚性愈伤组织由胚性细胞和
非胚性细胞组成，胚性细胞边缘清晰完整，与周围
的非胚性细胞有明显的界限，细胞核明显，细胞质
浓厚，染色清晰，胚性细胞有的位于愈伤组织内部，
有的位于边缘，它处于增殖旺盛和分化的状态，有
胚胎发生能力 ；周围未分化的非胚性细胞排列疏松，
大而不规则，只能看清细胞壁，看不到明显的细胞核，
细胞液泡化程度高，细胞质少而染色浅，细胞间的
空隙较大，这类细胞虽具有增殖能力，但没有胚胎
发育能力。而且，胚性愈伤中的胚性细胞和非胚性
细胞差别较大，容易辨别。而不同基因型的海岛棉
胚性愈伤组织细胞学之间并无明显差异。
2.4 体细胞胚胎的诱导和成熟
以不加激素的 MS5 培养基为对照，进行了不同
激素组合对体细胞胚胎发生影响的研究。表 3 显示，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1100
不加激素的情况下，总胚发生数较少，子叶胚发生
率很低，最高为 7.14%，C2 处理下，总胚发生数和
子叶胚发生率均有明显提高，6 个棉花品系子叶胚
发生率分别为 14.29%、21.33%、15.25%、16.00%、
18.87% 和 14.46%。说明对于不同基因型的海岛棉品
系，添加激素均有利于诱导海岛棉体细胞胚胎发生，
KT+2，4-D 激素组合处理下，虽也能促进体细胞胚胎
发生，但效果不太明显，而 KT+IBA 激素组合则能显
著提高子叶胚发生率，缩短胚性愈伤分化为体细胞
胚胎的时间，有效地缩短了海岛棉再生体系的周期。
2.5 畸形苗的培育对海岛棉再生体系周期的影响
诱导出的体胚中有畸形苗的发生率非常高（80%
以上），将畸形苗转入 MS6 培养基，一般 30 d 左右
就会褐化死亡，将死亡的畸形苗放置在 MS6 培养基
上继续培养，会发现畸形苗的根部附近会生长出大
量胚性愈伤组织和体细胞胚胎（图 3-B），将所得胚
性愈伤及体细胞胚再次放入 MS5 培养基后所得到的
胚性愈伤再生能力强且畸形率仅为 37% 左右，使棉
花再生体系培养周期缩短 3-4 个月［7］。这一现象的
出现为缩短棉花再生体系周期提供了新的途径。
3 讨论
诱导愈伤组织是棉花组织培养的起始阶段，能
否获得活力旺盛且易分化的愈伤组织是获得棉花再
生植株的前提。棉花愈伤组织诱导的激素主要有
KT、ZT、2，4-D、NAA 和 IBA 等，生长素与细胞分
裂素的合理结合可促使状态较好愈伤组织的诱导［3］。
本研究表明不同浓度的 2，4-D/KT 和 NAA/KT 两种
激素组合均可使海岛棉诱导出愈伤组织。在愈伤组
织诱导培养基中加入 0.1 mg/L 2，4-D 和 0.1 mg/L KT，
愈伤多为淡黄色，增殖速度较，是海岛棉 380、383
和 381 愈伤组织最佳诱导条件 ；在愈伤组织诱导培
373 376 380
381 383 408
圆圈部分所示为部分胚性细胞
图 2 六个海岛棉品系胚性愈伤组织细胞学观察
表 3 不同激素组合下 6 个棉花品系体细胞胚胎发生率
品系 处理 总胚发生数 子叶胚发生率 /%
373 CK 19 5.26
C1 46 6.52
C2 84 14.29
376 CK 14 7.14
C1 32 6.25
C2 75 21.33
380 CK 21 0.00
C1 37 8.11
C2 59 15.25
381 CK 14 7.14
C1 31 6.45
C2 75 16.00
383 CK 11 0.00
C1 27 7.41
C2 53 18.87
408 CK 19 5.26
C1 27 11.11
C2 83 14.46
注 ：每个培养基最初接种量为 0.5 g 左右，每个处理 3 次重复，每次重
复为 10 瓶
A B
C D
A ：畸形苗转接到 MS6 培养基 ；B ：畸形苗根部出现大量的胚性愈伤和体胚 ；
C ：体胚形成 ；D ：再生苗的生成
图 3 畸形苗的培育过程
2016,32(1) 101丁喜莲等：六个海岛棉品系体细胞胚胎发生及再生体系的研究
养基中 0.3 mg/L NAA 和 0.1 mg/L KT，愈伤多为淡绿
色，增殖速度较慢，易长出不定根，而不定根附近
较易诱导出胚性愈伤，是 373、376 和 408 愈伤组织
最佳诱导条件。有研究表明 380、381 和 383 亲缘关
系较为接近［11］，因此，针对不同基因型的棉花品系，
应设计不同的激素组合及配比，亲缘关系较近的品
系可采用相同或相似的激素组合。
在海岛棉再生体系中，海岛棉胚性愈伤组织的
挑选和继代培养是非常关键的一个阶段。本研究通
过胚性愈伤组织次生代谢物的影响，将新挑出的初
生性胚性愈伤组织与已获得的其他品系的胚性愈伤
接种到同一个培养瓶中，以此提高此棉花品系出现
胚性愈伤的速度，此方法可适用于所有海岛棉品系，
提高胚性愈伤发生率，有利于缩短海岛棉再生体系
周期。
胚性愈伤组织细胞学观察中，胚性细胞与非胚
性细胞在形态上差别很大，胚性细胞之间结合紧密，
且多分布在细胞边缘，细胞核位于细胞中央，有明
显的核仁结构，细胞壁也较厚，细胞间在生理上出
现相对隔离。可依此推测，在胚性细胞的发生与发
育过程中处于相对独立状态，有利于形成成熟的体
细胞胚及其进一步的发育［12］。
体细胞胚胎发生是棉花组织培养的关键环节，
氮源和激素是影响体细胞胚胎发生和成熟的重要因
素［13-15］，增加 KNO3 的浓度能促进体细胞胚的发
生［16］。 张 宝 红 等［17］ 研 究 发 现 IBA、ABA、IAA、
BA、KT、ZT 和 ZiP 对棉花体细胞胚胎发生具有促
进作用，IBA+KT 组合通常用来继代培养胚性愈伤组
织和促进体细胞胚胎发生［18］。本研究中将淡黄色、
颗粒状的胚性愈伤转入 KNO3 加倍，去除 NH4NO3 并
铺垫无菌滤纸，添加 KT 和 IBA 的 MS5 培养基中，5-7
个月即可成功诱导出 6 个海岛棉品系的体细胞胚胎。
畸形苗的发生是植物组织培养中一种常见的生
理异常现象，严重制约着植物组织培养技术的发展。
畸形苗的产生与形成是多因素共同作用的结果［19］，
很难从根本上解决这一问题，但是可以将这些畸形
苗加以合理的利用，使畸形胚转化为正常苗。本实
验通过对畸形苗的培育研究，探索出了一条由畸形
苗直接获得体胚的捷径。
棉花体细胞再生技术已经较为完善，但当前的
海岛棉再生体系还不能完全克服海岛棉基因型限制。
因此，优化海岛棉再生体系是一项值得探索的工作。
基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生的限制只
是相对而言的，关键在于能否根据供试材料的遗传
A B C D
E F G H
A ：下胚轴切为短茎接种到愈伤组织诱导培养基 ；B ：下胚轴接种在 MS1 上 30 d 后愈伤组织诱导状况 ；C ：下胚轴接种在 MS2 上
30 d 后愈伤组织诱导状况 ；D ：MS3 培养基上分化出的愈伤组织 ；E ：初生性胚性愈伤组织（右侧）；F ：MS4 培养基上继代两次后
的胚性愈伤组织 ；G ：MS5 培养基（铺垫无菌滤纸）上诱导出的体细胞胚胎 ；H ：MS6 培养基上萌发出的再生植株
图 4 海岛棉的愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1102
背景采取与之相适应的培养手段和措施。相对而言，
陆地棉的再生体系较为简单，诱导愈伤组织所用的
浓度较低［20］，体细胞胚胎的分化速度较快且分化率
较高［21］。本研究以下胚轴为外植体，对海岛棉的再
生体系进行优化研究，获得了 6 个海岛棉品系的再
生植株，扩展了海岛棉再生基因型，为促进新疆海
岛棉转基因研究具有一定的意义。
4 结论
本研究以下胚轴为外植体材料，成功建立了 6
个海岛棉品系的再生体系，在 6-8 个月均获得了再
生植株。在愈伤组织诱导阶段，在培养基中添加 0.1
mg/L 2，4-D 和 0.1 mg/L KT 时，海岛棉 380、383 和
381 愈伤组织诱导效果最好，而添加 0.3 mg/L NAA
和 0.1 mg/L KT 则为海岛棉 373、376 和 408 愈伤组
织最佳诱导条件 ；在胚性愈伤组织诱导阶段，利用
成熟的胚性愈伤组织产生的次级代谢产物可加快胚
性愈伤组织的分化 ；在体细胞胚胎分化阶段，在培
养基中添加 0.1 mg/L KT 和 0.05 mg/L IBA 可促进体
细胞胚胎的发生和成熟，而且利用畸形苗的培育可
缩短再生体系的周期。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）