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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
绵羊性别控制对培育优秀种公羊和快速扩繁高
产绵羊后代具有重要意义。目前，用于绵羊早期胚
胎性别鉴定的方法，有 H-Y 抗原法、Y-染色体特异
性 DNA 探针杂交法和 PCR 法等。H-Y 抗原法可通
过免疫荧光分析和细胞毒性分析进行性别鉴定，免
疫荧光分析对胚胎损伤小，但鉴定准确率低于 87%，
细胞毒性分析虽然有较高的准确率，但却要以毁掉
雄原核为代价。Y-染色体特异性 DNA 探针杂交法
鉴定的准确率可达 90%，但必须要以流式细胞仪分
离精子，耗时长，过程复杂，不利于商业化生产。
收稿日期 ： 2013-05-17
基金项目 ：国家十二·五科技支撑计划（2011BAD19B02-2），甘肃省农业生物技术专项（GNSW-2012-19）
作者简介 ：马友记，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：绵羊育种与繁殖 ；E-mail ：yjma@gsau.edu.cn
PCR 扩增牙釉基因 X 和 Y 染色体不同序列鉴定
羊早期胚胎性别
马友记1  李海静1，2  朱化彬2  李发弟1
（1. 甘肃农业大学动物科技学院，兰州 730070 ；2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）
摘 要： 利用羊牙釉基因特异性引物扩增羊血液、成纤维细胞和胚胎 DNA，旨在优化羊早期胚胎性别鉴定的方法。结果表明，
利用两温度 PCR 扩增母羊 DNA 样品获得 1 条来自 X 染色体 289 bp 产物，PCR 扩增公羊 DNA 样品获得 2 条产物，其中 280 bp 扩
增产物来自 Y 染色体，235 bp 扩增产物来自 X 染色体，50 头已知性别羊样品鉴定的准确率为 100%。试验优化了一种两温度 PCR
快速鉴别羊及其早期胚胎性别的方法。
关键词 ： 牙釉基因 X 和 Y 染色体 PCR 胚胎性别鉴别 羊
Gender Determination in Sheep Preimplantation Embryos by
Amplifying Chromosome X and Y Sequence of
Amelogenin（AML）Gene
Ma Youji1 Li Haijing1，2 Zhu Huabin2 Li Fadi1
（1.Faculty of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；2. Institute of Animal Sciences，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）
Abstract:  Based on the multiple base deletions on the fifth intron of the sheep AMELX/Y（sAMELX/Y）gene，a pair of specific
primers was designed to amplify the different sequences of AMEL gene on X and Y chromosome of sheep blood, fibroblasts and embryos by two-
temperature -PCR in this test. The results showed that a 280 bp fragment from the female sheep DNA（XX）was amplified, and two fragments
（280 bp and 235 bp respectively）were got from the male sheep DNA（XY）. The accuracy rate of sex identification of 50 samples（25 females
and 25 males）was 100%.
Key words:  Amelogenin gene X and Y chromosome PCR Embryo sexing Sheep
PCR 法是一种快速、灵敏度高、操作简便且准确（准
确率达 95%-100%）的性别鉴定方法，适宜在生产
中推广应用［1］。
哺乳动物牙釉基因（amelogenin，AMEL）是牙
齿珐琅质发育的重要基因，编码牙齿珐琅质发育重
要蛋白，在雌性和雄性动物均有表达，虽然牙釉基
因存在于 X 和 Y 性染色体上的同源区域，但是其
在 X 染色体和 Y 染色体具有多态性。目前，利用
牙釉基因的同源区域通过单引物鉴定人、牛、山羊
等的性别，即在同一个反应中利用同一引物扩增牙
2013年第9期 111马友记等 ：PCR 扩增牙釉基因 X 和 Y 染色体不同序列鉴定羊早期胚胎性别
釉基因，AMELX 和 AMELY 基因具有不同长度的扩
增 片 段。Lau 等［2］ 在 1989 年 发 现 人 的 AMELX 和
AMELY 存在很长的多态性，并且位于性染色体上。
Sullivan 等［3］ 在 1993 利 用 amelogenin 同 源 序 列 设
计一对引物来鉴定人类的性别，同时 Chen 等［4］在
1999 利用同样的方法鉴定了牛的性别。Pfeiffer 等［5］
在 2005 年利用 AMEL 基因鉴定了绵羊和红鹿的性别，
Tsai 等［6］在 2011 年扩增了山羊的第 5 内含子的序
列并用其鉴定了山羊的性别。
本试验拟通过 NCBI 和 DNAMAN 等软件分析比
对绵羊的 AMEL 基因，寻找出 AMELX 和 AMELY 在
第五内含子中的差异，设计特异性的引物用于鉴定
绵羊的性别，优化 AMEL 鉴定绵羊性别的技术体系，
建立一套更为简单、灵敏和稳定的 PCR 技术体系。
1 材料与方法
1.1 材料
试验动物及样品 甘肃高山细毛羊组织样品（5
公、4 母）和血液样品（25 公、25 母）采自于甘肃
省永昌肉用种羊场 ；细胞（4 份，2 公、2 母）为实
验室培养的小尾寒羊耳缘组织成纤维细胞 ；胚胎样
品为羊体内胚胎（8 个），在体视显微镜下徒手持玻
璃切割针将胚胎切取部分细胞置于 PCR 管备用。
样品 DNA 提取按照 QIAGEN DNA 提取试剂盒说明
书操作，获得的 DNA 样品测定浓度后，-20℃保存
备用。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 通过 NCBI 获得绵羊的牙釉基因
序 列（XM_004021903）， 利 用 DNAMAN 比 对 绵 羊
AMEL-X 和 AMEL-Y 序 列， 发 现 羊 AMEL-Y 基 因
比 AMEL-X 基因缺少 45 bp，利用 Oligo6 软件设计
了一对跨越 AMEL-Y 基因缺失部位引物，引物序列
为 F ：5- ATGACTCCAACCCAACACC -3，R ：5-
GCTTGGTCTTGTCTGTTGC -3 进行相应样品扩增检
测。在母羊上扩增 1 个片段，大小为 289 bp，在公
羊上扩增 2 个片段，大小分别为 280 bp 和 235 bp。
1.2.2 PCR 反应 试验中 PCR 反应体积为 20 μL，其
中模板 DNA 为 50-100 ng（阴性对照为生理盐水），
10×Buffer 2 μL ；Mg2+1.5 mmol/L ；dNTP 100 μmol/L ；
DNA Taq 酶 1.25 U ；引物 250 pmol ；加超纯水至 20
μL。PCR 反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s；
60℃，40 s，共 35 个循环 ；72℃延伸 7 min。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳的检测 取 6 μL PCR 扩增产
物与 1 μL 6×loading Buffer 混匀后，点样于 2% 琼脂
糖凝胶（含 0.001% GoldViewnaTMI），在 100 V 电压
下电泳 25 min，凝胶成像仪观察扩增产物电泳结果。
2 结果
2.1 血液样品DNA PCR扩增结果
利用绵羊的 Amelogenin 引物对绵羊血液基因组
DNA 进行 PCR 扩增的电泳结果见图 1。图中公羊血
液样本扩增得到两条电泳条带，大小分别为 280 bp
和 235 bp（图 2）；母羊血液样品扩增后得到一条电
泳条带，大小为 280 bp。试验中采用双盲法对 50 个
绵羊血液 DNA 样品进行鉴定，鉴定结果与动物实际
性别完全相符，准确率为 100%（表 1）。
600
bp
M N 1 2 3 4 5 6
400
300
500
200
100
1-3 ：公羊 DNA 样品 ；4-6 ：母羊 DNA 样品 ；N ：阴性对照 ；M ：DNA marker
图 1 羊血液样品基因扩增结果
表 1 双盲法鉴定绵羊血液样品 DNA 结果
性别 鉴别头数 PCR 鉴别结果（头） 鉴别准确率（％）
公（♂） 25 25 100
母（♀） 25 25 100
2.2 成纤维细胞PCR扩增结果
利用羊的 amelogenin 基因的引物扩增体外培养
成纤维细胞的结果见图 3。试验中将提取的成纤维
细胞 DNA 进行浓度稀释，分别取 600 pg、300 pg、
150 pg、100 pg 的基因组利用羊牙釉基因的引物进行
PCR 的扩增。试验结果表明，成纤维细胞浓度分别
为 600 pg、300 pg、150 pg、100 pg 的 PCR 扩增的产
物可以获得清晰的电泳条带，公羊 DNA 样品扩增结
果为 280 bp 和 235 bp 的两条电泳条带，母羊 DNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期112
样品扩增结果为 1 条 280 bp 的电泳条带。
引物相当重要，哺乳动物的牙釉基因就是一个较好
的选择，AMEL 基因位于哺乳动物的 X 和 Y 染色体
上并存在多态性，因而 PCR 扩增 X 和 Y 染色体上
的差异片段可以鉴别家畜及早期胚胎的性别。试验
中依据 AMEL 在绵羊 X 和 Y 染色体上的多态性设计
了 1 对羊的 AMEL 基因的特异性引物，PCR 扩增后，
母羊样品 DNA（血液、组织、细胞和胚胎）获得一
条 280 bp 的扩增条带，公羊样品 DNA（血液、组织、
细胞和胚胎）获得两条电泳条带。分别为 280 bp 和
235 bp，试验成功的鉴定了羊及其早期胚胎的性别。
1991 年 Nakahori 等［7］将牙釉基因定位在人的
性染色体、1992 年定位于牛的性染色体上［8］、2000
年定位于马的性染色体上［9］、2002 年定位于熊的性
染色体上、2005 年定位于绵羊、山羊、鹿的性染色
㖺 AMELY ATGACTCCAA TCCAACACCA CCAGCCAAAC CTCCCTCTGC CCGCCCAGCA
㖺 AMELX AT GACTCCAA CCCAACACCA CC AGCCAAC CTCCCTCTGC CCGCCCAGCA
㖺 A M E LY G C C C T T C C A G C C C C A G C C C A T C C A G C C A C A G C C T C A C · · · · · · · · · · · · ·
㖺 AMELX GCCCTTCCAG CCCCAGTCCA TCCAGCCGCA GCCTCACCAG CCCCTGCAGC
㖺 A M E LY · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · C A A C C C C T G C A G C C C C A G
㖺 AMELX CCCTGCAGCC CATGCAGCCC TTGCAGCCCT TGCAGCCCCT GCAGCCCCAG
㖺 AMELY CCACCCGTGC ACCCCATCCA GCGC TTGCCA CCACAGCCAC CTCTGCCTTC
㖺 AMELX CCACCCGTCC CCATGCAGCC TCTGCCCCCC TTCCTGACCT CTGGAAGCTTG
㖺 A M E LY A ATAT T C C C C AT GCAACCTC T G C C C C C T G C T T C C T G A C C T G C C T C T G G A A
㖺 AMELX GATATTCTCC CCATGCAGCC TCTGCCCCCC TTCCTGACCT GCCTCTGGAA
㖺 AMELY GCTTGGCCAG CAACAGACAA GACCAAGCG
㖺 AMELX GCTTGGCCAG CAACAGACAA GACCAAGCG
图 2 PCR 扩增产物测序图
600
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 M
500
400
300
200
1，2 ：600 pg ；3，4 ：300 pg ；5，6 ：150 pg ；7，8 ：100 pg ；M ：marker.1，3，
5，7 ：母羊 DNA ；2，4，6，8 ：公羊 DNA.
图 3 羊成纤维细胞 DNA 梯度扩增结果
2.3 胚胎PCR扩增结果
利用胚胎切割仪将 8 个胚胎按照 1/2、1/4、1/8、
1/9 份进行切割，牙釉基因引物扩增羊的 1/2 份胚胎、
1/4 胚胎、1/8 胚胎、1/9 胚胎电泳结果见图 4。试验
结果表明，不同的切割分数的囊胚细胞都可以获得
较理想的扩增产物，其中雌性胚胎为 1 条 280 bp 电
泳条带，雄性胚胎为 280 bp 和 235 bp 两条电泳条带。
3 讨论
常规家畜的性别鉴定需要 2 对或 2 对以上的引
物，然而在 PCR 反应中同时扩增多对引物容易产生
二聚体、非特异性条带等不良影响。因此在胚胎性
别鉴定中需找一准确性好、灵敏度高、简单快速的
bp
1 2M 3 4 5 6 7 8 9 10 N
500
400
200
M ：50 bp marker ；N. 阴性对照 ；1，2 ：阳性对照 ；3，4 ：1/2 胚胎 ；
5，6 ：1/4 胚胎 ；7，8 ：1/8 胚胎 ；9，10 ：1/9 胚胎
图 4 切割后胚胎扩增结果
2013年第9期 113马友记等 ：PCR 扩增牙釉基因 X 和 Y 染色体不同序列鉴定羊早期胚胎性别
体上。目前，众多研究中报道在牙釉基因的 3 末端
的序列，尤其在第 5 内含子在 X 和 Y 染色体上存在
多处碱基的缺失，牛的牙釉基因在第 5 内含子序列
的相似性只有 45.1%［10］，最近 Tsai［6］克隆的山羊牙
釉基因的第 5 内含子的全部序列发现在 X 和 Y 的染
色体上只存在 48.5% 的相似序列。
利用 AMEL 基因的多态性鉴定牛羊的性别的方
法有优点，首先，利用一对引物在公、母动物中扩
增出不同的条带数，可以减少 PCR 过程的污染和和
利用 SRY 基因产生的误诊。其次，这种方法存在较
高的灵敏性，试验中利用 100 pg 的 DNA 就可以扩
增清晰的目的条带。Fontanesi 等［11］利用山羊的囊
胚中一个卵裂球的微量 DNA 进行扩增，并在牛和猪
的卵裂球中得到使用。再次，它有快速的性别诊断
能力和可行性，并同时在 3 h 内就可以完成百余个
胚胎的性别鉴定，因为在整个 PCR 的过程中既不需
要复杂的程序去纯化 DNA 也不需要内参引物。并且，
这种方法比 ZFX/ZFY 基因［12］或 SRY 基因［13］的特
异性扩增的准确性更高和更可靠性。
4 结论
根据绵羊牙釉基因在 X/Y 染色体上存在多处缺
失位点，利用 PCR 成功扩增了绵羊血液、组织、成
纤维细胞以及胚胎 AMELX 基因和 AMELY 基因，母
羊只得到 280 bp 的 X 染色体产物，公羊得到 1 条
235 bp 的 Y 染色体产物和 1 条 280 bp 的 X 染色体产
物，优化了 PCR 扩增羊 AMELX 基因和 AMELY 基
因差异片段鉴别羊及其早期胚胎性别的方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）