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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):84-90
二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，简称
DHA），是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸，能
够辅助婴幼儿脑细胞发育，而且还具抗衰老和降低
血脂、改善血液循环、抑制肿瘤等功效［1，2］。因此，
DHA 己经广泛应用于生产婴幼儿食品、保健食品和
辅助治疗剂等产品。由于裂殖壶菌 DHA 含量高、生
长快、易于培养、对人畜无毒害，目前是一种极具
生产前景的 DHA 微生物资源［3］。
国内外的研究主要集中在用裂殖壶菌以葡萄糖
为底物高效发酵产 DHA［4，5］，但是葡萄糖原料比较
收稿日期 ： 2014-07-28
基金项目 ：国家“863”计划（2014AA021701），国际合作重点项目（2014DFA61040）
作者简介 ：王迪，女，硕士研究生，研究方向 ：轻工技术与工程（发酵）；E-mail ：wangdi0808@hotmail.com
通讯作者 ：李德茂，男，博士，副研究员，研究方向 ：工业生物系统工程 ；E-mail ：li_dm@tib.cas.cn
利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产 DHA 的新型
裂殖壶菌
王迪1  路福平1  王海军1  李德茂2  陈树林2  张可2
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457 ；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与
过程工程重点实验室，天津 300308）
摘 要 ： 以生产 DHA 的裂殖壶菌（Schizochxtrium）B4D1 和黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 3.316 为出发菌株，利用原生
质体融合技术选育可以利用淀粉发酵生产 DHA 的新型裂殖壶菌。用裂解酶制得了两亲本的原生质体，通过研究两亲本培养时间、
培养方法、酶解时间等条件对原生质体产量影响的基础上，以 PEG 介导进行了原生质体的融合，最终确定了原生质体融合最佳条
件为 40% 的 PEG6000，融合温度 30℃，融合时间为 10 min，在此条件下融合率可达 1.9%。通过比较菌落外观、颜色、形态以及
分离培养筛选获得了一株利用淀粉裂殖壶菌融合子。经过 RAPD 验证表明 B4D1 与 CGMCC 3.316 发生了重组，融合菌株表达了更
多源于 B4D1 的遗传信息。
关键词 ： 裂殖壶菌 ；DHA ；原生质体 ；融合 ；淀粉
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.012
Screening a New Type of Schizochxtrium Strain Producing DHA Using
Starch by Protoplast Fusion Technology
Wang Di1 Lu Fuping1 Wang Haijun1 Li Demao2 Chen Shulin2 Zhang Ke2
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457 ；2. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological
Systems and Bioprocessing Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）
Abstract ： Schizochxtrium B4D1 and Aspergillus niger CGMCC 3.316 as original strains, a new strain of Schizochxtrium was selected
using starch for producing DHA. The protoplasts from two parents strains were obtained respectively with Lysing enzyme. The study was
investigated on the effect of culture time, culture method, enzymolysis time on the protoplasts preparation. Finally, the protoplasts fusion was
done under the PEG mediated condition. The optimum condition of protoplast fusion was as follows ：PEG6000 concentration of 40%, fusion
temperature of 30℃, fusion time of 10 min. Furthermore, the fusion rate reached 1.9% at the optimum condition. Through comparing its colony
characteristics, color, morphology and purified spore culture, a new strain has been selected using starch as carbon source. RAPD verification
showed that the fusant having integrated genome of B4D1 and CGMCC 3.316 expressed more genetic information from B4D1.
Key words ： Schizochytrium ；DHA ；protoplast ；fusion ；starch
2015,31(2) 85王迪等：利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产 DHA的新型裂殖壶菌
贵，导致产品价格比较高。淀粉相对于葡萄糖来讲
是一种量大、价廉的底物，通常在工业生产中，必
需先将淀粉以酶法或酸法制成淀粉水解糖，再加以
利用［6］。如果能选育出可直接以淀粉为碳源生产
DHA 的优良菌株，将会大大简化生产程序，降低生
产成本。
原生质体融合是一种基因重组技术，指通过人
为的方法，将遗传性状不同的两个细胞的原生质体
进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组
子的过程。这种方法打破了微生物的种界界限，可
发生在种内、种间，甚至亲缘很远的两个物种之间，
可以扩大融合频率和幅度，是一种常见的育种方法。
原生质体融合与常规杂交相比有很多优势，不但能
显著提高重组频率，而且具有定向育种的含义，目
前该技术已成为细胞生物学迅速发展的方向之一［7］。
针对裂殖壶菌不能利用淀粉的问题，本试验采
用原生质体融合技术，选取高效利用淀粉的黑曲霉
和 DHA 高产菌株裂殖壶菌 B4D1，通过两亲本对碳
源的利用不同，灭活后进行原生质体融合，筛选出
能以淀粉为碳源生产 DHA 的融合菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 裂殖壶菌 B4D1 本实验室保存 ；黑曲
霉 CGMCC 3.316 购于中国科学院微生物研究所普通
菌种保藏中心。
1.1.2 培养基 斜面培养基 ：PDA 培养基。菌丝生
长 培 养 基［8］：1.2% 葡 萄 糖，0.2% KH2PO4，0.05%
MgSO4，0.04% NaH2PO4，0.1% NH4NO3，0.1% 微 量
元 素（4% CuSO4，1.1% ZnSO4，0.6% MnSO4，0.1%
FeSO4，0.03% CoCl2，0.06% H3BO3，pH5.8）。 淀 粉
培养基 ：可溶性淀粉 5 g/L，蛋白陈 10 g/L，酵母粉
5 g/L，海水晶 15 g/L，琼脂 20 g/L，用 HPBS 配置。
以上培养基 121℃灭菌 20 min。
GYP 培养基［9］：葡萄糖 20 g/L，蛋白陈 10 g/L，
酵母粉 5 g/L，海水晶 15 g/L，115℃灭菌 20 min。
高渗培养基用高渗缓冲液 HPBS 配置，固体培
养基添加 2% 琼脂［10］。
1.1.3 试剂 缓冲溶液 PBS ：0.2 mol/L 磷酸缓冲溶
液，pH5.8，121℃灭菌 20 min。高渗缓冲液 HPBS ：
PBS 中添加 0.7 mol/L 的 KCl。预处理剂 0.3% β 巯基
乙 醇 -0.1% EDTA［11］：于 PBS 中 添 加 0.1% EDTA，
121℃灭菌 20 min。临用前添加 0.3% β 巯基乙醇。
酶液［12］：溶壁酶（Lysing enzyme）购自 Sigma 公司。
称取裂解酶，悬于 HPBS 中充分振荡并静置，使之
完全溶解，至浓度为 5 mg/mL。经 0.22 μm 微孔滤膜
过滤除菌，保存于 4℃冰箱备用。促溶剂 ：PEG6000
用 HPBS 配制成一定质量浓度的的溶液，121℃灭菌
20 min。
1.1.4 主要仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、
恒温摇床、恒温水浴箱、显微镜、离心机、紫外凝
胶成像仪、研钵、培养皿、移液枪、试管、锥形瓶、
离心管等。
1.2 方法
1.2.1 菌体培养及收集 黑曲霉菌丝培养 ：将原始
菌种转接至 PDA 斜面固体培养基上，待孢子生长成
熟后，用 PBS 洗脱孢子，调整孢子浓度为 108 个 /mL，
以 10% 的接种量接入菌丝生长培养基中，250 mL 三
角瓶装液量 50 mL，摇床转速 200 r/min，培养温度
30℃，培养时间 12-15 h，收集培养液置于灭菌的
50 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 10 min，用 PBS
缓冲液洗涤离心 2 次［13］，弃上清液，保留菌丝体。
裂殖壶菌菌体培养 ：将 B4D1 菌株接种于 GYP
液体培养基，25℃、180 r/min 条件下培养 24-48 h，
收集培养液 15 mL 于灭菌的 50 mL 离心管中，4 000
r/min 离心 10 min，用 PBS 缓冲液洗涤离心两次，收
集菌体。
1.2.2 原生质体的制备 黑曲霉原生质体的制备 ：
向 黑 曲 霉 菌 丝 体 中 加 入 酶 液， 酶 液 按 照 Wmycelium/
Venzyme solution=1∶10（g/mL）加入
［14］，25-38℃，100 r/min
恒温振荡酶解，酶解结束后，酶解液经 4 层高级擦
镜纸过滤，滤液离心（4 000 r/min，10 min），高渗
缓冲液 HPBS 洗涤两次，弃上清，收集原生质体并
重悬于 10 mL 高渗缓冲液 HPBS 中，血球板计数。
裂殖壶菌原生质体制备 ：经洗涤的菌体加入预
处理剂［7］10 mL，30℃，180 r/min 恒温振荡 30 min，
用 HPBS 缓 冲 也 洗 涤 离 心（4 000 r/min，10 min），
加入酶液至菌体浓度为 107/mL，25-38℃，100 r/min
恒温振荡酶解一段时间，酶解结束后，酶解液离心
（4 000 r/min，10 min）［7］。用高渗缓冲液 HPBS 洗涤
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.286
两次，重悬于 10 mL 高渗缓冲液 HPBS 中。取 1 mL
原生质体悬液，经高渗溶液 HPBS 适当稀释，用再
生培养基倾注法培养 2-4 d，计算菌落数。
1.2.3 黑曲霉原生质体灭活 取黑曲霉原生质体细
胞悬液 5 mL 在 55℃水浴中，不同时间灭活后，经
高渗溶液 HPBS 适当稀释，用再生培养基倾注法测
定细胞数，计算致死率。
1.2.4 原生质体融合 取 B4D1 原生质体和灭活后
的黑曲霉原生质体悬液（浓度 106 个 /mL）在离心
管中等量混合，于 4℃冷冻离心机中 4 000 r/min 离
心 10 min，弃上清，加入促溶剂，混匀后放入 20-
40℃、转速为 100 r/min 的恒温摇床中数分钟以待融
合 ；取出融合后的原生质体悬液 4℃冷冻离心后用
HPBS 缓冲液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将
洗涤后的原生质体重悬于 HPBS 缓冲液中，得到融
合后的原生质体用高渗淀粉培养基倾注法 25℃培养
3-5 d，检出融合子，测定细胞数［15］。
1.2.5 计算公式 原生质体形成率、再生率、灭活
率和融合率的计算公式参考文献［2，16］。
1.2.6 融合子筛选 挑选能够在高渗淀粉培养平板
上生长的菌落，根据裂殖壶菌菌落形态初步检出融
合子，然后转接入含有 200 μL GYP 培养基的 96 孔
板中，于 25℃ 180 r/min 发酵 3 d。以出发菌株 B4D1
作为对照，用尼罗红检测初步检测油脂含量 ［17］，筛
选油脂产量较高的融合子接入淀粉培养基，发酵 6 d，
气相检测 DHA。
气相色谱法条件为 ：岛津 GC-2010 气相色谱仪，
色 谱 柱 ：SP-2560（100.0 m×0.25 mm×0.20 μm）。
N2 为载气，采用程序升温，起始温度 140℃，保持
5 min，然后以 4℃/min 的速度升至 240℃，保持 11
min。FID 检测器，进样口温度为 250℃，检测器温
度为 280℃。采用分流进样，分流比为 30，进样量
为 1 μL。
1.2.7 融合菌株的稳定性检验 对筛选得到的融合
菌株连续传代 10 次，测定细胞干重和油脂含量，检
验融合子的遗传稳定性。
1.2.8 融合菌株的鉴定 应用 RAPD 技术对融合菌
株进行鉴定，分析亲本与融合菌株之间的遗传相似
性和遗传距离 ［18］。
RAPD 的引物筛选 ：用 20 个 10 bp 的寡核苷酸
引物对亲本基因组 DNA 进行 PCR 扩增，从中筛选
扩增条带清晰、重复性好、多态性高的引物，用于
全部样本的扩增。反应体系（25 μL）：DNA 模板 0.5
μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，随机引物 0.5
μL，无菌双蒸水 11.5 μL。反应程序为 ：94℃预变性
5 min ；94℃ 变性 30 s，37℃退火 30 s，72℃延伸 1
min，40 个循环 ；72℃延伸 8 min，4℃保存。
PCR 扩增反应结束后，采用 1×TAE 电泳缓冲
液，用 1% 琼脂糖凝胶在电压为 120 V 的电场中电
泳 20 min，GoldView 染色。在紫外凝胶成像仪上观
察并拍照，记录结果。
数 据 处 理 ：按 照 公 式 相 似 系 数 Sxy=2· Nxy/
（Nx+Ny）×100% 获得各样品间的遗传相似度，其中
Nxy 是比较后两种材料 x 和 y 共有的 DNA 片段数目，
Nx 和 Ny 分别为材料 x 和 y 各自的 DNA 扩增片段数目。
再由 D=1-S 获得相应的遗传距离［6］。
1.2.9 培养基淀粉含量的测定 将融合子在淀粉培
养基中发酵培养，每隔 24 h 取样测定培养基中淀粉
含量，方法参考文献［19］。
2 结果
2.1 裂殖壶菌和黑曲霉原生质体制备与再生条件
的确定
2.1.1 菌龄对原生质体形成的影响 细胞壁的成分
和结构在细胞不同的时期有所不同，因而细胞对酶
的敏感性有差异。通过测定生长曲线及不同培养时
期细胞原生质体形成率，发现裂殖壶菌和黑曲霉原
生质体化的较适菌龄分别为 36 h 和 15 h 左右，约处
于对数生长早期。
2.1.2 酶解温度和时间对原生质体形成的影响 选
择原生质体最佳的制备条件不仅要使原生质体制备
率达到最高，同时还要考虑原生质体再生率不能过
低，因此原生质体制备条件要在选择保证原生质体
再生率的同时选择原生质体制备率最高的条件。由
图 1-图 4 结果可确定裂殖壶菌 B4D1 的最佳原生质
体制备条件 ：酶作用温度为 32℃，酶作用时间为 60
min，黑曲霉的最佳原生质体制备条件 ：酶作用温度
为 32℃，酶作用时间为 2.5 h。
2015,31(2) 87王迪等：利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产 DHA的新型裂殖壶菌
2.2 黑曲霉原生质体的灭活及融合条件的确定
2.2.1 原生质体灭活条件的选择 灭活的目的是为
了标记融合子，即让亲本黑曲霉原生质体全部致死，
而经过融合后所生长的即为融合二倍体，所以灭活
率需达到 100%。原生质体热灭活的试验结果，如图
5 所示。为保证原生质体的灭活率为 100%，最后确
定黑曲霉高温灭活温度为 55℃，时间为 20 min。
2.2.2 促 溶 剂 PEG6000 质 量 分 数 的 影 响 由 于
PEG6000 对原生质体的毒性和原生质体对有机质稳
定剂的敏感性，PEG6000 质量分数不能过大，否
则融合频率会迅速下降。由图 6 可知，融合率随
PEG6000 浓度升高增加到 1.9% 当浓度超过 60% 时，
融 合 率 下 降 到 0.7%。 因 此 选 择 PEG6000 浓 度 为
40% 作为原生质体融合时的 PEG 浓度。
24 26 28 30 32 34 36 38 40
60
70
80
90
৏⭏䍘փᖒᡀ䟿޽⭏⦷
⑙ᓖć㻲⇆༦㧼৏⭏
䍘փॆ⦷%
40
48
56
64
72
80
㻲⇆༦㧼৏⭏䍘փ޽⭏
⦷%
20 30 40 50 60 70 80 90
40
50
60
70
80
90
100
110 ৏⭏䍘փᖒᡀ䟿޽⭏⦷
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⭏䍘փॆ⦷%
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16
32
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64
80
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⦷%
0 10 20 30
20
40
60
80
100
৏⭏䍘փ⚝⍫⦷% ᰦ䰤min 20 30 40 50 600.00.5
1.0
1.5
2.0
৏⭏䍘փ㶽ਸ⦷%
PEG⎃ᓖ%
24 26 28 30 32 34 36 38 40
8
9
10
11
12
৏⭏䍘փᖒᡀ䟿޽⭏⦷
⑙ᓖć唁ᴢ䴹৏⭏䍘փ
ᮠ×105 ·mL-1 
16
20
24
唁ᴢ䴹৏⭏䍘փ޽⭏⦷
%
图 1 裂殖壶菌原生质体制备作用温度 图 2 黑曲霉原生质体制备作用温度
120 140 160 180 200 220 240
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 ৏⭏䍘փᖒᡀ䟿޽⭏⦷
ᰦ䰤min唁ᴢ䴹৏⭏䍘
փᮠ×105 ·mL-1 
12
16
20
24
28
32
唁ᴢ䴹৏⭏䍘փ޽⭏⦷
%
图 3 裂殖壶菌原生质体制备作用时间 图 4 黑曲霉原生质体制备作用时间
图 5 不同作用时间对黑曲霉原生质体的灭活效果 图 6 PEG 浓度对融合率的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.288
2.2.3 融合时间的影响 分别选取 1、5、10、15 和
20 min 进行融合，测定融合率如图 7 所示，随着融
合时间增加到 10 min 时，融合率提高到 1.2%，当融
合时间继续增加到 20 min 时，原生质体的融合率则
降为 0.3%，因此为了获得最大的融合率，选择 10
min 作为原生质体的融合时间。
2.3 融合子的获得
2.3.1 融合子筛选 由于裂殖壶菌不能利用淀粉，
因而无法在淀粉筛选培养基上生长，只有融合了黑
曲霉的新型裂殖壶菌才能生长，从原生质体融合后
的淀粉高渗培养基平板上，分离筛选了 5 株在 25℃
生长旺盛，菌落形态与黑曲霉菌株不同而与裂殖壶
菌形态相同的淡黄色菌株，编号为 M-1-M-5，然后
接种到含 200 μL 的 GYP 培养基的 96 孔板进行发酵
培养，B4D1 为对照，用尼罗红检测油脂含量，结
果表明 M-3 菌株油脂含量和亲本 B4D1 产油量相当。
将 M-3 发酵 6 d 后，经气相色谱法检测（图 9），对
比 DHA 标准品可知，融合得到的新型裂殖壶菌具有
产 DHA 能力，而且其可以在淀粉为碳源的培养基上
0 5 10 15 20
0.0
0.5
1.0
1.5
৏⭏䍘փ㶽ਸ⦷% 㶽ਸᰦ䰤min
20 30 40
0.2
0.4
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1.0
1.2
৏⭏䍘փ㶽ਸ⦷% ⑙ᓖć
18
0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0 㢢䉡uVfz10.000
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
DHA
40 min
图 7 融合时间对融合率的影响
图 8 融合温度对融合率的影响
2.2.4 融合温度的影响 温度在一定程度上影响原
生质体融合率，较高的温度可以增加性细胞膜流动
性，降低 PEG 黏度，有助于原生质体的融合。由图
8 可知，融合温度上升到 30℃时，原生质体融合率
提高到 1.1%。温度继续升高后，融合率降低至 0.6%。
因此选择 30℃作为融合温度。
图 9 融合子 M-3 油脂气相色谱图
生长，具有双亲本的特性。
2.3.2 融合菌株稳定性分析 融合菌株 M-3 经过 10
次传代，仍然能够在淀粉培养基上稳定生长，并且
由表 1 可以看出产油性状稳定。
表 1 M-3 培养 1 代和 5 代干重和油脂含量的比较
传代次数 干重 /（g·L-1） 油脂含量 /%
1 18.11 8.53
10 18.02 8.26
2015,31(2) 89王迪等：利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产 DHA的新型裂殖壶菌
2.4 融合子M-3的RAPD分析
2.4.1 RAPD 扩增结果 从 20 个随机引物中筛选出
条带清晰、稳定性好的 8 个引物，分别为 P1（GTT-
TCGCTCC）、P4（GGACTGGAGT）、P5（TGCGCCC-
TTC）、P10（CTGCTGGGAC）、P11（GTAGACCCGT）、
P15（GGAGGGTGTT）、P19（ACCCCCGAAG）、P20
（GGACCCTTAC）， 对 亲 本 B4D1、CGMCC 3.316 及
融合子 M-3 的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，扩增出
的随机片段大都在 500-2000 bp，结果见图 10。亲
本 B4D1、CGMCC 3.316 及 其 融 合 子 M-3 基 因 组
DNA 扩增的 RAPD 带谱存在差异。同一引物对两
亲本和融合子扩增的 RAPD 条带也存在一定的差
异。融合子 M-3 的条带有的与 B4D1 相同，有的与
CGMCC 3.316 相同，说明融合子 M-3 的基因组 DNA
既有与 B4D1 同源的序列，又有与 CGMCC 3.316 同
源的序列。表明在基因水平上，B4D1 与 CGMCC 3.316
发生了重组，得到了融合菌株 M-3。
剩余淀粉含量结果见图 11。由图 11 可看出，随着
时间增加，淀粉含量不断减少，从最初 5 g/L 减少到
2.91 g/L，说明融合子可以利用淀粉。
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 M
2000
bp
500
P1 P4 P5 P10 P11 P19P15 P20
0 50 100 150
3
4
5⏰㊹ਜ਼䟿g·L-1  ᰦ䰤h
1 ：B4D1 ；2 ：M-3 ；3 ：CGMCC 3.316 ；M ：DNA Marker（Trans 2K）
图 10 部分引物对亲本及其融合子的 RAPD 扩增图谱
2.4.2 遗传相似系数分析 根据表 2 的数据计算
M-3 与 两 亲 本 的 相 似 系 数 ：SSM=0.698，SMC=0.34，
SSC=0.182 ；DSM=0.302，DMC=0.66 ；DSC=0.818。 融 合
菌株 M-3 与亲本 B4D1 的遗传相似系数大于与亲本
CGMCC3.316 的遗传相似系数，表明融合菌株 M-3
与亲本 B4D1 的遗传关系更近，或者 M-3 表达了更
多源于 B4D1 的遗传信息。
2.5 培养基剩余淀粉含量测定
用淀粉培养基培养融合子 M-3，测定培养基中
表 2 八种随机引物的扩增谱带
菌株 谱带总数 SMC 共同谱带 SC 共同谱带 SM 共同谱带 MC 共同谱带
B4D1 20 4 4 15
M-3 23 4 15 8
CGMCC3.316 24 4 4 8
图 11 培养基中淀粉含量随时间变化曲线
3 讨论
原生质体融合技术具有重组频率高，遗传物质
完善，容易获得性状优良和生产量高的融合菌等优
点，已被广泛应用于各种研究工作中。本试验通过
利用双亲对某种碳源利用状况的差异作为筛选标记
进行原生质体融合，得到了同时可以产油脂以及以
淀粉作为碳源生长的融合菌株 M-3，大大减轻了背
景干扰，提高了菌种筛选效率。
徐新立等［20］将油脂高产菌深黄被孢霉 3.3410
和具有高纤维素活性的黑曲霉 SL2-111 进行原生质
体融合，筛选得到能直接利用纤维素原料的产油菌
株。其黑曲霉原生质体制备浓度达到 7.2×107 个 /mL，
再生率达到 28.6%，而本试验只达到 8.7×105 个 /mL
的原生质体浓度和 28.4% 的再生率。后续研究需要
进一步提高黑曲霉原生质体的制备率以及再生率。
张淑君等［21］利用桑树内生菜豆壳球孢菌分别与绿
色木霉及长柄木霉进行融合，同样获得了以纤维素
钠作为唯一碳源产油脂的融合菌株，油脂产量及含
量均高于亲本。本试验得到的融合菌株，能够产油
脂尤其是 DHA，后续研究需进一步融合菌株继续融
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.290
合或诱变，以提高融合率，从而得到更多的融合子
进行筛选。本试验证明了利用原生质体融合进行菌
株选育的可行性。后期还应探讨其最佳培养条件和
发酵条件，以最终能将其应用于生产，发挥经济效益。
4 结论
本研究确定了原生质体融合最佳条件为 40% 的
PEG6000，融合温度 30℃，融合时间为 10 min，在
此条件下融合率可达 1.9%。筛选出一株可以在淀粉
为碳源的培养基上生长的融合子，经过气相色谱检
测其可以生产 DHA。通过 RAPD 验证表明 B4D1 与
CGMCC 3.316 发生了重组，融合菌株表达了更多源
于 B4D1 的遗传信息。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）