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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
DCF1 是一种膜蛋白，早先发现它在神经干细胞
的分化中起着重要的作用［1］。新近研究表明 DCF1
过量表达能有效地抑制恶性胶质瘤 U251 细胞系的
增殖、迁移、侵袭能力并且促进细胞凋亡［2］。恶性
胶质瘤是人类肿瘤中最具致命性的脑肿瘤，预后性
收稿日期 ： 2014-05-16
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81271253）
作者简介 ：王倩，女，研究方向 ：分子神经生物学 ；E-mail ：happywangni@163.com
通讯作者 ：文铁桥，男，教授，博士生导师，研究方向 ：神经干细胞分化调控机制及信号传导途径、神经退行性疾病等 ；
E-mail ：tqwen@staff.shu.edu.cn
人源 DCF1 基因原核表达载体构建及蛋白分离纯化
王倩  杨眉  冯瑞丽  王娇  文铁桥
（上海大学生命科学学院 分子神经生物学实验室，上海 200444）
摘 要 ： 为了深入研究 DCF1（Dendritic Cell Factor 1）基因的作用，以质粒 pcDNA3.1-DCF1-TAT 为模板体外扩增得到片段
DCF1-TAT，将测序正确的目的片段克隆入原核表达载体 pET32a，转化大肠杆菌 Rosetta（DE3），异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）
诱导表达，并优化表达条件。以尿素溶解包涵体蛋白，并优化溶解条件，通过 Ni 离子亲和层析柱进行纯化，再透析复性目的蛋白。
用 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达和纯化结果，并用 Western blot 进行验证。结果表明，重组表达载体 pET32a-DCF1-TAT 构建成功，
并在大肠杆菌 Rosetta 中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在，经过尿素溶解，Ni 离子亲和层析柱纯化获得高纯度的目的蛋
白。SDS-PAGE 和 Western blot 检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符。
关键词 ： 人源 DCF1 基因 PTD TAT
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.033
Construction of a Humanized DCF1 Gene Prokaryotic Expression
Vector and Protein Purification
Wang Qian Yang Mei Feng Ruili Wang Jiao Wen Tieqiao
（Laboratory of Molecular Neural Biology，School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444）
Abstract: In order to further study the role of human DCF1 gene, the target fragment DCF1-TAT was amplified from plasmid pcDNA3.1-
DCF1-TAT by PCR, and then cloned into a prokaryotic expression vector pET32a to construct the recombinant plasmid pET32a-DCF1-TAT,
which was then transformed into Escherichia coli Rosetta（DE3）cells to express the fusion protein and induced to express by isopropyl-β-D-
thiogalactoside（IPTG）, and meanwhile the expression condition was optimized. The inclusion body was dissolved by urea after the optimization
of dissolution condition, purified by Ni ion affinity chromatography, and renatured by dialysis. SDS-polyaerylamide gel electrophoresis（SDS-
PAGE）and Western blot analysis were used to detect the fusion protein. The results indicated that the recombinant expression vector pET32a-
DCF1-TAT was constructed and expressed in Rosetta successfully. The fusion protein existed in the form of inclusion body, and the target protein
was obtained with high purity through the dissolution of urea and purification of affinity chromatography. SDS-PAGE and Western blot analysis
showed that the molecular weight of fusion protein was in the expected line.
Key words: Humanized DCF1 gene PTD TAT
最差，生存中期约为 14 个月［3］。颅内肿瘤好发人
群主要在 20-50 岁之间，复发率高，给社会带来很
大的压力。当前治疗胶质瘤的策略主要有外科手术、
放射疗法、化学疗法、基因治疗。为了避免这些治
疗方法的缺陷，重组蛋白药物已经被运用到临床试
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期196
验中。
蛋白质不能自由进入细胞，阻碍了蛋白药物
的发展。对于脑胶质瘤，大分子蛋白治疗药物的运
输常常被血脑屏障阻碍。然而，研究表明含有 PTD
（Protein transduction domain）的融合蛋白能够穿透
细胞膜和血脑屏障［4，5］。PTD 是具有蛋白转导功能
的蛋白转导域，由特定的蛋白质功能域引领其所承
载的蛋白质穿过膜性结构并在细胞内积累。自然界
存在 3 种 PTD，目前运用较多的是来自人类Ⅰ型免
疫缺陷病毒的 TAT 蛋白转导结构域［8］。为此本研
究构建了原核表达载体 pET32a-DCF1-TAT，使用以
大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系，在大肠杆菌
Rosetta（DE3）中实现 DCF1-TAT 融合蛋白表达，旨
在为深入研究 DCF1 蛋白功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
感 受 态 大 肠 杆 菌 HB101， 质 粒 pET32a 和
pcDNA3.1-DCF1-TAT 由 本 实 验 室 保 存 ；大 肠 杆 菌
Rosetta（DE3）菌株由吉永华教授实验室惠赠 ；限
制性内切酶 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ，T4 DNA 连接酶，
蛋白 Marker 等购自 TaKaRa ；异丙基 β-D-硫代半乳
糖苷（IPTG）购自 Sigma ；Ni 离子亲和层析柱购自
Millipore ；胶回收试剂盒购自生工生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 大 肠 杆 菌 表 达 载 体 pET32a-DCF1-TAT 的 构
建 以质粒 pcDNA3.1-DCF1-TAT 为模板，利用 PCR
体外扩增 DCF1-TAT 片段，设计引物序列为 ：上游
引 物 ：5-AAAGGATCCATGGCGGCGCCGAAGGGG
AGCC-3 ；下游引物 ：5-AAAAAGCTTTCTTCGTCGC
TGTCTCCGCTTCTTCCTGCCATAAATTTCAGAATGA
GC-3（下划线分别为 BamH I 和 Hind Ⅲ限制性内切
酶序列）。将 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳，胶
回收试剂盒回收目的片段。
将扩增的 DCF1-TAT 片段和 pET32a 空载用限制
性内切酶 BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切，胶回收目的片
段并用 T4 DNA 连接酶于 16℃过夜连接。把连接产
物转化入大肠杆菌 HB101 感受态细胞，均匀涂于带
Amp+ 抗性的 LB 固体培养基上，于 37℃培养箱培养
15 h。挑取单菌落接种到含 100 mg/L Amp+ 的 LB 液
体培养基（胰蛋白胨 10 g/L ；酵母提取物 5 g/L ；氯
化钠 10 g/L）中，于 37℃、230 r/min 摇床中培养过夜。
使用 SDS 碱裂解法小量制备质粒 DNA，进行 BamH I、
Hind Ⅲ双酶切和测序鉴定。
1.2.2 诱导表达 将鉴定正确的重组质粒 pET32a-
DCF1-TAT 热激转化到 Rosetta 感受态细胞中，再铺
于带 Amp+ 抗性的 LB 固体培养基上，于 37℃培养
箱中过夜培养。次日挑取单菌落接种于 2 mL 含 100
mg/L Amp+ 的 LB 液体培养基中，于 37℃、230 r/min
摇床中培养过夜。将培养好的菌液按照 1∶50 的比
例接种到 50 mL 含 100 mg/L Amp+ 的 LB 液体培养基
中，37℃震荡培养 2 h 以上，至对数生长期 OD600 约
为 0.5 时，停止培养。
1.2.2.1 诱导浓度的确定 待菌液 OD600 约等于 0.5
时，向溶液中加入 IPTG 溶液至其终浓度分别为 0、
0.1、0.6 和 1.0 mmol/L， 放 于 37℃、230 r/min 摇 床
培养 4 h。4℃、8 000 r/min 离心 2 min，收集菌体，
SDS-PAGE 电泳（浓缩胶浓度为 4%，分离胶浓度为
12%）检测不同浓度诱导的融合蛋白表达情况，确
定最适 IPTG 诱导浓度 X。
1.2.2.2 诱导时间的确定 以最适诱导浓度 X，温
度 37℃，转速 230 r/min 为固定条件，设置 3 个不
同梯度的诱导时间 4、6 和 8 h 分别进行诱导，SDS-
PAGE 电泳检测不同时间诱导的融合蛋白表达情况，
确定最适 IPTG 诱导时间 Y。
确定诱导条件为 ：温度 37℃，转速 230 r/min，
IPTG 浓度 X，诱导时间 Y。在此条件下大量培养转
化菌株，于 4℃、5 000×g 离心 15 min，收集菌体沉淀，
保存于 -20℃中备用。
1.2.2.3 融合蛋白的可溶性分析 用适量超声缓冲
液（50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100 mmol/L NaCl，
1 mmol/L PMSF）重悬菌体，300 W，超声 5 s，停 7
s 冰浴超声破碎菌体。4℃、5 000×g 离心 15 min，
分别收集菌体沉淀和上清溶液，SDS-PAGE 电泳检
测融合蛋白在菌体沉淀和上清溶液中的溶解情况。
1.2.3 纯化包涵体蛋白
1.2.3.1 制备细胞抽提物 收集并称重菌体沉淀，
按每克（湿重）菌体加 3 mL 细胞裂解缓冲液Ⅰ（50
mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，
pH8.0）的比例重悬菌体，再加入 4 μL 100 mmol/L
2014年第12期 197王倩等：人源 DCF1基因原核表达载体构建及蛋白分离纯化
PMSF 和 80 μL 10 g/L 溶 菌 酶， 搅 动 20 min。 每 克
（湿重）菌体加入 4 mg 脱氧胆酸，继续搅动。悬液
37℃放置，不用磨光玻璃棒搅动，使其变黏时每克（湿
重）菌体加入 20 μL 1 mg/mL DNase Ⅰ。裂解液室温
放置，直至不再黏稠。
1.2.3.2 洗涤和变性溶解包涵体蛋白 将细胞裂解
物于 4℃、8 000×g 离心 15 min，弃去上清。菌体重
悬于水中，4℃、8 000×g 离心 15 min。沉淀用包涵
体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.5 mol/L
NaCl，2 mol/L 尿素）重悬后，搅拌 25 min，于 4℃、
8 000×g 离心 15 min，弃去上清，重复 1 次。再用
适量的 50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 溶液洗涤 1 遍，于
4℃、8 000×g 离心 15 min，弃去上清。设置尿素浓
度梯度和溶解时间梯度确定最佳溶解包涵体条件 ：
用含不同浓度尿素的包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L
Tris-HCl pH8.0，0.5 mol/L NaCl，4、6、8 和 10 mol/L
尿素）重悬菌体，室温搅拌溶解 1、2 和 5 h，4℃、
8 000×g 离心 15 min，分别收集上清溶液。
1.2.3.3 包涵体蛋白纯化与复性 将 Ni 离子亲和
层析柱用双蒸水洗两遍，加入 200 μL 填料，再用
Binding buffer（300 mmol/L KCl，50 mmol/L KH2PO4，
10 mmol/L imidazole，1 mmol/L PMSF） 洗 两 次。 加
入 9 mL 蛋白上清溶液，依次用 20、40 和 60 mmol/L
imidazole 溶液洗 1 次，最后用 250 mmol/L imidazole
溶液洗脱。
将收集的洗脱流出液用稀释液（20 mmol/L Tris-
HCl，pH8.0）按照 1∶10 的比例稀释并装入透析袋，
用含适量甘油的 0.01 mol/L PBS（pH8.0）透析 48 h，
每 4-8 h 更换 1 次 PBS 溶液，最后用双蒸水透析 2 次，
每次 6 h。再用超滤浓缩管浓缩透析后的溶液，-80℃
保存。采用 Western blot 的方法对复性后的蛋白质进
行检测分析。
2 结果
2.1 表达载体的构建
以 质 粒 pcDNA3.1-DCF1-TAT 为 模 板 体 外 扩 增
的 DNA 片段分子量大小理论值为 1 023 bp，图 1-A
结果显示 1 kb 附近的条带为所需的目的 DNA 片段。
将扩增得到的 DCF1-TAT 片段与空载 pET32a 用限制
性内切酶 BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切，结果（图 1-B）
显示，胶回收酶切后的片段与线性载体，连接，进
一步鉴定重组质粒是否连接正确。7 个样品中有 6
个样品可以酶切出与目的片段大小相符的约 1 kb 的
DNA 片段（图 1-C），挑取 2 号对应的菌液样品测
序，测序结果表明已将 DCF1-TAT 片段成功克隆入
pET32a 载体中。
（A）人源 DCF1 cDNA 扩增，1 ：DNA Marker ；2 ：阴性对照 ；3 ：DCF1 的
PCR 扩增 ；（B）酶切检测，1 ：DNA Marker ；2 ：BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切
片段 DCF1-TAT ；3 ：质粒 pET32a 空载 ；4 ：BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切质粒
pET32a ；（C）阳性克隆酶切鉴定分析，1 ：DNA Marker ；2 和 3、4 和 5、6
和 7、8 和 9、10 和 11、12 和 13、14 和 15：分别为 7 个阳性克隆双酶切前、
后电泳结果
图 1 构建表达载体 pET32a-DCF1-TAT
1000
1 2 3
1 2 3 1 2 3 4
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1000
6000
bpbp
bp
1000
C
A B
2.2 优化诱导表达融合蛋白的条件
在大肠杆菌的最适生长温度（37℃）条件下，
分别设置 0、0.1、0.6 和 1.0 mmol/L IPTG 浓度梯度。
随着 IPTG 浓度的增加，在相同上样量的情况下，57
kD 的蛋白条带逐渐变粗，且其中 0-0.6 mmol/L IPTG
诱导的蛋白质含量显著增加，而 0.6-1.0 mmol/L 诱
导的蛋白质含量增加趋势缓慢（图 2-A）。IPTG 浓度
过低不利于蛋白表达，过高则会影响菌体生长，选
择最优诱导浓度为 0.6 mmol/L 进行诱导。
在 4、6 和 8 h 三个时间梯度诱导时发现，诱导
6 h 的 57 kD 融合蛋白表达量最多（图 2-B），选择最
优诱导时间为 6 h。
超声破碎诱导后的菌体，发现目的蛋白几乎不
溶于上清溶液，而是存在于破碎后的菌体沉淀中（图
2-C）。该蛋白形成了包涵体，必须将包涵体蛋白变
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期198
性溶解于上清，才能进行后续的纯化蛋白操作。
2.3 包涵体蛋白的纯化与Western blot鉴定
经 4、6、8 和 10 mol/L 尿素溶解包涵体 1 h 后，
上清溶液中均未出现蛋白条带，增加溶解时间至 2 h
后，包涵体蛋白开始溶解，8 mol/L 和 10 mol/L 尿素
溶解量相对较多且相近（图 3-A），选择 8 mol/L 尿
素进行溶解。将溶解时间增至 5 h 发现，近 50% 包
涵体蛋白已经溶解于上清溶液中，且用 250 mmol/L
imidazole 溶液纯化效率高，洗脱流出液中已经没有
杂蛋白，全部为目的包涵体蛋白（图 3-B）。Western
blot 对复性的包涵体目的蛋白检测显示（图 3-C），
57 kD 的条带与预期蛋白分子量大小相符。
3 讨论
DCF1 又称作跨膜蛋白 59（TMEM59，Transme-
mbrane protein 59），是一种与树突细胞的分化和迁
移有关的信号分子［6，7］。DCF1 编码的蛋白分子量
大小为 42 kD，该蛋白能够在大肠杆菌和神经干细
胞中成功表达［8］。目前对于 DCF1 详细的功能还不
是很清楚，但是据先前的研究表明，它可能与神经
系统中，β 淀粉样前体蛋白 APP 的糖基化和神经干
细胞的分化调控有关［8，9］。此外，本实验室先前研
究结果显示，过表达 DCF1 后，U251 恶性胶质瘤
细胞线粒体发生肿胀，嵴结构破坏并大部分消失，
线粒体膜电位下降，细胞 ATP 含量减少。线粒体
相关抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达下调，促凋亡蛋白 Bax
表达上调，凋亡执行蛋白半胱天冬酶 Caspase-3 被
活化［2］。
为了进一步研究该蛋白对肿瘤细胞的功能，
获得高纯度的目的蛋白十分重要。将克隆得到的
DCF1-TAT 片段连接入 pET32a 融合表达载体，成功
构建载体 pET32a-DCF1-TAT。为了获得大量的目的
蛋白，对诱导剂 IPTG 的浓度和诱导时间两个表达条
件进行优化。与对照组相比，经过 IPTG 诱导的融合
75
kD
1A 2 3 4 5
55
75
kD
1B 2 3 4 5
55
75
kD
1C 2 3
55
40
35
25
（A）不同浓度梯度诱导，1 ：Protein ladder ；2-5 ：0、0.1、0.6、1.0 mmol/L
IPTG 分别诱导 4 h ；（B）不同时间梯度诱导，1 ：Protein ladder ；2-5 ：0.6
mmol/L IPTG 分别诱导 4、6、8 h ；（C）融合蛋白表达形式分析，1 ：Protein
ladder ；2，3 ：超声破碎后的上清溶液、菌体沉淀
图 2 融合蛋白的诱导表达
75
kD
1A 2 3 4 5 6 7 8 9 10
55
75
kD
1B 2 3 4 5 6 7 8 9
55
55
kD
1C 2
40
35
（A）不同浓度梯度的尿素溶解包涵体 2 h 分析，1 ：Protein ladder ；2 ：无
IPTG 诱导 ；3 和 4、5 和 6、7 和 8、9 和 10 ：4、6、8、10 mol/L 尿素溶解 2
h 后的上清、菌体沉淀；（B）包涵体的溶解及纯化分析，1：Protein ladder；2，
3 ：无 IPTG 诱导 ；4，5 ：8 mol/L 尿素溶解 5 h 后的上清、菌体沉淀 ；6 ：8 ：
20、40、60 mmol/L imidazole 溶液洗涤 ；9 ：250 mmol/L imidazole 溶液洗脱 ；
（C）Western blot 检测复性后的包涵体蛋白，1 ：Protein ladder ；2 ：复性后包
涵体目的蛋白
图 3 纯化包涵体目的蛋白
2014年第12期 199王倩等：人源 DCF1基因原核表达载体构建及蛋白分离纯化
蛋白 DCF1-TAT 为特异性表达，并且蛋白表达量随
IPTG 浓度的增加而增加，其中 IPTG 浓度在 0.1-0.6
mmol/L 范围内增加显著，在 0.6-1.0 mmol/L 范围内
增加缓慢。而蛋白表达量却不与诱导时间呈现正相
关关系，在诱导 6 h 的时候出现最大值。所以确定
的最优表达条件是 0.6 mmol/L IPTG，诱导培养 6 h。
在最优表达条件下培养转化菌可以提高融合蛋
白的表达量，但是重组外源基因在大肠杆菌中高水
平表达时，往往又会形成细胞内不溶性表达的无活
性的包涵体固体颗粒。Georgiou 等［10-12］发现天然的
蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，如内酰氨酶和碱
性磷酸酶的过量表达，都形成了包涵体，前者的包
涵体在外周质，后者的包涵体存在于细胞质中。本
试验中融合蛋白几乎不溶于上清溶液，主要以包涵
体蛋白形式存在。选用强变性剂尿素溶解包涵体，
通过设置尿素浓度梯度和溶解时间，发现包涵体蛋
白随溶解时间的增加而逐渐溶解于上清溶液中，并
且在 8 mol/L 尿素溶液中溶解量较多。但是由于尿
素在碱性环境中长期保存后，容易分解成异氰酸
盐导致多肽链自由基甲基化，溶解时间不宜过长，
所以确定的最优溶解时间为 5 h，尿素溶解浓度为
8 mol/L。
pET32a 载体带有 6 个 His 标签，是最常用的纯
化蛋白的融合标签，具有相对分子质量小、不影响
目的蛋白的功能，免疫原性相对较低、纯化操作简
单、成本较低等优点［13，14］。溶解后的包涵体蛋白中
还含有大部分的杂蛋白，为了减少杂蛋白对后续蛋
白复性过程中的影响，优先进行蛋白纯化。试验发现，
250 mmol/L imidazole 溶液能够洗脱下高纯度的目的
蛋白，但是大部分目的蛋白在低浓度 imidazole 溶液
洗涤时便会随杂蛋白流出，可能是变性后多肽伸展
完全致使亲和效率降低，所以我们多次回收流出液
并重复纯化，得到大量的纯度较高的目的蛋白。
本试验成功克隆、诱导表达并纯化包涵体蛋白，
摸索出一套改进的构建 DCF1 蛋白的原核表达体
系，获取大量的包涵体目的蛋白。该蛋白可以用于
下一阶段的细胞穿透试验，为进一步研究 DCF1 蛋
白的功能提供了前提条件，也为治疗肿瘤提供新的
思路。
4 结论
成功构建原核表达载体 pET32a-DCF1-TAT。优
化并得到融合蛋白 DCF1-TAT 的最佳诱导表达条
件 ：0.6 mmol/L IPTG 诱导 6 h。该融合蛋白以包涵体
形式存在，经过 8 mol/L 尿素溶液溶解、250 mmol/L
imidazole 溶液洗脱纯化，SDS-PAGE 和 Western bolt
检测结果显示，获取了纯度较高的包涵体目的蛋白。
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（责任编辑 李楠）
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