全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
人源性抗体在 HEK293T细胞中瞬时表达条件的优化
陶俊 向军俭 王宏 龚义平 邓宁
(暨南大学生命科学技术学院 抗体工程中心,广州 510632)
摘 要: 以 HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以 GFP ( green fluo rescence prote in)和人源性
抗 b FGF抗体 1A2为报告基因, 考察了 3种转染试剂磷酸钙, PE I, FuGene HD的转染效率, 确定 FuGene HD的转染效率最高
后, 对 DNAFuG eneHD的比例, 加入氯喹的浓度,转染后的孵育时间,最佳的低温培养温度以及加入组蛋白抑制剂的浓度进
行了优化。结果显示, FuGene HD的转染效率最高,达到 567%。当转染的 DNA= 2g /4 106细胞时, DNAFuGeneHD的
最佳比例为 14(W /V ); 加入氯喹能够增强 FuGeneHD的转染效率, 最佳浓度为 100 m o l/L,转染后的最佳孵育时间为 6 h;低
温诱导能够提高 293T细胞表达抗体的能力, 最佳的温度为 33 ;加入组蛋白抑制剂丁酸钠或丙戊酸能够明显提高抗体的表
达量, 丙戊酸的效果优于丁酸钠。通过对转染试剂, 转染方法, 培养温度, 组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗
bFGF抗体的表达量从 15 mg /L提高到了 151 mg /L。
关键词: 人源性抗体 瞬时表达 优化 HEK293T
Optim ization ofHuman Antibody Gene Transient
Expression in HEK293T Cell
Tao Jun X iang Jun jian W angH ong GongY iping DengN ing
( Lab ofM olecular Immunology and Antibody Engineering, Life Science and T echnological College, J inan University, Guangzhou 510632)
Abstrac:t The study w as to optim ize the condition o f hum an antibody gene transient expression in HEK 293T ce l.l The transfec
tion reagent and conditions, ratio o f DNAFuGenew ere optim ized by using GFP( green fluo rescence prote in) as report gene. The Influ
ences of ch loroqu ine on transfec tion effic iency w ere investig ated. The effects o f low temperature and h istone deacety lase inhib itors on an
tibody gene expression w ere investig ated using hum an pIgG1A2 wh ich con tain ing hum an antibFGF an tibody gene as report gene. The
best transfection reagen is FuGeneHD and the optim a l transfection effic iency w as ob tained w hen the ratio of fo re ign DNAFuGeneH D
= 1 4(W /V ) , DNA= 2 g /4 106 cells. Ch lo roqu ine enhanced the transfection effic iency o f FuGeneH D, and it w as found that low
tem pera ture can enhance antibody express ion. H istone deacety lase inhib itors, such as sodium buty ra te and valpro ic ac id can im prove an
tibody express ion, and the effect o f va lpro ic acid was bette r than sodium butyrate. Through optim izing transfection reagen, transfection
m ethodes, cu lture temperature and added h istone deace tylase inhibitors, the express ion o f hum an antibFGF an tibody in 293T cells w as
increased tenfo ld from 1 5 m g /L to 15 1 m g /L.
Key words: Human antibody T ransient expression Optim ization HEK293T
收稿日期: 20100401
基金项目:国家科技计划 863专题课题 ( 2009AA02Z112)
作者简介:陶俊,男,博士研究生,主要从事基因工程抗体的研究; Em ai:l tao jun811004@ s ina com
通讯作者:邓宁,男,教授,博士生导师,主要从事人源性抗体的研制; Em ai:l tdengn@ jnu edu cn
在过去的 10年间, 随着抗体工程技术的发展,
抗体药物的研究与开发已成为生物制药领域的热
点。到 2009年 6月, 美国 FDA已经批准的治疗性
全抗体有 22种, 进入临床研究的全抗体有 100多
种,据估计全世界目前有超过 1 000种重组抗体正
在各生物制药公司研制, 超过 200种已进入临床试
验 [ 1]。抗体药物在肿瘤、感染、心血管疾病、自身免
疫病等多种疾病的治疗中有着巨大的潜力和应用
前景。
稳定的基因表达技术是指外源基因进入受体细
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胞后, 经过加压筛选能整合到宿主细胞染色体上,外
源基因的表达不会随细胞的分裂而减少。稳定表达
是抗体药物生产系统的金标准;然而,其过程耗费时
间长, 费用高,不利于大通量、高效率地筛选新的抗
体药物 [ 2]。瞬时基因表达技术是指外源基因进入
受体细胞后, 存在于游离的载体上, 不整合至染色
体,较短时间内就可获得目的基因的表达产物,但随
着细胞的分裂增殖,这种外源基因最终会消失,持续
时间为几天到两周。此技术大大缩短了微量至中等
量 (几毫克到几百毫克 )重组抗体的生产过程, 从而
为抗体药物的早期筛选和功能、毒理分析提供有效
的手段 [ 3]。
瞬时基因表达技术常用的宿主细胞有 293细
胞、CHO细胞等,其中 CHO细胞是目前重组蛋白药
物生产的首选体系, 对于 293细胞等表达系统的安
全性尚缺乏足够的依据 [ 4] , 但与 CHO细胞相比 293
细胞具有生长速度快, 易于转染, 外源蛋白表达量
高,对低血清培养耐受性好等优点,在抗体药物的快
速高效表达和功能分析时,具有很好的优势 [ 5]。
本研究将以 HEK293T细胞为基础,使用绿色荧
光蛋白作为 ( green f luorescence prote in, GFP)报告基
因,考察在 HEK293T细胞中最优的瞬时表达转染条
件,并对随后的表达条件进行优化,从而建立了一套
高效的瞬时表达系统, 为本实验室人源性抗体研发
平台的建立打下坚实基础。
1 材料和方法
11 材料
111 材料 去内毒素制粒抽提试剂盒购于 Ome
ga公司, PE I(聚乙亚胺 )购自于 Polysciences, 氯喹,
丙戊酸,磷酸钙转染试剂盒购自于 Sigma公司, Fu
G ene HD购自于 Roch公司。
112 菌种和细胞 大肠杆菌 DH5, HEK293T细
胞均为本室保存, 表达载体 p lgG由美国 Scripps研
究所的 C. F. Barbas III惠赠, PCDNA31购自于美
国 Inv itrogen公司,插入人源性抗 bFGF抗体基因的
plgG1A2,插入 GFP基因的 PCDNA31GFP由本室
保存。
113 培养基 DMEM干粉购自美国 G ibco公司,
胎牛血清购自兰州民海公司, 培养基 opt iMEM I低
血清培养基购自于美国 Inv itrogen公司。
12 方法
121 细胞培养 HEK293T 细胞培养基为
DMEM + 10%胎牛血清 ( FBS) , 37 , 5% CO2恒温培
养箱培养。细胞复苏之后,在 25 cm 2方瓶中传代培
养。细胞长满瓶底约 80%时, 025% (W /V )胰酶消
化, 110进行传代,保证细胞良好的生长状态。
122 质粒准备 质粒抽提使用无内毒素质粒大
抽试剂盒。提取后,核酸电泳确定分子量大小,同时
使用微量核酸蛋白测量仪 B ioPhotometer p lus( E p
pendo f公司 )测定 A 260 /A 280, 比例在 180- 195之
间方可使用,同时进行质粒定量。
123 细胞转染 将 HEK293T细胞接种 6孔板,
每孔 2 105细胞,培养 16- 24 h, 待细胞 60% 汇合
时进行转染。每孔转染 2 g质粒, 当用 PE I转染
时, 按质量比为 41配置 PE I /DNA混合液, 2 g质
粒稀释在 50 L 150 mmo l/L NaC l溶液, 对应量的
PE I同样稀释在 50 L 150 mmo l/L NaC l溶液中然
后将 PE I溶液与对应的质粒溶液混合,立即短暂涡
旋 1次,然后室温温育 15m in,吸去细胞培养板中的
培养液, 应用 PBS洗 1次, 每孔加入 1 mL无血清
DMEM。将 PE I/DNA混合物加入细胞培养孔中, 边
加边晃动培养板, 充分混匀后放入细胞培养箱中培
养。培养 4 h后, 吸去转染液, 每孔加入 2 mL 含
10% 血清的 DMEM继续培养 48 h后观察 GFP表达
情况。当用磷酸钙转染时, 在 15 mL EP管中依次
加入 ddH2O 49 L, 25 mo l/L C aC l2 6 L, DNA
5 g,充分混匀,在剧烈吹泡吹打下, 逐滴加入 60 L
2 HBSP溶液, 室温静置 20 m in。将细胞用无血
清培养基洗涤 2次, 加入含 FBS 2% 的 DMEM 1
mL, ,迅速加入 DNA CaPi复合物, 混匀后放入细
胞培养箱中培养 12 h后, 15 mm ol /L PBS洗涤 2
次, 加入 10%甘油休克 2 m in, PBS洗涤 2次后 ,
每孔加入 2 mL含 10% 血清的 DMEM 继续培养
48 h后观察 GFP表达情况。 FuGeneHD的转染
过程与 PE I转染相同。所用的 FuG ene /DNA的比
例为 31。
124 FuGeneHD与 DNA最佳比例的确定 将 2
g质粒稀释在 100 L 150 mmo l/L N aC l溶液或
optiMEM I低血清培养基中, 涡旋混匀, 分别加入
0、2、4、6、8、10和 12 L FuG ene HD, 涡旋混匀后室
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2010年第 11期 陶俊等 :人源性抗体在 HEK293T细胞中瞬时表达条件的优化
温放置 15m in后加入到培养在无血清 DMEM 中的
细胞中, 混匀后放入细胞培养箱中培养, 4 h后
换液。
125 氯喹对 FuGeneHD转染效率的影响 转染
前 1 h无血清 DMEM洗涤细胞 2次,加入含 2% FBS
的 DMEM培养基,同时加入终浓度分别为 0、25、50、
100 mo l/L的氯喹, 其余过程同 12。48 h后观察
GFP表达情况。
126 转染复合物与细胞作用时间 转染前 24 h,
将 293T细胞消化并用 PBS洗涤 1次以形成单细胞
悬液, 计数, 接种在 6孔板上, 2 105细胞 /孔。转染
前 1 h无血清 DMEM洗涤细胞两次,加入含 2% FBS
的 DMEM培养基, 同时加入终浓度 100 mol/L的
氯喹, 按 FuGene /DNA = 4, 每孔转染 2 g的 PCD
NA31GFP质粒。细胞转染前, 用 PBS洗 1次, 每
孔加入 1 mL无血清 DMEM。然后加入转染复合
物, 复合物与细胞温育的时间分别设 2、4、6、8、
12 h五组,每组平行取样 3次。温育后每孔加入
2 mL含 10% FBS的 DMEM, 48 h后观察 GFP表
达情况。
127 转染后不同培养温度对 293T细胞表达抗体
的影响 转染换液之后, 将细胞分别放入 37 、
32 和 29 细胞培养箱中培养 48 h后检测细胞培
养上清中抗体表达情况。
128 组蛋白脱乙酰基抑制剂对 293T细胞表达抗
体的影响 转染 4 h后换液, 换液时加入不同浓度
的组蛋白脱乙酰基抑制剂丙戊酸或丁酸钠, 混匀后
将细胞放置于低温细胞培养箱中培养, 72 h检测细
胞培养上清中抗体表达情况。
129 夹心 ELISA检测细胞培养上清中抗体的浓
度 以 10mg /L羊抗人 Fab多抗包被酶标板, 加细
胞培养上清反应后, 再加羊抗人 IgG Fc片段AP标
记的抗体孵育,显色, 测 A405值,试验以 293T细胞上
清为阴性对照。
1210 细胞计数和转染率的计算 细胞计数使
用血细胞计数板。活性测定使用 Trypan B lue染色
后再进行计数, 细胞活性 = 活细胞数 /总细胞数
100%。转染效率分析使用倒置荧光显微镜进行计
数,每个板孔取 4个不同视野进行计数,转染效率的
计算公式为转染效率 =转染后表达 GFP的细胞 /转
染后的总细胞数 100%。
2 结果
21 不同转染试剂转染 293T的转染效率
比较几种不同转染试剂转染 293T的转染效率,
转染 48 h后,根据表达绿色荧光蛋白的细胞与总的
细胞数目计算转染率, 其中 PE I的转染率最低为
406% ,磷酸钙次之为 466% , FuGene HD的转染
效率最高,为 567% (图 1)。
图 1 三种不同的转染试剂转染 293T
细胞的转染效率
22 FuGeneHD转染条件的优化
因为 FuG eneHD的转染效率最高, 因此选择它
作为最终的转染试剂, 但还要进一步确定 FuG ene
HD与 DNA的最佳比例。根据 FuGeneHD的使用
说明, 选取 6个比例进行比较, 结果显示 FuG ene
HD /DNA为 41时,以 optiMEM I低血清培养基为
稀释液时,转染效率最高,达到 85% (图 2)。
图 2 DNAFuG ene对转染效率和细胞数目的影响
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23 氯喹浓度对 FuG eneHD转染效率的影响
有研究报道, 氯喹能增加脂质体转染效率, 因
此,转染前 1 h对细胞换液后, 加入不同浓度的氯
喹, 48 h后 GFP的表达情况显示加入 100 mol/L的
氯喹能够显著提高 FuGeneHD的转染效率 (图 3)。
图 3 转染早期氯喹浓度对 FuGene HD /DNA
转染效率的影响
24 转染复合物与细胞作用时间对转染效率的影响
延长 FuGene /DNA复合物与细胞接触的时间
能增加 FuG eneHD /DNA复合物转染细胞比例。在
接触 6 h时吸除 FuGeneHD /DNA转染液,更换新鲜
培养液,效果最佳,达到 90%左右 (图 4)。
图 4 转染复合物与细胞作用时间对转染效率的影响
25 转染后不同培养温度对 293T细胞表达抗体的
影响
低温诱导能够增加哺乳动物细胞表达外源
蛋白的量 ,为确定 293T细胞的最佳诱导温度, 设
置了 3个不同温度, 48 h后检测细胞培养上清中
抗体的浓度发现, 32 培养时, 表达抗体浓度最
高 (图 5)。
图 5 温度对 293T细胞表达抗体的影响
抗体表达的影响
26 组蛋白脱乙酰基抑制剂对 293T细胞表达抗体
的影响
组蛋白脱乙酰基抑制剂 ( Hi DACs)能够增加大
多数哺乳动物细胞的能力, 本研究选取了一种常用
的组蛋白脱乙酰基抑制剂丁酸钠和一种最近才报道
的丙戊酸进行比较, 结果 (图 6)显示丙戊酸在终浓
度为 4 mmo l/L时抗体表达量最高,丁酸钠在终浓度
为3 mmo l/L抗体表达量最高, 丙戊酸促进细胞表达
抗体的作用略高于丁酸钠。
图 6 不同种类和剂量的组蛋白脱乙酰基抑制剂
对 293T细胞表达抗体的影响
3 讨论
基因瞬时表达技术在较短时间内就可获得目的
基因的表达产物,基因瞬时表达方法为重组抗体的筛
选和鉴定提供了一种快速、方便的方法。HEK293T
细胞由 293细胞派生,同时表达 SV40大 T抗原,含有
SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。与
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CHO细胞相比 293细胞具有生长速度快,易于转染,
外源蛋白表达量高,对低血清培养耐受性好等优点,
在抗体药物的快速高效表达和功能分析时, 具有很好
的优势。
本研究考察了以 HEK293T细胞为宿主的瞬时
抗体基因转染及表达条件的优化。以 PCDNA31
GFP为报告基因,比较了 3种常用转染试剂的转染
效率, 结果提示, roch公司的转染试剂 FuGene HD
的转染效率优于 PE I和磷酸钙, 随后考察了 DNA
FuG eneHD比例对转染效率和细胞数目的影响,
DNA用量固定在 2 g /2 106细胞, DNAFuGene
HD从 10到 18变化。当 DNAFuG ene HD从10
到 14变化时细胞仅有轻微减少,转染效率提高;但
当 DNAFuG ene从 15到 18变化时细胞明显减少
转染效率也随之下降, 随着 DNAFuG ene HD比例
的提高, FuGeneHD对细胞的毒性越来越明显,部分
细胞死亡,当 DNAFuG eneHD= 14(W /V )时,转染
效率及细胞数达到最优。
尽管 FuG ene HD转染质粒不依赖于溶酶体抑
制剂, 但是溶酶体抑制剂氯喹可以增加聚乙烯亚胺
的转染效率。这说明 FuGeneHD /DNA复合物进入
细胞后,要经过溶酶体这一关卡。氯喹有一定的细
胞毒性, 长时间孵育会增强 FuGene HD的细胞毒
性,因此需摸索加入氯喹和 FuGeneHD的最佳孵育
时间, 结果显示孵育 6 h为转染染效率最高细胞数
目也没有明显减少。
已有多篇文献报道低温孵育能够增强动物细胞
表达外源蛋白的能力 [ 7, 8] , 但对于 293T细胞的报道
较少, 本研究考察了 4个温度下 293T细胞表达抗体
的情况,通过测定细胞培养上清中人源性抗体的浓
度来确定最佳孵育温度, 结果显示诱导温度为 33
抗体的表达量最高。
Backliwa l等 [ 9 ]比较了多种组蛋白脱乙酰基抑
制剂增强 HEK293E细胞表达人源性抗体的效果,
结果显示丙戊酸和丁酸钠的效果最好, 本试验考察
了这两种试剂增强 293T细胞表达人源性抗体的效
果, 结果显示丁酸钠和丙戊酸在终浓度为 3 mmo l/L
和 4mmo l /L时抗体表达量最高, 丙戊酸的效果要略
好于丁酸钠,能使抗体的表达量提高 5倍左右。
综上所述,我们通过对一系列条件的优化, 使人
源性抗体在 293T细胞中的瞬时表达量从 15 mg /L
提高到了 151mg /L。在 14 cm培养皿中转染 4 106
细胞,通过 8 d的低温培养表达,其间换液 3次, 总共
能收集到 1mg的抗体,基本上满足了细胞试验的需
求, 从而为快速有效的筛选具有中和活性的人源性
bFGF抗体奠定了基础。
参 考 文 献
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