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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-12-22
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31160236）, 宁夏自然科学基金项目（NZ1028, NZ1031）
作者简介 : 胡海英 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 分子生物学 ; E-mail: haiying@nxu.edu.cn
通讯作者 : 姚新灵 , 教授 , 研究方向 : 植物基因工程 ; E-mail: chinanoahl@163.com
E. coli中表达马铃薯 OSM-3b基因对增强
渗透胁迫抗性的分析
胡海英 石晶 戴海霞 蔡倩 崔雪琼 冯秀娟 黄琦 姚新灵
（宁夏大学 西部特色生物资源保护及利用教育部重点实验室，银川 750021）
摘 要： 旨在揭示马铃薯 OSM-3b基因表达对胁迫的响应。分离获得了 OSM-3b的 cDNA，构建 OSM-3b的重组菌株 DH-
OSM，实现 OSM-3b在大肠杆菌中的表达，RT-PCR检测了 NaCl和 PEG6000不同浓度梯度下 OSM-3b的表达。结果显示，NaCl浓度
在 1%以上随盐浓度升高，OSM-3b mRNA的表达逐渐下降；在 PEG6000浓度从 0.25%升至 4.0%时，OSM-3b的 mRNA表达明显上升；
在 NaCl胁迫和 PEG6000浓度梯度渗透胁迫下，重组菌株 DH-OSM菌的菌落存活数统计分析结果显示，在不同 NaCl浓度下重组菌
的菌落存活数与对照趋势一致，重组菌菌落存活数峰值出现在的 PEG6000浓度 2.0%时，而对照菌 DH-28c峰值则出现在 PEG6000
浓度 1.0%时。结果表明，OSM-3b在大肠杆菌中表达对 NaCl胁迫没有响应，但可缓冲渗透胁迫对其存活的影响。
关键词： OSM 表达 NaCl胁迫 渗透胁迫
Analysis of Resistance on Osmotic Stress in Expression of
Potato OSM-3b Gene in E. coli
Hu Haiying Shi Jing Dai Haixia Cai Qian Cui Xueqiong Feng Xiujuan Huang Qi Yao Xinling
（WBRPU Lab of National Education Ministry, Ningxia University, Yinchuan 750021）
Abstract: It was to disclose response of potato OSM-3b expression on stress, OSM-3b was isolated from young leafs of potato
and subcloned in pET-28c to generate a recombinant strain DH-OSM. RT-PCR tested expression of OSM-3b in the strain under stress of
concentration gradients of NaCl and PEG6000. The result showed that expression of OSM-3b mRNA went down while NaCl concentration, started
from 1.0% went up. Contrarily, expression of OSM-3b mRNA increased clearly along with PEG6000 concentration from 0.25% up to 4.0%.
Colony survival livability （CSL） of the DH-OSM, under stress of NaCl and PEG6000 was analyzed statistically. CSL of the DH-OSM and control
strain were idential in general under stress of NaCl. The peak CSL of the DH-OSM occurred at 2.0% of PEG6000, while it was at 1% of PEG6000
the peak CSV took place for DH-28c. The conclusion of this study was that OSM-3b expression in E. coli leads to no response of NaCl stress, but
buffers effect of osmotic stress on survival of colonies.
Key words: OSM Expression NaCl stress Osmotic stress
Osmotin（OSM）首先是在烟草（Nicotiana taba-
cum）细胞体外培养过程中发现的蛋白质，由 250 个
氨基酸组成，从龙葵（Solanum nigrum）中分离的
OSM 基因 SnOLP 编码 247 个氨基酸组成的多肽，
OSM 结构类似于甜味蛋白［1-3］。植物中 OSM 特异地
结合 ORE20/PHO36 编码的膜转运受体［4］。
大肠杆菌中表达、纯化和分离了烟草和龙葵
OSM［5, 6, 8, 9］，体外条件下诱导其 8 个二硫键形成、
且构象完整的 SnOLP 对镰刀菌和桑树内生真菌具
有抗菌活性［7］。OSM 可能是通过真菌细胞壁而渗
透到质膜，消除其 pH 梯度发挥作用［5］，从牛角瓜
（Calotropis procera latex） 中 纯 化 的 OSM（CpOsm）
在全 pH 范围内抑制茄病镰刀菌孢子萌发，似乎证
实了其对质膜 pH 梯度的效应［8］。
2012年第6期 67胡海英等 ：E. coli中表达马铃薯 OSM-3b 基因对增强渗透胁迫抗性的分析
对 OSM 功能更多的研究集中于其在植物抗逆代
谢方面。烟草幼苗 OSM 基因启动子可被 NaCl、受伤、
ABA 和乙烯利激活，但随着幼苗成长，其对 ABA 和
乙烯利的诱导不再敏感［9］；ABA、水杨酸和机械损
伤可诱导草莓 OSM-like 蛋白编码基因的 FaOLP2 表
达［10］。在 250 mmol/L NaCl 条件下，表达烟草 OSM
基因的小麦具有极强的生根能力，且对高盐的抗性
显著高于对照［11］。转化烟草 OSM 于番茄体内表达，
提高了转化株系的耐盐和耐旱性［12］。盐胁迫诱导体
外培养的烟草细胞 OSM 的高水平积累，ABA 可诱导
烟草细胞 OSM mRNA 的显著增加，但 OSM 却没有
明显增加［1］。盐胁迫下植物细胞 OSM 高水平积累，
而真菌质膜 pH 梯度对 OSM 敏感，两者结论似乎表
明，对 OSM 敏感真菌质膜尚不具备植物细胞质膜所
具有的 OSM 调控胁迫响应机制，但植物自身 OSM
如何响应胁迫的分子机制尚属未知。
本实验室在筛选干旱胁迫马铃薯消减 cDNA 文
库时，发现了文库中出现频率较高的 OSM 基因 EST，
BLAST 检索发现其与 OSM-3b 100% 同源，OSM-3b
是 NCBI 数据库中记载的 AY737310 序列中的一个预
测基因，AY737310 是马铃薯晚疫病抗性相关基因研
究中识别的基因组 DNA［13］，目前未见 OSM-3b 功能
证实的研究报道。本研究旨在初步揭示 OSM-3b 基
因的功能，为确定其在原核和真核细胞表达区别的
机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
TRIZOL 试剂盒、DNA Marker DL2000、DNA Mar-
ker DL15000、Taq DNA 聚合酶、PCR Mixture、琼脂
糖凝胶回收试剂盒、琼脂糖、X-GAL、IPTG、卡那霉素、
氯仿、异戊醇、异丙醇均购自北京天根公司。
1.2 方法
1.2.1 OSM 基因 cDNA 获得 以当地耐旱马铃薯品
种宁 4 苗期干旱胁迫和非胁迫处理，建立干旱胁迫叶
消减 cDNA 文库，文库筛选获得干旱胁迫叶片特意
表达 ESTs 6 个，其中之一与马铃薯 OSM 基因（TC-
195363）DNA 序列同源，依马铃薯 OSM 基因（TC-
195363）DNA 序列同源 TC195363 设计 OSM 基因
cDNA 分离引物，OF ：5-TATGCTGCCACTATCGAG-
GTAC-3；OR：5-AACCAACTGGGCTATTAAGATT-3
为引物 ；以马铃薯品种宁薯 4 号直立茎总 RNA 为
模板，按照 TaKaRa 试剂盒说明进行 RT-PCR，反
应程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 45 s，53℃ 30 s，72℃
1 min，共 30 个循环 ；72℃ 10 min。
取扩增产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定，按胶回收
试剂盒（Promega）说明回收扩增产物。按 pGEM-T
Easy Vector System I（Promega）说明完成 OSM 基因
cDNA 连接载体及转化 DH5α 感受态细胞，平板过
夜培养后，挑取白色单克隆菌落至 5 mL 含 50 μg/mL
卡那霉素 LB 液体培养基中，37℃、150 r/min 过夜
培养，提取质粒，酶切和测序（上海生工）鉴定正
确的菌株为 pG-OSM。
1.2.2 OSM 原核表达载体构建及表达检测 分别
提取、纯化 pG-OSM 和 pET-28c 质粒 DNA（本实验
室保存），用 NcoⅠ和 NdeⅠ（TaKaRa 产品）分别
双酶切 pG-OSM 和 pET-28c 质粒 DNA，回收 OSM
cDNA 和 pET-28c 质粒 DNA，按照说明建立 T4 DNA
连接酶反应体系，将连接产物转化 DH5α（本实验
室保存）感受态细胞，均匀涂布于含 50 μg/mL 卡
那霉素 LB 平板上，37℃倒置培养过夜。随机挑选
克隆双酶切鉴定，获得 OSM 基因原核表达重组菌
DH-pE-OSM。以 OF 和 OR 为引物进行 OSM 基因
表达的半定量检测，检测步骤按照产品说明进行。
表达重组菌 pEOSM 目的蛋白质分离按照产品说明
进行。
1.2.3 OSM 抗渗透胁迫检测 依据预试验结果，按
照 W/V 比制成含有不同浓度 PEG6000 的卡那霉素抗
性 LB 培养基，PEG6000 浓度梯度设定 0、1.0%、0.5%、
1.0%、2.0% 和 4.0%。将活化的重组 DH-pEOSM 菌
和对照菌 DH5α、DH-28C 菌液分别涂布于同一浓度
PEG6000（Sigma）平板的各半圆区域，每一浓度设
置 3 次重复。37℃倒置暗培养 14 h 后，计录各浓度
PEG6000 处理各次重复平板中 DH-pEOSM 和对照菌
菌落数，用 SPSS 对数据进行 ANOVA 差异显著性检
验，用 Excel 作图。
1.2.4 OSM耐盐性检测 依据预试验结果，按照W/V
比制成含有不同浓度 NaCl 的卡那霉素抗性 LB 培养
基，NaCl 浓度梯度设定 0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%
和 3.0%。重组菌和对照设置、培养、数据统计分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期68
同抗渗透胁迫检测。
2 结果
2.1　STOSM基因分离及重组菌构建
RT-PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳发现其大小
与预期大小一致，如图 1-A 所示，经回收纯化后连
接 pGEM-T 载体，获得的 pG-OSM 酶切分析结果如
图 1-B 所示，NcoⅠ和 NdeⅠ酶切片段大小与预期
大小一致。pG-OSM 中目的 DNA 片段测序结果显示，
所分离的 OSM 基因 cDNA 大小为 741 bp ；BLAST 检
索发现，获得的 cDNA 序列与 NCBI 核酸数据库中，
由马铃薯 AY737310 序列推测的 OSM-3b 序列 100%
同源［17］，将其命名为 OSM-3b，与 DFCI 数据库记载
的 TC195363 序列 100% 同源，预测 OSM-3b 编码的
247 个氨基酸组成的多肽。
转化重组菌 DH-pE-OSM 于 5 mL 含有卡那霉素
（50 mg/mL）的 LB 液体培养基中生长 12 h 后，提取
pE-OSM 质粒，用限制性内切酶 NcoⅠ和 NdeⅠ双
酶切鉴定，在 750 bp 附近均出现一条特异性条带，
条带大小与预期目的片段大小相符，如图 1-C 所示，
表明重组菌 DH-pE-OSM 构建正确。
A. RT-PCT 获得 OSM-3b cDNA，约 768 bp OSM-3b 基因 cDNA，M. DL2000 DNA Marker；B. pG-OSM 质粒 DNA 酶切结果，
1. pG-OSM 质粒，2. pG-OSM 质粒 NcoⅠ和 NdeⅠ双酶切产物，M. 1 kb plus DNA Ladder；C. pE-OSM 质粒 DNA 酶切结果，
M. 1 kb plus DNA Ladder，1. pE-OSM 质粒，2. pE-OSM 质粒 NcoⅠ和 NdeⅠ双酶切获得 816 bp 条带
图 1 OSM-3b cDNA分离及重组菌 DH-OSM构建琼脂糖凝胶电泳鉴定结果
2.2　OSM-3b基因在原核表达
重组菌 DH-pE-OSM 总 RNA 为模板半定量 RT-
PCT，结果显示，在 NaCl 浓度由 0 升至 1.0%，OSM-
3b 基因 mRNA 表达量呈上升趋势，其后随 NaCl 浓
度升高，mRNA 逐渐下降，1.0% NaCl 浓度是 OSM-
3b 基因 mRNA 表达的峰值，如图 2-A 所示。
在 0-4.0% PEG6000 浓 度 梯 度 下，OSM-3b 基
因 mRNA 表达趋势不同于 NaCl，随 PEG 浓度升高，
OSM-3b 基因 mRNA 表达量呈上升趋势，在 2.0%
PEG6000 浓度时，OSM-3b 基因 mRNA 表达量达到
峰值，4.0% PEG6000 浓度时，其表达量仍然维持较
高水平，如图 2-B 所示。
2.3 OSM-3b对盐胁迫的响应
各 NaCl 浓度下重组 DH-pE-OSM 菌和对照菌平
板计数统计结果表明，随着 NaCl 浓度从 0-3.0% 升
高，重组菌 DH-pE-OSM 和对照菌菌落数呈现先增加
后减低的一致趋向，当 NaCl 浓度为 1% 时，对照菌
DH5α、DH-28C 和重组菌 DH-pE-OSM 三者出现菌落
存活数峰值 ；各 NaCl 浓度下，对照菌 DH5α 菌落存
活数显著低于重组菌 DH-pEOSM（P<0.05），而重组
菌 DH-pEOSM 菌落存活数显著低于对照菌 DH-28C
（P<0.05），如图 3 所示。尽管各 NaCl 浓度下三者菌
株菌落存活数存在显著差异（P<0.05），但其峰值浓
A: 1-7. 分别为 DH-28C 对照、0、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% NaCl，
M. DL2000 DNA Marker；B: 1-7. 分别为 DH-28C 对照、0、0.25%、0.5%、
1.0%、2.0%、4.0% PEG6000，M. DL2000 DNA Marker
图 2 胁迫处理下重组菌 OSM-3b表达的 RT-PCR
定性检测结果
2012年第6期 69胡海英等 ：E. coli中表达马铃薯 OSM-3b 基因对增强渗透胁迫抗性的分析
度及趋势一致，表明重组菌中表达 OSM-3b 对 NaCl
胁迫没有显著影响（P<0.05）。
DH-pE-OSM 对 PEG6000 渗透胁迫的耐受能力强于
DH-28c。
3 讨论
生物大分子的存在及其活性依赖于水、温度、
pH 和盐等因素，渗透胁迫是测定水对生物大分子影
响的方法。本研究选用PEG6000作为渗透胁迫成分，
按照 Michael 的方法，设计了胁迫条件下细菌适应及
生存试验，在其对数生长期结束后统计菌落计数［14］，
在不同时间重复试验 3 次，得出相同结论。
有研究显示，随 NaCl 浓度增加，大肠杆菌细
胞膜的脂双分子层的囊泡融合增强、同时具备高通
透性、且大小不同的通道出现在脂双分子层 ；同时，
NaCl 诱导的钾离子通道 KcsA 聚集具有特异性［15］。
目前尚未见真核细胞膜通过囊泡融合作用增强通透
性的报道，真核和原核细胞膜对高浓度的 NaCl 可能
会有不同的响应。大肠杆菌可在一定高浓度 NaCl 下
存活和生长是其长期进化的结果，NaCl 是其生命活
动的矿物营养，而 PEG6000 不是大肠杆菌细胞代谢
营养成分，PEG6000 在大肠杆菌生长环境中带来的
结果是物理缺水。因此，本研究中对大肠杆菌渗透
胁迫源自 PEG6000，而不是 NaCl。
OSM-3b 基因在大肠杆菌中不能独立对高浓度
图 3 不同 NaCl浓度下 DH-OSM菌落数
图 5 PEG6000渗透胁迫下 DH-OSM相对存活数
2.4 OSM-3b对渗透胁迫的响应
正常 LB 固体培养基中，以不同浓度 PEG6000
控制培养基渗透势，产生对 E. coli生长的渗透胁迫，
各 PEG6000 浓度下重组 DH-pE-OSM 菌和对照菌平
板计数统计结果显示，随着 PEG6000 浓度从 0-4.0%
升高，重组菌和对照菌菌落数呈现先增加后减低的
一致趋向，当 PEG6000 浓度为 0.5% 和 1.0% 时，对
照菌 DH5α 和 DH-28C 菌落存活数出现峰值，而重
组菌 DH-pE-OSM 菌落存活数的峰值出现在 PEG6000
浓度为 2.0% 时，另外，ANOVA 检验表明，两者峰
值无显著差异（P<0.05）。PEG6000浓度达到2.0%前，
各浓度下对照菌 DH-28C 菌落存活数显著高于重组
菌 DH-pE-OSM（P<0.05），其后呈相反趋势 ；在各
浓度下对照菌 DH5α 菌落存活数显著低于重组菌
DH-pE-OSM（P<0.05），如图 4 所示。以同 PEG6000
浓度下重组菌菌落数和对照菌 DH-28C 菌落数的比
值菌落存活率，存活率计算结果表明，在 PEG6000
浓度超过 0.5% 后，重组菌相对存活率呈显著上升趋
势（P<0.05），如图 5 所示。这些结果表明，在不同
培养基渗透势条件下，虽然重组菌的生长不及对照
菌 DH-28C，但重组菌可耐受更高浓度的 PEG6000，
重组菌对渗透胁迫的耐受性强于对照菌 DH-28C 和
DH5α，也即重组菌中表达 OSM-3b 缓冲了渗透胁迫
对其生长的影响。
PEG600 浓度和 NaCl 浓度梯度下，重组菌 DH-
pE-OSM 平均菌落数介于对照 DH5α 和 DH-28c 之
间，这表明与 DH-28c 相比，重组质粒 pE-OSM 中，
OSM-3b 基因的表达在一定程度上抑制了重组菌 DH-
pE-OSM 的生长，但当 PEG6000 浓度高于 2% 后，
图 4 PEG6000渗透胁迫下 DH-OSM菌落存活数
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期70
NaCl 胁迫产生响应的结果表明，高浓度 NaCl 胁迫
导致的脂双分子层的囊泡融合和通道的形成增强没
有受到 OSM-3b 存在的影响，这意味着研究所用重
组菌和对照菌并没有因高浓度 NaCl 的存在而产生物
理缺水，没有形成对其生长的渗透胁迫。
尽管尚需更多物理缺水的试验证明渗透胁迫和
盐胁迫对细胞生长影响的区别，但本研究的结论来
自物理缺水造成的渗透胁迫，高浓度 NaCl 没有对细
胞生长产生物理缺水，从而未造成渗透胁迫，因此，
物理缺水产生的渗透胁迫诱导 OSM-3b 在大肠杆菌
中表达。2011 年 Ueno 等［16］报道盐胁迫和静水压造
成的渗透胁迫对大肠杆菌生长的影响发现，在中等
盐浓度下，渗透胁迫与盐胁迫对大肠杆菌生长的影
响存在显著差异，细胞生长和代谢对两种胁迫产生
不同响应。这与本研究所得结论一致。
本实验室首次对 OSM-3b 的功能进行初步研究，
因植物 OSM 是一较大的基因家族，揭示其所有的功
能还需建立体内表达模型，明确其表达产物参与代
谢途径的调控网络，才能确定其在原核和真核细胞
表达区别的机理。
4 结论
本研究从干旱胁迫马铃薯消减 cDNA 文库中，
分离获得了 OSM-3b 的 cDNA，OSM-3b 原核表达结
果分析表明，随着 PEG6000 形成的渗透胁迫加重，
OSM-3b mRNA 表达增加，重组菌对渗透胁迫抗性增
强，这意味着外源基因 OSM-3b 的表达产物 OSM 参
与了重组菌对渗透胁迫的响应代谢，但 OSM-3b 在
大肠杆菌中表达对 NaCl 胁迫没有响应。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）