全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-12-02
基金项目 : 西南林业大学科技创新基金项目（1105）, 云南省自然科学基金项目（2010CD065）, 北京林业大学林木育种国家工程实验室开放
基金项目 （FOP2010-10）, 云南省教育厅重点项目（2010Z042）
作者简介 : 张瑞丽 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 林木遗传育种 ; E-mail: zhangruili4545@163.com
通讯作者 : 段安安 , 男 , 博士 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 林木遗传育种的教学与研究 ; E-mail: duananan@gmail.com
云南松 SSR-PCR反应体系的建立与优化
张瑞丽1 许玉兰1,2 王大玮1 吕学辉1 何承忠1 段安安1
（1 西南林业大学 西南山地森林保育与利用省部共建教育部重点实验室，昆明 650224 ；2 北京林业大学 林木育种国家工程实验室
林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京 100083）
摘 要： 为了建立适宜云南松 SSR-PCR的反应体系和扩增程序，利用近缘种火炬松的引物，采用正交设计 L16（45）对云南
松 SSR-PCR反应体系的 5因素（Taq酶、Mg2+、模板 DNA、dNTP、引物）在 4个水平上进行优化，筛选出各反应因素的最佳水平，
建立了适于云南松的 SSR反应体系。在 10 μL的反应体系中，模板 DNA的用量为 30.0 ng，Taq DNA聚合酶的用量为 1.0 U，Mg2+
的浓度为 2.0 mmol/L，dNTPs浓度为 0.4 mmol/L，引物的浓度为 0.2 μmol/L。扩增程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性 45 s，48℃
退火 30 s，72℃延伸 30 s，30个循环；72℃延长 10 min，4℃保存。最后利用 1个居群对该体系进行稳定性验证，结果可用于云南
松 SSR标记的研究。
关键词： 云南松 SSR 优化 正交设计
Establishment and Optimization of the SSR Reaction System for Pinus
yunnanensis Using Orthogonal Design
Zhang Ruili1 Xu Yulan1, 2 Wang Dawei1 Lü Xuehui1 He Chengzhong1 Duan Anan1
（1Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry
University, Kunming 650224； 2National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory for Genetics and Breeding of
Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083）
Abstract: In order to establish and optimize the SSR-PCR reaction amplification system and procedures of Pinus yunnanensis, the known
primers from related species-Pinus taeda were employed, orthogonal design L16 （45） on Yunnan pine SSR-PCR reaction system of 5 elements
（Taq enzyme, Mg2+, template DNA, dNTP, primers） in the four levels of optimization was established, filtering out the best level of response
factors established for the SSR Pinus reaction. An optimal 10 μL volumes SSR-PCR system consists of template DNA was 30.0 ng, Taq DNA
polymerase was 1.0 U, primer was 0.2 μmol/L, Mg2+ was 2.0 mmol/L, and dNTPs was 0.4 mmol/L. PCR reaction amplification procedures was:
pre-denaturation for 4 min at 94℃, followed by 30 cycles of denaturation for 45 s at 94℃, anneal for 30 s at 48℃, extension for 30 s at 72℃, the
amplification was completed after extension for 10 min at 72℃, then stored at 4℃. Finally, 24 DNA was used to verify the stability of the system,
which can be as reference for study Pinus yunnanensis SSR markers.
Key words: Pinus yunnanensis SSR Optimization Orthogonal design
云南松（Pinus yunnanensis Fr.）是分布于我国
西南季风影响下、亚热带山地暖性气候条件下的重
要树种，是云南省瘠薄荒山造林的先锋树种和治理
水土流失的重要树种，具有适应性强、耐干旱瘠薄、
木材用途广泛等特点［1］，在云南林业生产中占有
重要的地位，对生态经济建设也具有举足轻重的作
用［2］。云南松分布范围广，位于东经 96 -108 、北
纬 23 -30 之间，水平东西距离达 1 000 km 以上、
南北距离达 900 km 之巨［2］。云南松是由一个庞大
的种群体系组成的［3］，庞大的种群系统的生态地理
变异式样反映了它正处于激烈的生态分化之中，是
研究多样性的良好树种材料［4-10］。目前对云南松研
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期94
究主要集中在生物学特性、资源与分布、遗传改良、
造林技术、病虫害防治、加工利用等方面［11-13］，多
样性方面的研究较少，仅有少数从表型、核型和等
位酶方面的报道［4-9］。而利用分子标记进行多样性
的研究因不受环境条件的影响，且不同生育阶段、
不同组织均可进行检测而得到广泛应用［14］。分子标
记是建立在 DNA 多态性基础上的遗传标记，在众
多分子标记中，SSR 标记具有共显性、种属特异性，
且重复性和稳定性好，位点多、多态性丰富、试验
操作简单、结果稳定可靠等特点，被认为是目前研
究遗传最好的标记之一［15, 16］。然而，在利用分子标
记进行遗传多态性分析时，一个最佳效果的 PCR 反
应条件关系到样本 DNA 所能扩增条带的数量、清
晰度以及稳定性，从而影响多态性条带的统计与分
析［17］。因此，高效的 PCR 反应是进行 SSR 分析的
基础。而 PCR 易受其反应条件中诸多因素的影响，
为确保 SSR 准确性和重复性，建立和优化 SSR-PCR
反应体系十分必要［18］。
鉴于此，本研究参考标准 PCR 反应条件以及近
缘种松树的结果，利用正交设计 L16（45）对云南松
SSR-PCR 反应体系的 5 个因素（Taq聚合酶、Mg2+、
dNTP、引物、DNA 模板）在 4 个水平上进行比较。
研究分析了 SSR-PCR 反应中各项参数变化对试验结
果的影响，并对结果进行统计分析，对反应体系进
行验证，最终建立了较为可靠的反应体系。旨在为
今后云南松群体遗传多样性的研究，图谱构建、遗
传结构分析以及重要性状的 QTL 定位等方面更为广
泛的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 选用云南松母树林白马河林场的种子，
在西南林业大学智能温室播种育苗。试验选取 2 年
生实生苗正在生长的嫩叶，于 2011 年 4 月底采材料，
用液氮研磨后，置 -79℃冰箱保存备用。
1.1.2 试 剂 用 于 SSR-PCR 反 应 的 Taq聚 合 酶
（83.35 mkat/L）、Mg2+（25.0 mol/L）、dNTP（各 2.5 mol/L）、
Marker（DL2000）、10×PCR Buffer 均购自 TaKaRa 公
司。引物参照文献［19］中的 SSR 序列，由上海生工
生物技术有限公司合成。经初步筛选，以通用性强、
条带清晰的 PtTX2123 作为本次正交试验的引物，其
序列为：F：5-GAAGAACCCACAAACACAAG-3，R：
5-GGGCAAGAATTCAATGATAA-3，其他试剂为国
产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 云南松总 DNA 采用北京 Tiangen
公司植物基因组 DNA 提取试剂盒提取，置于 -20℃
下保存备用。
1.2.2 PCR 反应因素水平的确定与正交表的设
计 针对影响 PCR 反应中的 5 个因素，即 Taq聚合
酶、Mg2+、dNTP、引物、DNA 模板，每个因素设 4
个水平，见表 1，采用正交设计 L16（45）进行试验［20］。
设计方案见表 2，设 3 次重复，共 48 个 PCR 管，按
表中的数据加样 ；另，每管还加入 1 μL 的 10×PCR
Buffer（终浓度为1×PCR Buffer），其余用ddH2O补足，
反应体系总体积为 10 μL。
表 1 PCR反应的因素和水平
因素
水平（体系终浓度）
1 2 3 4
Taq聚合酶（U/10 μL） 0. 50 0.75 1.00 1.25
Mg2+（mmol/L） 1.50 2.00 2.50 3.00
dNTP（mmol/L） 0.10 0.20 0.30 0.40
引物（μmol/L） 0.20 0.30 0.40 0.50
DNA 模板（ng/10 μL） 10.0 20.0 30.0 40.0
表 2 PCR反应的因素水平正交试验设计 L16（45）
处理 Taq聚合酶（U/10 μL）
Mg2+
（mmol/L）
dNTP
（mmol/L）
引物
（μmol/L）
DNA 模板
（ng/10 μL）
1 0.50 1.50 0.10 0.20 10.00
2 0.50 2.00 0.20 0.30 20.00
3 0.50 2.50 0.30 0.40 30.00
4 0.50 3.00 0.40 0.50 40.00
5 0.75 2.00 0.10 0.40 40.00
6 0.75 1.50 0.20 0.50 30.00
7 0.75 3.00 0.30 0.20 20.00
8 0.75 2.50 0.40 0.30 10.00
9 1.00 2.50 0.10 0.50 20.00
10 1.00 3.00 0.20 0.40 10.00
11 1.00 1.50 0.30 0.30 40.00
12 1.00 2.00 0.40 0.20 30.00
13 1.25 3.00 0.10 0.30 30.00
14 1.25 2.50 0.20 0.20 40.00
15 1.25 2.00 0.30 0.50 10.00
16 1.25 1.50 0.40 0.40 20.00
2012年第4期 95张瑞丽等 ：云南松 SSR-PCR 反应体系的建立与优化
1.2.3 PCR 反应及其产物的检测 PCR 扩增反应
在德国 Biometra 公司生产的 Gene Amp PCR System
D37079 型 PCR 扩增仪上进行，反应程序为 ：94℃
预变性 4 min ；94℃变性 45 s，48℃退火 30 s，72℃
延伸 30 s，30 个循环 ；72℃延长 10 min，4℃保存。
PCR 产物加 2 μL 6×loading buffer，混匀后取 10 μL，
以 TaKaRa 公司的 DL2000 Marker 为对照，用 1.5%
琼脂糖凝胶（含 EB 0.05 μg/mL），在北京六一仪器
厂电泳仪上于 120 V 恒压下电泳 40 min。电泳结束
后在 GeneGenins 公司的 Bio Imaging System 上观测
并拍照和分析。结果统计参照何正文等［21］的方法，
依扩增条带的敏感性和特异性（即条带强弱及杂带
的多少）计分，分数越高，表示敏感性、特异性越好。
1.2.4 最佳反应体系的验证 随机选择 1 对引物，
对云南松 1 个居群 24 个植株的 DNA 进行扩增，以
验证优化确定的云南松 SSR-PCR 反应的稳定性。
2 结果
2.1 DNA质量检测结果
提取的总 DNA 用核酸检测仪检测 DNA 溶液纯
度和浓度。经琼脂糖（0.8%）检测 DNA 条带清晰且
无降解，说明提取的 DNA 质量高，完整性好，可用
于 SSR 分析（图 1）。
2.2 PCR产物电泳图结果评分
按表 2 正交设计的 16 个处理组合进行 PCR 反
应，电泳、成像后，得到 PCR 产物的电泳图。结果（图
2）可见，5 种反应因素浓度组合不同，其扩增的效
果也不一。其中，1、8、15 号处理组合扩增效果较差，
条带模糊，不易观察 ；11、12、16 号处理组合扩增
的条带非常亮，目的条带清晰 ；第 11 处理组合扩增
出了分子量小于 100 bp 的引物二聚体。
图 1 DNA电泳检测结果
1-16 为处理组合代号，参见表 2 ；M.DL2000 DNA Marker
图 2 PCR产物电泳图
根据电泳图，结合遗传多样性分析的要求，将
图 2 中条带的强弱及杂带的多少对 16 个处理组合进
行打分，即条带数量丰富、清晰度高、背景低的产
物记为 16 分，而最差的记为 1 分。图中 1-16 处理
组合计分分别为：2、4、11、10、8、7、6、3、13、5、
15、16、11、12、1、14，并对不同因素与水平的
电泳评分平均值和极差进行计算分析，结果如表 3
所示。
极差 R 大小表明各因素影响程度的高低，R 越
大，说明该因素对结果影响越大。因此，该体系中
对结果影响的大小顺序是 DNA 模板、Taq聚合酶、
dNTP、Mg2+、引物。其中，每一因素各水平均值大小k，
反映了各因素不同水平对反应体系的影响情况，均
值越大说明反应水平越好。
2.3 最佳反应体系稳定性检测
应用上述正交试验所获得的最佳反应体系，用
1 对引物对云南松 1 个居群 24 个植株的 DNA 进行
扩增，结果（图 3）显示，每份 DNA 样品均能扩增
出清晰的目的条带。说明该体系比较稳定，适用于
后期云南松遗传多样性研究的 SSR 反应。
3 讨论
PCR 易受其反应条件中诸多因素的影响，各
个因素对 PCR 反应是否成功、所得的结果是否正
确，以及 PCR 的扩增效率都有重要的影响。Taq酶
的浓度过高不仅增加试验成本，而且极易产生非特
异性扩增产物 ；浓度过低则会导致产物的合成效率
下降［22］。同时，Taq DNA 聚合酶是 Mg2+ 依赖性酶，
对 Mg2+ 浓度非常敏感。此外，dNTP 分子中的磷酸
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期96
表 3 正交设计直观分析
结果
影响因素
Taq聚合酶（U/10 μL） Mg2+（mmol/L） dNTP（mmol/L） 引物（μmol/L） DNA 模板（ng/10 μL）
K1 27.00 38.00 32.00 36.00 11.00
K2 24.00 29.00 28.00 31.00 37.00
K3 49.00 39.00 33.00 38.00 43.00
K4 36.00 30.00 43.00 31.00 45.00
k1 6.75 9.50 8.00 9.00 2.75
k2 6.00 7.25 7.00 7.75 9.25
k3 12.25 9.75 8.25 9.50 10.75
k4 9.00 7.50 10.75 7.75 11.25
R 6.25 2.50 3.75 1.75 8.50
基团能定量地与 Mg2+ 结合，使游离的 Mg2+ 浓度降
低［23, 24］。引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物
扩增，形成引物二聚体。
PCR 反应体系的摸索是进行 PCR 反应的关键所
在，高效的 PCR 反应是如何提高特异性产物、减少
非特异性产物，即如何减少非特异反应的消耗，从
而满足特异性产物反应的需求。若反应条件摸索不
好，则影响到后续试验。PCR 是一个多因素影响的
综合反应体系，以前对 PCR 各因素最适条件的确定
以单因素为主。单因素试验筛选反应体系，需要进
行多次的梯度试验，不仅试验过程复杂，且没有考
虑各因素间的相互作用，加之以各因素的最好水平
组合后不一定是最佳扩增效果的反应体系 ；完全试
验能考虑到交互，且最终筛选出来的体系也比较稳
定，但工作量较大［25］。而采用正交设计筛选，因
其具有正交的均衡分散、综合可比及可伸缩、效应
明确等特性，在减少试验规模的同时又不损失信
息，能快速找到最优组合，同时可分析不同因素对
试验结果的影响程度［26, 27］。本研究采用正交试验设
计，通过直观评分和统计分析相结合的方法，一方
面分析各因素对反应结果的影响程度，另一方面探
讨各因素内各水平对反应结果的内在规律。经过检
测，验证了该体系较稳定，说明通过正交设计优化
反应体系是一种有效、适用、简便的方法。此外，
该体系选用 10 μL 小体系进行，优化后各反应组分
浓度较低，远远低于标准体系浓度［17, 28］，在保证试
验结果的同时，大大降低了成本，是一个稳定、高
效、经济的反应体系。但该方法在评价时存在一定
主观性，如何更好地评价产物的电泳图值得进一步
研究。
4 结论
PCR 反应体系的建立，涉及反应体系中的 Taq
酶、Mg2+、引物、dNTP、DNA 模板等的用量和配比。
本研究采用正交试验表 L16（45）安排试验，对影响
PCR 反应的 5 个主要因素进行优化，建立了重复性
好、稳定性高的云南松 SSR-PCR 反应体系，即在 10
μL 体系中，模板 DNA 30.0 ng，Mg2+ 2.0 mmol/L，Taq
酶 1.0 U，dNTP 0.4 mmol/L，引物浓度为 0.2 μmol/L，
适宜扩增程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性 45 s，
48℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30 个循环 ；72℃延
长 10 min，4℃保存。
参 考 文 献
［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会 . 中国植物志（第 7 卷） ［M］.
北京 : 科学出版社 , 1978: 255-259.
［2］ 金振洲 , 彭鉴 . 云南松 ［M］. 昆明 : 云南科技出版社 , 2004: 6-32.
［3］ 黄瑞复.云南松的种群遗传与进化.云南大学学报:自然科学版,
图 3 最佳反应体系对 1个云南松居群的扩增
产物电泳图
2012年第4期 97张瑞丽等 ：云南松 SSR-PCR 反应体系的建立与优化
1993, 15（1）: 50-63.
［4］ 王昌命 , 王锦 , 姜汉侨 . 不同生境下云南松及其近缘种林木茎
干的形态结构特征 . 西部林业科学 , 2009, 38（1）: 23-27.
［5］ 王昌命 , 王锦 , 姜汉侨 . 不同生境中云南松及其近缘种芽的比
较形态解剖学研究 . 广西植物 , 2009, 29（4）: 433-437.
［6］ 虞泓 , 郑树松 , 黄瑞复 . 云南松居群内雄球花多态性 . 生物多样
性 , 1998, 6（4）: 267-271.
［7］ 虞泓 , 杨彩云 , 徐正尧 . 云南松居群花粉形态多态性 . 云南大学
学报 : 自然科学版 , 1999, 21（2）: 86-89.
［8］ 虞泓 , 黄瑞复 . 云南松居群核型变异及其分化研究 . 植物分类
学报 , 1998, 36（3）: 222-231.
［9］ 虞泓 , 钱韦 , 黄瑞复 . 云南松居群遗传学研究的等位酶分析方
法 . 云南植物研究 , 1999, 21（1）: 68-80.
［10］ 虞泓 , 葛颂 , 黄瑞复 , 等 . 云南松及其近缘种的遗传变异与亲
缘关系 . 植物学报 , 2000, 42（1）:107-110.
［11］ 戴开结 ,何方 ,沈有信 ,等 .云南松研究综述.中南林学院学报,
2006, 26（2）: 138-142.
［12］ 李莲芳 , 郑畹 , 韩明跃 , 等 . 云南松遗传改良进展及其育种策
略剖析 . 西部林业科学 , 2010, 39（2）: 104-110.
［13］ 黄永祥 , 蔡年辉 , 李根前 . 云南松遗传改良研究进展及育种策
略 . 陕西林业科技 , 2008（1）: 11-14.
［14］ 白建荣 , 郭秀荣 , 侯变英 . 分子标记的类型、特点及在育种中
的应用 . 山西农业科学 , 1999, 27（4）: 33-38.
［15］ 刘学军 , 童继平 , 李素敏 , 等 . DNA 标记的种类、特点及其研
究进展 . 生物技术通报 , 2010（7）: 35-40.
［16］ 黄龙花 , 吴清平 , 杨小兵 , 等 . 基于特定引物 PCR 的 DNA 分
子标记技术研究进展 . 生物技术通报 , 2011（2）: 61-65.
［17］ 迪芬巴赫 CW, 德维克斯勒 GS, 著 , 黄培堂 , 俞炜源 , 陈添弥 ,
译 .PCR 技术实验指南［M］. 北京 : 科学出版社 ,2002:140-141.
［18］ 王士磊 , 李玉鹏 , 高树仁 . 正交设计优化玉米 SSR-PCR 反应
体系的研究 . 基因组学与应用生物学 , 2009, 28（1）:119-122.
［19］ Elsik CG, Minihan VT, Hall SE, et al. Low-copy microsatellite
markers for Pinustaeda L.. Genome, 2000, 43（3）: 550-555.
［20］ 袁志发 , 周静芋 . 试验设计与分析 ［M］. 北京 : 高等教育出版
社 , 2000: 467.
［21］ 何正文 , 刘运生 , 陈立华 , 等 . 正交设计直观分析法优化 PCR
条件 . 湖南医科大学学报 , 1998, 23（4）: 403-404.
［22］ 刘天亮 , 潘东明 , 许长同 , 等 . 橄榄 ISSR-PCR 反应体系的优
化 . 生物技术通报 , 2010（7）: 137-141.
［23］ 沈鹏 , 董丽 . 大苞萱草 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化 . 生
物技术通报 , 2010（8）: 129-133.
［24］ 谢文刚 , 张新全 , 彭燕 , 等 . 鸭茅 SSR-PCR 反应体系优化及引
物筛选 . 分子植物育种 , 2008, 6（2）: 381-386.
［25］ 王士磊 , 李玉鹏 , 高树仁 . 正交设计优化玉米 SSR-PCR 反应
体系的研究 . 基因组学与应用生物学 , 2009, 28（1）: 119-122.
［26］ 杨传平 , 王艳敏 , 魏志刚 . 利用正交设计优化白桦的 SSR-PCR
反应体系 . 东北林业大学学报 , 2006, 34（6）: 1-3.
［27］ 续九如 , 黄智慧 . 林业试验设计［M］. 北京 : 中国林业出版社 ,
1998: 65-79.
［28］ 卢圣栋 . 现代分子生物学实验技术［M］. 北京 : 中国协和医
科大学出版社 , 1999: 459.
（责任编辑 马鑫）