全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-03-31
基金项目 : 国家重点基础研究发展计划（973 计划）项目（2010CB833800）, 国家自然科学青年基金项目（40906076,40906075）, 中国科学
院知识创新工程重要方向项目（KSCX2-EW-G-12）, 财政部战略生物资源科技支撑运行专项项目（KSCX2-YW-Z-1018）
作者简介 : 黄智 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 海洋生物技术 ; E-mail: hzzsu@163.com
通讯作者 : 张偲 , 男 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 海洋生物学 ; E-mail: zhsimd@scsio.ac.cn
深海作为海洋环境中的极端区域，通常指
1 000 m 以下的海洋，占到海洋总体积的 75%，而
其中深海沉积物覆盖了地球表层的 50% 以上。海洋
沉积环境是集化学物质和微生物于一体的特殊生态
环境，孕育了特殊的微生物多样性，而特殊的微生
物多样性往往表现出丰富的化学结构和生物活性多
样性［1-4］。
海洋真菌作为海洋微生物中的一大类，其代谢
产物化学及生物活性的研究起步较晚，远落后于海
一株南海北部深海沉积环境真菌 00457的鉴定及
其活性研究
黄智1，2 王发左1 田新朋1 李洁1 张 1
（1 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州 510301 ；
2 中国科学院研究生院，北京 100049）
摘 要： 从南海深海沉积环境样品中分离到一株编号为 00457的真菌，基于形态学特征、ITS和 5.8S rDNA序列比对分析，
鉴定该菌株为白黄笋顶孢霉（Acrostalagmus luteoalbus）。活性研究表明，其代谢产物粗浸膏的卤虫致死活性明显，并具有一定强度
的抑菌和 DPPH自由基清除活性。此外，研究还发现代谢产物粗浸膏在 25-100℃持续加热不超过 30 min时，卤虫致死活性成分稳
定，但在 100℃持续加热超过 60 min后卤虫致死活性成分显著减少，而一定强度的紫外光照射 90 min内则无显著影响。
关键词： 真菌 深海沉积环境 鉴定 抗菌活性 抗氧化活性 卤虫致死活性
Identification and Activities of Fungal Strain 00457 Isolated from the
Deep-sea Sediment of Northern South China Sea
Huang Zhi1，2 Wang Fazuo1 Tian Xinpeng1 Li Jie1 Zhang Si1
（1Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization，South China Sea Institute of Oceanology，CAS，Guangzhou 510301；
2Graduate University of CAS，Beijing 100049）
Abstract: Based on the morphological characteristics and ITS-5.8S rDNA gene sequences analysis, a strain named 00457 isolated from
deep-sea sediment of northern South China Sea, was identified as a member of Acrostalagmus luteoalbus. Activity test for the crude extract of
fungal strain 00457 showed that it had obvious brine shrimp lethality, as well as potential antibacterial activity and DPPH radical scavenging
activity. Moreover, the brine shrimp lethal activity was stable under the conditions of heating at 25-100℃ for 30 min, while decreased after
heating at 100℃ for more than 60 min. UV radiation for 90 min did not affect the brine shrimp lethality of crude extract.
Key words: Fungi Deep-sea sediment Identification Antibacterial activity Antioxidant activity Brine shrimp lethality
洋细菌和放线菌。直到 20 世纪 90 年代初期，海洋
真菌代谢产物研究才逐渐进入快速发展阶段［5-7］。
据统计，2006 年 -2010 年间，来自海洋真菌新化
合物的数量达 690 个，其中海洋沉积环境来源的只
占 16%［8］，并且多数来源于近海，深海沉积环境来
源的研究相对较少，但从已分离出来的代谢产物来
看，其结构出新率高，抗菌、抗肿瘤等生物活性显
著，表明深海沉积环境中蕴藏着许多具有潜在应用
价值的活性物质，是开发新抗菌、抗肿瘤类药物的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期200
新兴资源［5，8-10］。本研究以筛选和发现深海沉积环
境来源活性真菌为目标，经过大量研究，从南海北
部 2 801 m 深的沉积样品发现了一株具有显著抗菌、
抗氧化和卤虫致死活性的真菌菌株 00457，同时基
于形态特征和 ITS-5.8S rDNA 基因序列分析，对其种
类进行了鉴定和命名。此外，初步研究了在不同处
理条件下菌株代谢产物浸膏稳定性对卤虫致死活性
影响，旨在为进一步研究结构新颖的代谢产物化学
和活性奠定资源基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 沉积物样品于 2010 年 4 月采自
于中国南海北部海域（经度 ：118°57.297，纬度 ：
21 28.567），深度为 2 801 m。
1.1.2 试剂和仪器 Hpure 真菌 DNA 提取试剂盒购
自 GBCBIO 公 司，KH2PO4，MgSO4·7H2O，CaCO3，
乙酸乙酯，甲醇，二甲基亚砜（DMSO），乳酸，苯酚，
甘油，摇床，双筒解剖镜，Eppendorf 公司 PCR 仪，
离心机，分光光度计，尼康显微镜，超低温冷冻冰箱，
高速分散机，味精（99% 以上谷氨酸钠），棉蓝。
1.1.3 活性检测指示菌株和卤虫来源 抗菌活性
检测指示菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）、枯
草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌
（Staphyloccocus aureus）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus
thuringiensis），来源于中国科学院海洋微生物研究中
心 ；卤虫卵（Brine shrimp eggs）购自美国海星国际
有限公司。
1.1.4 培养基 PDA 分离培养基 ：土豆 200 g、葡萄
糖 20 g、琼脂糖 18 g、陈海水 1 L，pH 值调至 7.3。
液体发酵培养基 ：麦芽糖 20 g、味精 10 g、KH2PO4
0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、 葡 萄 糖 10 g、 酵 母 膏
3 g、玉米粉 1 g、甘露醇 20 g、CaCO3 2 g、陈海水 1 L、
pH 值调至 6.5。LB 培养基 ：胰蛋白胨 10 g、酵母提
取物 5 g、NaCl 10 g、蒸馏水 1 L，pH 值调至 7.0。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离纯化和形态观察 称取 5 g 沉积物
样品，用无菌海水稀释 10 倍后取 200 μL 均匀涂布
于 PDA 分离培养基上，观察平板上菌落的生长状
况，挑取单菌落转接于另一 PDA 平板培养基上进行
纯化。经多次转接纯化后的菌株以 PDA 斜面（温度：
4℃）、甘油管（温度 ：-80℃，甘油浓度 ：30%）两
种方式保藏于中国科学院海洋微生物研究中心。
采用平板观察法，观察菌株在 1.8% 的琼脂
PDA 固体培养基平板上的单菌落生长形态，培养基
的 pH 为 7.3，室温培养。挑取少量菌丝体制作玻片，
经乳酸石炭酸棉蓝染色 30 min 后在光学显微镜下观
察。乳酸石炭酸棉蓝染色剂组分为石炭酸 2.0 g、甘
油 40 mL、乳酸（密度 1.21）20 mL、蒸馏水 20 mL、
棉蓝 0.05 g。
1.2.2 DNA 提取、扩增和系统进化树构建 纯化的
菌株经活化后，接种于装有 50 mL 液体发酵培养基
的 250 mL 三角瓶中，摇床培养 3-4 d 后离心收集菌
体，DNA 的提取方法参照 GBCBIO 公司 Hpure 真菌
DNA 提取试剂盒的标准操作步骤。PCR 扩增采用真
菌通用引物：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）
和 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）［11，12］。
PCR 反应体系（25 μL）：10.5 μL 无菌水、20 μmol/L
的引物各 0.5 μL，TaKaRa 公司的 Premix Taq（loading
dye mix）12.5 μL、DNA 模板 1 μL。扩增程序为 ：
94℃预变性 3 min ；94℃变性 50 s，52℃退火 1 min，
72℃延伸 50 s，共 35 个循环 ；72℃终延伸 10 min。
扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，产物委托深
圳华大基因科技有限公司测序。
序列通过 NCBI 网站在线 BLAST 比对分析，
调取相关序列，经 CLUSTAL X（1.8）比对分析
后，用 MEGA5 软件以最小进化法构建系统进化树，
Bootstrap 设置为 1 000 次重复。
1.2.3 菌株粗浸膏制备 将活化后的供试菌株，接
种于已灭菌、包含 75 mL 液体发酵培养基的 250 mL
三角瓶中，28℃、180 r/min 摇床培养 9 d。发酵液经
高速分散机破碎菌丝体后，用两倍体积的乙酸乙酯
萃取，35℃减压浓缩，得到的粗浸膏，干燥至恒重
后分别用甲醇和 DMSO 定容［13］。
1.2.4 抗菌试验 采用纸片扩散法［14］，指示菌株
有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和苏
云金芽孢杆菌，具体步骤为 ：细菌接种于已灭菌的
LB 液体培养基中 37℃培养 24 h，菌悬液按 1 50 体
积比例混入无菌 LB 培养基中，混匀后倒平板备用。
取待测样品 5 μL 滴于 6 mm 直径的双层滤纸片上，
2012年第10期 201黄智等 ：一株南海北部深海沉积环境真菌 00457 的鉴定及其活性研究
37℃培养 24 h 后观察抑菌圈大小。粗浸膏甲醇溶液
的初始浓度为 20 mg/mL，终浓度为 100 μg/片。空白
对照组加 5 μL 甲醇，阳性对照为氨苄西林和利福平，
初始浓度都为 200 μg/mL。
1.2.5 抗氧化试验 采用 1，1-二苯基 -2-三硝基苯
肼（DPPH）自由基清除能力来评价代谢产物浸膏的
抗氧化活性。按 10 倍稀释法将样品的甲醇溶液稀释
成 4 个梯度，取各梯度溶液 2 mL 加入到 2 mL 0.16
mmol/L 的 DPPH 甲醇溶液中，充分混匀后置于室温
避光 30 min 后采用分光光度计在 517 nm 下测定其
吸光度，每一吸光度平行测定 3 次，用清除率来表
示抗氧化活性的效果［15，16］，公式如下。阳性对照为
抗败血酸。
清除率 =［1-（处理样品 -空白样品）/ 对照］×
100%
处理样品 ：2 mL 样品甲醇溶液 +2 mL DPPH 甲
醇溶液；空白样品：2 mL 样品甲醇溶液 +2 mL 甲醇；
对照 ：2 mL 甲醇 +2 mL DPPH 甲醇溶液。
1.2.6 卤虫致死试验 100 mg 虫卵加入灭菌的 400
mL 海水中，室温下由气泵缓缓充气，24 h 后去除虫
卵外壳，再孵化 24 h 备用。每个 96 孔细胞培养板
的小孔中加入 195 μL 卤虫孵化液，内含卤虫数量约
15 个。粗浸膏 DMSO 溶液的初浓度为 10 mg/mL，分
别按 5 倍稀释成 4 个不同的浓度，每个稀释浓度分
别做 3 个平行，空白对照只加入 DMSO。室温下培
养 24 h 后用双筒解剖镜观察，计每孔虫体死亡数和
总数，卤虫致死活性用校正死亡率表示［13，17］，公式
如下。
校正死亡率 =（对照组存活率 -处理组存活
率）/ 处理组存活率 ×100%
1.2.7 菌株代谢产物卤虫致死活性成分稳定性分析
1.2.7.1 不同温度下粗浸膏稳定性对卤虫致死活性
的研究 浓度为 10 mg/mL 的粗浸膏溶液分别置于
25、40、60、80 和 100℃的条件下 30 min，然后进
行杀卤虫试验计算其校正死亡率。
1.2.7.2 不同加热时间下粗浸膏稳定性对致死卤虫
活性的研究 初浓度为 10 mg/mL 的粗浸膏溶液分别
置于 100℃的条件下 5、30、60 和 90 min，然后进
行杀卤虫试验计算其校正死亡率。
1.2.7.3 不同紫外光照射时间粗浸膏稳定性对卤虫
致死活性的稳定性研究 初浓度为 10 mg/mL 的粗浸
膏溶液分别置于紫外灯照射下 0、30、60 和 90 min，
然后进行杀卤虫试验计算其校正死亡率。紫外灯为
ZF-I 型紫外分析仪，功率为 12 W。
2 结果
2.1 菌株00457的鉴定
2.1.1 形态特征 图 1-A 和图 1-B 分别所示菌株
00457 在 1.8% 的琼脂 PDA 固体培养基平板上室温
培养 7 和 11 d 生长的形态，培养基的 pH 为 7.3，菌
落表面先是白色绒毛状，中间区域呈现围绕菌落中
心辐射状生长的条纹。随培养时间增加，菌落颜色
由内向外逐渐加深变为环状砖红色。培养 7 d 时菌
落大小为 36-39 mm，菌落边缘菌丝体紧贴着培养基
生长。气生菌丝体（图 1-C）主梗直立，有明显分
隔，轮生侧枝，每层轮生的侧枝有 2-4 枝，侧枝可
再分枝1-2次。分枝的分生孢子梗呈瓶状，基部膨大，
向上逐渐变细，顶端粘结球形头状的单生分生孢子，
除分生孢子外无其他孢子形态。脱落后的分生孢子
呈卵圆形至椭圆形，无厚垣孢子（图 1-D）。
A, B 分别为菌株在 PDA 培养基上室温培养 7 和 11 d 的菌落形态 ；
C, D 分别菌丝体（棉蓝染色）和孢子显微图片
图 1 菌株 00457的菌落、菌丝体及
孢子形态照片（400×）
2.1.2 分子鉴定 采用真菌的通用引物 ITS1 和 ITS4
扩增菌株的 ITSⅠ-5.8S rDNA-ITS Ⅱ区的片段，扩增
产物大小为 515 bp。序列提交 GenBank 数据库，登
录号为 JN851702。经 BLAST 在线比对结果显示，菌
株 00457 与 Acrostalagmus luteoalbus、Verticillium lut-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期202
eoalbum和 Nectria inventa序列相似性都为 99%，经
MEGA5 软件用最小进化法构建系统进化树（图 2）
分析显示，菌株00457与这3个属都处在同一分支上。
依据形态学特征，菌株 00457 在 PDA 培养基
图 2 基于菌株 00457的 ITS I-5.8S rDNA-ITS II区域序列信息构建的系统进化树
Bootstrap 值设置为 1 000 次重复
上生长成独特的砖红色菌落，菌丝体的主梗轮生侧
枝，分枝孢子梗顶端粘结球形头状的单生孢子，脱
落的孢子呈卵圆形至椭圆形，除分生孢子外没有其
他的孢子体形态，结合分子鉴定结果，并与文献
比较，鉴定菌株 00457 属于真菌 Hypocreaceae 科、
Acrostalagmus属、Acrostalagmus luteoalbus种，中文
译名为白黄笋顶孢霉。
2.2 菌株00457抗菌活性
菌株 00457 的代谢产物粗浸膏组分对大肠杆菌、
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌
都表现出明显的抑制作用（表 1），其中对枯草芽孢
杆菌的抑制效果最好，其次是大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌。阳性对照氨苄西林和利福平对 4 种指示菌
都有不同程度的抑制效果。
样品 抑菌圈（mm）大肠杆菌（E. coli） 枯草芽孢杆菌（B. subtilis） 金黄色葡萄球菌（S. aureus） 苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）
00457 8.5 9.0 8.3 7.3
空白对照 - - - -
氨苄西林 8.7 8.0 13.3 9.8
利福平 13.5 14.3 25.8 9.5
表 1 菌株 00457代谢产物浸膏的抗菌活性
滤纸片的直径为 6.0 mm，抑菌圈越大表示抗菌效果越好，“-”为无活性
2.3 菌株00457的抗氧化活性
DPPH 作为一种稳定的有机自由基，能与自由
基清除剂配对结合产生褪色反应，定量地反映出其
样品抗氧化活性的强弱。不同浓度的菌株 00457 粗
浸膏，表现出一定强度的自由基清除活性，并且随
着样品浓度的增加自由基清除活性相应增加，浓度
梯度依赖性明显，在浓度为 1 000 μg/mL 时的清除率
超过 50%（表 2）。
2.4 菌株00457的卤虫致死活性
4 个不同浓度的菌株 00457 粗浸膏 DMSO 溶液
对卤虫的校正死亡率，如图 3 所示，高于 50 μg/mL
的浓度时对卤虫的致死率都达到 100%，稀释倍数增
大时校正死亡率逐渐降低，低于 2 μg/mL 浓度时对
卤虫没有影响。整个梯度试验说明菌株 00457 的次
级代谢产物对卤虫致死活性有一定的量效关系，而
样品 自由基清除率（%）1 μg/mL 10 μg/mL 100 μg/mL 1000 μg/mL
00457 4.22 8.28 15.04 55.82
抗败血酸 78.26 94.37 95.37 -
表 2 菌株 00457代谢产物浸膏的自由基清除活性
2012年第10期 203黄智等 ：一株南海北部深海沉积环境真菌 00457 的鉴定及其活性研究
且在粗浸膏浓度为 10 μg/mL 时对卤虫致死率还能达
到 18% 的效果。
虫致死活性成分是稳定的。
图 3 菌株 00457不同浓度粗浸膏的卤虫致死活性
2.5 菌株00457代谢产物浸膏的卤虫致死活性成分
稳定性
2.5.1 不同温度加热处理对浸膏卤虫致死活性成分
稳定性的影响 在 5 个不同的温度条件处理下，菌
株 00457 粗浸膏对卤虫致死活性影响不显著，说明
温度在 25-100℃间、加热不超过 30 min 时，粗浸膏
中卤虫致死活性成分是稳定的（图 4）。
图 4 菌株 00457粗浸膏经不同温度处理后的卤虫致死活性
2.5.2 加热时长对浸膏卤虫致死活性成分稳定性的
影响 由图 5 所示，在 100℃、加热时间不超过 60
min 时，菌株 00457 代谢产物对卤虫致死率保持在
100%，60 min 后活性下降显著，说明 0-60 min 中卤
虫致死活性成分是稳定的，但长时间高温加热会导
致活性成分产生变化，活性降低。
2.5.3 紫外光照射时长对浸膏卤虫致死活性成分稳
定性的影响 紫外线是导致许多活性化合物光解作
用的重要原因之一。本试验设计不同时间的紫外光
照处理粗浸膏样品，探讨其对卤虫致死活性成分的
稳定性。结果（图 6）表明，0-90 min 时间内，随
着紫外光照射时间增加，卤虫致死活性无明显影响，
提示在一定紫外照射强度和时间内，真菌 00457 卤
图 5 菌株 00457粗浸膏在 100℃加热不同时长后的
卤虫致死活性
图 6 菌株 00457粗浸膏紫外光照射不同时长后的
卤虫致死活性
3 讨论
海洋真菌化学和活性研究是目前海洋天然产物
研究热点之一，而其中海洋药源真菌的筛选和发现
尤为重要。本研究以此为目的，从南海北部沉积环
境样品中发现真菌 Acrostalagmus luteoalbus 00457。
该种真菌生长成转红色菌落，除分生孢子外没有其
他的孢子体形态，是轮枝状真菌中是独特的特征［18］，
而且具有多个同种异名 ：Verticillium luteoalbum和
Nectria inventa［18-22］，MycoBank 和 Cybertruffle 数据库
也证实这 3 种名称属同种异名。
真菌 Acrostalagmus luteoalbus在陆上分布广泛，
可腐生于多种基质上，还可作为植物的内生菌或植
物的病原菌等［23］。已报道的活性研究表明，该种菌
具有广谱的抗菌效果，对多种植物病原真菌有明显
的抑制作用，原因主要是通过产生溶菌酶或次生代
谢产物间接作用于病原菌体，使其溃解从而获取营
养［21］，但目前没有抗氧化和卤虫致死活性的相关报
道。本研究首次从深海沉积环境中发现并报道此种
真菌，生长在特殊的深海生态环境下的微生物必然
有其特殊的代谢机制和独特的代谢产物。该菌发酵
产物粗浸膏对卤虫的致死活性明显，并具有一定强
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期204
度的抑菌和 DPPH 自由基清除活性，进一步的卤虫
致死活性成分稳定性研究表明，活性成分不耐受长
时间 100℃的高温加热，而一定强度的紫外照射对
其没有明显影响。以上研究不仅为海洋药源微生物
发现提供资源保障，同时也将为人们通过活性追踪
方法、有目的深入开展其代谢产物化学和活性研究
提供指导。
4 结论
本研究首次从深海沉积环境中发现真菌 Acrosta-
lagmus luteoalbus，该菌发酵产物的粗浸膏对卤虫致
死活性明显，并具有一定的抑菌和 DPPH 自由基清
除活性。进一步的活性稳定性研究表明，粗浸膏在
25-100℃持续加热不超过 30 min 时，卤虫致死活性
稳定，但长时间 100℃高温加热会导致活性显著降
低，而一定强度的紫外照射 90 min 内则无明显影响。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）