全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
收稿日期 : 2011-10-24
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31101899）, 大连市科技局科学计划项目（2010J21DW033）, 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实
验室基金（J2012001）
作者简介 : 李宏俊 , 男 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 海洋生物分子遗传学 ; E-mail: hjli@nmemc.gov.cn
海洋生物单核苷酸多态性基因分型技术的研究进展
李宏俊 高小玉 裴爱君
（国家海洋环境监测中心，大连 116023）
摘 要： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是一类广泛分布于基因组中由单个碱基差异引起的 DNA序
列变异，SNP标记是第三代分子标记的代表。随着大规模测序技术的快速发展，大量的候选 SNP位点被发现，候选 SNP位点的发
掘需要合适的分型技术。从等位基因分型机制、反应方式和检测等位基因方法等方面介绍当前海洋生物 SNP分型技术的研究进展，
以期为不同试验目的的研究选择合适的 SNP分型技术提供参考。
关键词： 单核苷酸多态性 SNP 基因分型 海洋生物 分子遗传学
Research Progress on Single Nucleotide Polymorphism （SNP）
Genotyping Technology for Marine Organism
Li Hongjun Gao Xiaoyu Pei Aijun
（National Marine Environmental Monitoring Center，Dalian 116023）
Abstract: Single nucleotide polymorphisms （SNPs） are the most abundant sequence variations caused by a single base difference
encountered in a genome. SNP markers represent the third generation of molecular markers. With the rapid development of large-scale
sequencing technology, large numbers of candidate SNPs were detected, making exploring appropriate genotyping method a high priority. In this
review, the research progress of SNP genotyping technology is discussed in terms of allelic discrimination, the reaction formats and the detection
modalities, in order to give reference for different experiments to select appropriate SNP genotyping methods.
Key words: Single nucleotide polymorphism SNP Genotyping Marine organism Molecular genetics
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphi-
sm，SNP）是指基因组水平上由单碱基突变所引起的
DNA 序列多态性。SNP 的数量庞大，是动植物基因
组中最常见的序列变异，人类基因组中每 1 000 bp
存在 1 个 SNP 位点［1］，如果在群体中稀有等位基因
频率大于 1% 即可认定为 SNP［2］。SNP 的突变形式
包括转换、颠倒、插入或缺失，转换是指嘌呤突变
成嘌呤或嘧啶突变成嘧啶（A/G，C/T），颠换是指嘌
呤和嘧啶之间的相互替换（A/C、G/C、A/T 和 G/T），
通常发生转换和颠换的频率比为 2 1［3］，插入和
缺失突变较少。SNP 位点通常表现为二等位基因多
态性，三等位或者四等位基因的 SNP 位点较稀少。
SNP 在基因组中分布广泛，既可以在编码区，又可
以在非编码区，人类基因组中编码区 SNP 的频率比
非编码区低 4 倍，而且一半是同义突变［4］，即 SNP
位于兼并密码子的第三位，不改变编码氨基酸序列。
由于数量多、分布广、二等位基因多态性和可能与
基因功能相关，SNP 标记已经成为第三代分子标记
的代表，被广泛应用于海洋生物群体遗传学、遗传
连锁图谱构建、基因定位、关联分析和分子育种等
研究中［5-10］。
随着新一代高通量测序技术的快速发展，大量
候选 SNP 位点通过 EST 和基因组序列比对被发现，
但其功能的验证需要合适的分型方法。目前，SNP
的分型方法很多，技术是否合适取决于试验的要求，
理想的分型方法应具备以下条件 ：（1） 针对目标位
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期52
点的检测方法快速简单 ；（2） 开发成本低，优化时
间短 ；（3） 反应体系稳定，对样品质量要求低 ；（4）
高通量，自动化 ；（5）数据分析简单准确。本研究
主要讨论 SNP 分型技术研究进展，包括基于测序
的 SNP 分型方法、基于构象的 SNP 分型方法、基于
杂交的 SNP 分型方法、基于 PCR 的 SNP 分型方法，
旨在寻找适合海洋生物遗传学研究的SNP分型方法。
1 基于测序的 SNP分型方法
1.1 直接测序法（direct sequencing）
直接测序法是 SNP 筛选最直接最可靠的方法，
分为克隆测序和 PCR 产物测序。克隆测序是将 DNA
片段插入质粒载体中，在宿主细胞中增殖，提取质
粒 DNA 后测序，这样就存在载体和宿主细胞基因
发生突变的弊端［11］。PCR 直接测序是对 PCR 产物
进行直接测序，不需要将 PCR 产物克隆到测序载体
上，可以避免细菌培养、模板提取等繁琐步骤，但
是 PCR 产物直接测序不能区分不同 SNP 的单倍型，
因为杂合体位点在PCR产物测序峰图中表现为套峰，
研究人员无法从中提取出准确的等位基因型。由于
技术简单、方法成熟，直接测序法在水产动物 SNP
筛选的初级阶段发挥重要作用。Xu 等［12］利用克隆
测序法分析了半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）主
要组织的组织相容性复合体（MHC） IIA 和 IIB 基因
的分子多态性，结果表明，MHC 拥有丰富的基因多
态性，在 4 个个体中分别编码 9 个 MHC IIA 和 15 个
MHC IIB 氨基酸，暗示半滑舌鳎基因组中至少存在
2 个 MHC IIA 和 3 个 MHC IIB 基因座位 ；Bao 等［13］
利用 PCR 产物直接测序法在海湾扇贝（Argopecten
irradians）3 个超氧化物歧化酶基因的启动子、外显
子和内含子中共发现 59 个 SNP 位点，并且验证了
这些位点与海湾扇贝抗病力的相关性。直接测序法
针对某个基因片段，每次试验分析的 SNP 位点有限，
而且目前直接测序依然成本较高，相比于构建遗传
连锁图谱等需要多个 SNP 位点分型试验，直接测序
法更适合水产动物基因多样性与性状关联分析试验。
1.2 焦磷酸测序（pyrosequencing）
焦磷酸测序技术是基于“合成法测序”的新
一代测序技术，它通过核苷酸与模板结合后释放的
焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检
测［14］。焦磷酸测序技术是一个理想的遗传分析技术
平台，既可进行 DNA 序列分析，又可进行高通量、
快速 SNP 检测。在焦磷酸反应体系中，反应底物为
5-磷酰硫酸（APS）和测序引物，在 4 种酶（DNA
聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双
磷酸酶）协同作用下，每一轮测序反应 4 种 dNTP
（dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP）之一被加入反应体
系，与模板配对，然后根据延伸信号强度确定碱基
延伸的数目。杨会勇等［15］建立了一种基于线性指
数 PCR 焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的
方法，并对 3 种常见弧菌（副溶血弧菌、哈维弧菌
和溶藻弧菌）进行了检测。与传统 Sanger 测序法相
比，焦磷酸测序可以直接测定引物后面的模板序列，
并且测定速度快，适于样本的快速检测。
1.3 微测序（minisequencing）
微测序法又称引物延伸法（primer extension，
PE），其基本原理是设计 1 条位于待检测 SNP 位点
上游的引物，该引物的 3-末端距离 SNP 位点 1 个
碱基，加入不同荧光标记的 ddNTPs 进行反应，只
有当 ddNTPs 与 SNP 位点互补时，延伸反应才发生，
然后通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断 SNP 等
位基因类型（图 1）［16］。目前，微测序技术发展迅速，
反应形式已经从液相发展到固相。
图 1 微测序法检测 SNP基因类型
2 基于构象的 SNP分型方法
2.1 单链构象多态性（single-strand conformational
polymorphism，SSCP）
SSCP 技术的基本原理是单链 DNA 在非变性环
境中具有特定的二级结构，而 DNA 序列甚至单碱
基变化都能导致这种空间构象的改变［18］。因此在非
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，构象不同导致电泳迁
移速率不同，从而将正常链和突变链区分开。PCR-
每个波峰代表 1 个 SNP 等位基因［17］
2012年第8期 53李宏俊等 ：海洋生物单核苷酸多态性基因分型技术的研究进展
SSCP 操作包括扩增目的片段、PCR 产物变性、非
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和显色等步骤，该技术的
优点是简便、快速、不需要特殊的仪器，缺点是不
能对 DNA 序列变异进行精确的定位，而且随着扩
增片段长度的增加，检测的灵敏度逐渐降低，一般
PCR-SSCP 试验设计引物的扩增片段长度都在 300
bp 以内。Wang 等［19］利用 PCR-SSCP 技术检测了养
殖栉孔扇贝（Chlamys farreri）肌肉生长抑制素基因
（MSTN）的分子多态性，方差分析结果表明 1 个
SNP 位点和栉孔扇贝生长形状显著相关 ；He 等［20］
利用 SSCP 技术在牙鲆（Paralichthys olivaceus）P450-
c19a 基因找到 3 个 SNP 位点。相比于直接测序法，
SSCP 技术大大降低了 SNP 的检测成本，但 SSCP 不
能精确定位 SNP，可以结合直接测序法验证 SNP 的
位置，然后利用 SSCP 大规模分析样本 SNP 基因型。
2.2 变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel el-
ectrophoresis，DGGE）和温度梯度凝胶电泳
( temperature gradient gel electrophoresis，
TGGE）
DGGE 技术是由 Fischer 和 Lerman［21］ 于 1979
年最先提出的监测 DNA 突变的一种电泳技术，其精
确度可以达到单核苷酸水平（图 2）。DGGE 技术检
测核苷酸序列是通过不同序列的 DNA 片段在各自相
应的变性剂浓度下变性，部分解链引起空间构型变
化，导致电泳速度的急剧变化，两条 DNA 链间即使
只有 1 个碱基对的差异，也会在不同时间不同部位
发生部分解链，从而形成分离的条带［22］。TGGE 的
原理与 DGGE 类似，唯一的不同在于 TGGE 采用温
度梯度，而 DGGE 采用变性剂使 DNA 双链解旋成单
链［23］。DGGE和TGGE技术具有可靠性高、重复性好、
方便快捷等优点，被广泛用于微生物群落遗传多样
性和动态结构演替分析中［24-26］。
2.3 变性高效液相色谱（denaturing high-performa-
nce liquid chromatography，DHPLC）
DHPLC 是 1995 年 由 Oefner 和 Underhill［27］ 在
SSCP 和 DGGE 基础上开发的一种检测 SNP 位点的
新技术，其原理是基于未解链的和部分解链的双链
DNA 在部分失活条件下具有不同的保留性质，这种
部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。双链
DNA 在部分变性条件下，杂合个体形成的异源双链
由于错配位点的氢键被破坏，在异源双链上形成“鼓
泡”，导致它与纯合个体的同源双链的解链特征不同。
在色谱柱中，异源双链将先于同源双链被洗脱出来，
带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混
合物的峰形特征，而不含突变序列的样品只有同源
双链的峰形（图 2） ［28］。DHPLC 法具有高效、快速、
灵敏和高通量的特点，在 SNP 筛选和多态性分析中
应用广泛。李树珍等［29］研究了 DHPLC 和直接测序
法在 DNA 池 SNPs 检测中的应用，稀有等位基因频
率不小于 5% 时可在 DHPLC 中明显分辨，而直接测
序法检测的基因频率需达到 10%，结果表明 DNA 池
结合 DHPLC 技术可在大规模筛选 SNP 位点中发挥
重要作用。DHPLC 的缺点是不能确定 SNP 位点的位
置，需要通过直接测序定位［30］。
图 2 温度梯度凝胶电泳（TGGE）和变性高效液相色谱（DHPLC）在 SNP基因分型中的应用示例
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期54
3 基于杂交的 SNP分型方法
3.1 基因芯片（gene chip）
基因芯片是在固相支持介质上进行分子杂交
并原位荧光检测的一种高度集成化、多样化、微型
化和自动化的 SNP 检测技术。根据碱基配对原则
（A-T，C-G）设计探针，经过优化，探针只与完全
互补的序列杂交，而与含有 SNP 的序列不杂交。含
有特定序列的探针被固定在特殊的载体表面上，如
玻璃、硅片等，制成基因芯片。待测基因经提取扩
增、荧光化学标记后，与固定的探针进行杂交，洗
掉没有发生杂交的序列，由于目标基因和探针杂交
的程度与荧光强度及种类相关，因此通过激光扫描，
可根据荧光信号强弱或种类检测出被检序列的碱基
差别［31］。Dominik 等［10］利用基因芯片技术对大西
洋鲑（Salmo salar）15 225 个 SNP 位点进行基因分
型。基因芯片的优点是高通量，一次试验可对多个
SNP 进行规模筛选，需要少量被检材料，操作步骤少，
但缺点是芯片制造昂贵，约有 20% 的 SNP 不能证实。
3.2 TaqMan探针法
TaqMan 探针是由 PE 公司开发的以荧光共振能
量传递为基础的检测方法，供试者和受试者（发光
基团和淬灭基团）分别结合在探针的两端，可以放
大单核苷酸不匹配的效应。在 PCR 的延伸反应中，
TaqMan 探针与完全匹配的靶序列可以结合，与含
有 SNP 的突变序列不能配对。当探针与靶序列完全
配对结合时，由于 DNA 聚合酶具有 5外切酶活性，
可将供者从探针上切下来从而发出荧光 ；如果探针
与目标序列存在错配碱基，就会减少探针与目标序
列结合的紧密程度及 DNA 聚合酶切割供者的活性，
进而影响供者释放荧光的能力。Polanowski 等［32］利
用 TaqMan 探针技术开发了 45 对座头鲸（Megaptera
novaeangliae）SNP 引物。
3.3 等位基因特异寡核苷酸（allele-specific oligon-
ucleotide，ASO）
ASO 技术通过设计 20 bp 左右的寡核苷酸探针，
与固定在膜上的经 PCR 扩增的样品杂交，由于单碱
基错配双链的退火温度低于完全配对双链，所以在
特定温度下，只有完全配对的探针能够与靶 DNA 杂
交，利用放射性同位素标记探针，通过自显影可以
检测杂交是否成功［33］。ASO 需严格控制杂交条件和
设置标准对照排除假阳性和假阴性，目前已有商品
化 ASO 试剂盒检测部分癌基因的 SNP 突变［34］。
3.4 动态等位基因特异性杂交（dynamic allele-
specific hybridization，DASH）
DASH 技术的原理是，首先将标记荧光染料的
探针与目标序列配对，然后测定互补双链所发出的
荧光强度与反应体系的温度之间的关系曲线。当温
度达到变性温度时，荧光强度迅速降低 ；存在错配
碱基的互补双链的变性温度低于不含错配碱基的双
链（图 3）［35］。DASH 技术具有快速、经济、准确、
高通量和重复性好等优点，只要将 96 孔板升温、监
测荧光强度而无需依赖酶促反应，因此干扰因素少。
根据 DASH 标准［36］试验，重复性达 100%，1 200
次检测的准确度超过 99.9%。
图 3 动态等位基因特异性杂交技术（DASH）
原理示意图［35］
4 基于 PCR的 SNP分型方法
4.1 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性
（PCR-RFLP）
PCR-RFLP 是指不同个体 DNA 片段经 PCR 扩
增和限制性内切酶切割后呈现片段长度的差异，是
第一个应用于遗传研究的 DNA 水平上的分子标记。
DNA 片段经适当的限制性酶降解后，不同个体由于
酶切识别位点的差异会得到大小不等的片段，凝胶
电泳时，不同长度的 DNA 片段由于迁移率不同形成
2012年第8期 55李宏俊等 ：海洋生物单核苷酸多态性基因分型技术的研究进展
不同的条带。PCR-RFLP 是 SNP 分型最经典的技术
之一，在水产动物遗传学研究的早期应用广泛。张
辉和吴清江［37］利用 RFLP 技术分析了鲫鱼（Carassius
auratus）3 个亚种共 7 个品系的线粒体 DNA 多态性，
所采用的 13 种限制性内切酶中的 9 种在种系间或种
系内呈现多态性，共发现 16 种单倍型 ；王师等［38］
利用对扇贝核糖体 ITS 的 PCR-RFLP 分析，首次从
分子水平上鉴定区分了中国沿海 4 种主要的养殖扇
贝（栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、虾夷扇贝及海湾扇
贝），证明了该技术对 4 种扇贝进行物种鉴定的可行
性。PCR-RFLP 技术的优点是操作步骤简单、可重
复性强，但前提条件是已知 SNP 位点的侧翼序列，
并且 SNP 必须恰好在酶切位点处，这大大限制了该
技术在 SNP 基因分型中的应用。
4.2 等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，
AS-PCR）
AS-PCR 的基本原理是根据 SNP 位点设计 2 条
等位基因特异引物，等位基因特异引物对应 SNP 位
点的两个等位基因，只有当引物的 3-末端碱基与
SNP 等位基因序列互补时，延伸反应才发生。PCR
产物经凝胶电泳检测后，根据 DNA 条带的有无或者
大小即可确定 SNP 基因型。AS-PCR 是基于上述原
理的一类方法，由此衍生出 ARMS-PCR（amplification
refractory mutation system PCR）［39］、PASA（PCR
amplification of specific allele） ［40］和 ASA（allele-speci-
fic amplification） ［41］ 等方法。传统的 AS-PCR 分析 1
个 SNP 位点一般需要两个反应，因为两条等位基因
特异性引物分开进行 PCR，而改进形式的 AS-PCR
可以实现 1 个 PCR 反应检测 1 个 SNP，因为两条等
位基因特异性引物的扩增产物长度存在差异，可以
在一个反应体系中进行 PCR，提高了 SNP 的检测效
率。Qi 等［42］利用改进的四引物 AS-PCR 法从皱纹
盘鲍（Haliotis discus hannai）EST 数据库中开发了
12 对 SNP 标记 ；Li 等［43］ARMS-PCR 法筛选了 17
对海湾扇贝（Argopecten irradians irradians）多态的
SNP 引物，所检测的 SNP 位点均位于编码区，且为
同义突变。AS-PCR 的优点是开发标记成本低，检测
不同等位基因的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳即可，
但每次反应检测的 SNP 位点数目有限，适用于分析
位点较少的群体遗传学研究。
4.3 Tm-shift AS-PCR
传统 AS-PCR 检测产物需要通过电泳，Germer
等［44］发展了一种借助定量 PCR 仪并且不需要荧光
探针的 SNP 分型方法，在单管中即可实现 SNP 检
测。Tm-shift 的基本原理是利用不同长度或不同碱基
序列的 DNA 片段的熔解温度（melting temperature，
Tm）不同，根据荧光强度随温度变化的熔解温度曲
线进行基因分型。在两个等位基因特异引物的 5端
连接长尾和短尾 GC 序列，一般情况下，长尾引物
连接到 3-末端碱基 Tm 较高的引物上（G/C），短尾
引物连接到 3-末端碱基 Tm 较高的引物上（A/T）（图
4），通过分析产物的熔解曲线中峰的数目及所处温
度位置即可判定样本的 SNP 基因型（图 5）［46］。Li
等［47］利用 Tm-shift 法从文蛤（Meretrix meretrix） EST
数据库中开发了 15 对 SNP 标记 ；Zhang 和 Guo［48］
利用 Tm-shift 法获得了 46 对美洲牡蛎（Crassostrea
virginica）SNP 标记，并且在两个作图家系中验证了
其遗传规律。Tm-shift 法具有高效、快速和准确等优
点，但每个反应仅能检测 1 个 SNP 位点，通量有限，
多重 SNP 的检测技术有待进一步研究。
图 5 Tm-shift扩增产物的熔解曲线［49］
图 4 Tm-shift法引物设计示意图［45］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期56
5 展望
在后基因组时代，SNP 已经成为海洋生物许多
研究领域的焦点，发展高效、经济、稳定、高通量
的 SNP 基因分型技术已迫在眉睫。至今，至少已经
有 20 多种不同的 SNP 基因分型方法，其中包括了
各种不同的等位基因区分反应和信号检测方法，不
同检测方法各有其优缺点（表 1）。焦磷酸测序法
和基因芯片技术在高通量基因分型中具有显著的优
点，但它们属于前沿领域，需要特殊的仪器和昂贵
的试剂，成本较高。SSCP 和 DGGE 由于存在不能
对 DNA 序列变异进行精确的定位和假阳性偏高等问
题，大大限制了它们在 SNP 基因分型中的应用。基
于 PCR 的 SNP 分型技术具有快速和准确的优点，尤
其 Tm-shift AS-PCR 法无需经过电泳流程，但这些方
法需要针对每个位点设计特异引物，每次反应只能
分析 1 个位点，通量有限。总之，不同方法有其适
用范围和优缺点，研究人员应根据不同的目的选取
合适的方法，以达到最大的检出效率和准确性。
表 1 各种 SNP分型方法的优势与不足
SNP 分型方法 优势 不足
测序分析法
PCR 产物直接测序 技术简单、方法成熟，适合水产动物基因多样性与性状关联分析 不能区分不同 SNP 的单倍型，分析的 SNP 位点有限
焦磷酸测序 适用于样本的快速检测 需要特殊的仪器和昂贵的试剂，成本较高
微测序 速度快，成本低 ；适用于检测已知的 SNP 仪器昂贵
构象分析法
单链构象多态性 简便、快速，不需要特殊的仪器 不能精确定位 SNP，检测片段在 300 bp 以内
变性梯度凝胶电泳 灵敏 难以大规模开展工作，需要通过测序定位 SNP
变性高效液相色谱 高效、快速、灵敏、高通量，适用于 SNP 筛选和多态性分析 不能精确定位 SNP
杂交分析法
基因芯片 快速、高通量 ；操作简便 需要特殊的仪器，成本较高
TaqMan 探针 适合对已知 SNP 位点的高通量检测 价格昂贵
等位基因特异寡核苷酸 适用于检测已知 SNP 位点 设计探针
动态等位基因特异性杂
交 操作简便、高通量 ；成本低 设计探针
PCR 分析法
PCR-RFLP 操作步骤简单、可重复性强 仅能检测有酶切位点的 SNP
等位基因特异性 PCR 检测方便，成本低 检测的 SNP 位点数目有限
Tm-Shift AS-PCR 高通量、快速、准确、灵敏，操作步骤简单 需要荧光定量 PCR 仪，每个反应仅能检测 1 个 SNP 位点
参 考 文 献
［1］ Frazer KA, Ballinger DG, Cox DR, et al. A second generation human
haplotype map of over 3. 1 million SNPs. Nature, 2007, 449（7164）：
851-861.
［2］ Alain V, Denis M, Magali SC, et al. A review on SNP and other types
of molecular markers and their use in animal genetics. Genet Sel
Evol, 2002, 34 ：275-305.
［3］ Anthony JB. The essence of SNPs. Gene, 1999, 234（2）：177-186.
［4］ Nickerson DA, Taylor SL, Weiss KM, et al. DNA sequence diversity in
a 9. 7-kb region of the human lipoprotein lipase gene. Nature Genet,
1998, 19 ：233-240.
［5］ Smith CT, Templin WD, Seeb JE, et al. Single Nucleotide polymorp-
hisms provide rapid and accurate estimates of the proportions of U. S.
and Canadian chinook salmon caught in Yukon River fisheries. North
Am J Fish Manage, 2005, 25 ：944-953.
［6］ Rengmark AH, Slettan A, Skaala Ø, et al. Genetic variability in wild
and farmed Atlantic salmon （Salmo salar） strains estimated by SNP
and microsatellites. Aquaculture, 2006, 253 ：229-237.
［7］ Kucuktas H, Wang S, Li P, et al. Construction of genetic linkage
maps and comparative genome analysis of catfish using gene-
associated markers. Genetics, 2009, 181（4）：16496-1660.
［8］ Du ZQ, Ciobanu DC, Onteru SK, et al. A gene-based SNP linkage
2012年第8期 57李宏俊等 ：海洋生物单核苷酸多态性基因分型技术的研究进展
map for pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Animal Genet,
2010, 41（3）：286-294.
［9］ Prasertlux S, Khamnamtong B, Chumtong P, et al. Expression levels
of RuvBL2 during ovarian development and association between its
single nucleotide polymorphism （SNP） and growth of the giant tiger
shrimp Penaeus monodon. Aquaculture, 2010, 308 ：S83-S90.
［10］ Dominik S, Henshall JM, Kube PD, et al. Evaluation of an
Atlantic salmon SNP chip as a genomic tool for the application in
a Tasmanian Atlantic salmon （Salmo salar） breeding population.
Aquaculture, 2011, 308 ：S56-S61.
［11］ Rao VB. Direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified
DNA. Anal Biochem, 1994, 216 ：1-14.
［12］ Xu TJ, Chen SL, Ji XS, et al. Molecular cloning, genomic structure,
polymorphism and expression analysis of major histocompatibility
complex class IIA and IIB genes of half-smooth tongue sole
（Cynoglossus semilaevis）. Fish & Shellfish Immunol, 2009, 27 ：
192-201.
［13］ Bao YB, Li L, Zhang GF. Polymorphism of the superoxide dismutase
gene family in the bay scallop （Argopecten irradians） and its
association with resistance/susceptibility to Vibrio anguillarum.
Dev Comp Immunol, 2010, 34 ：553-561.
［14］ 汤华阳 , 杜卫东 , 张学军 . 焦磷酸测序技术及应用 . 医学分子
生物学杂志 , 2007, 4（3）：272-275.
［15］ 杨会勇 , 那广水 , 朱术会 , 等 . 利用线性指数 PCR-焦磷酸测序
技术快速检测 3 种海洋弧菌 . 中国医科大学学报 , 2009, 40 ：
460-464.
［16］ 苏畅 , 刘敬忠 . 微测序技术分析人类单核苷酸多态性 . 生物技
术 , 2003, 4 ：36-38.
［17］ Villar J, Maca-Meyer N, Pérez-Méndez L, et al. Bench-to-bedside
review ：understanding genetic predisposition to sepsis. Critical
Care, 2004, 8 ：180-189.
［18］ Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, et al. Rapid and sensitive detection
of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase
chain reaction. Genomics, 1989, 5 ：874-879.
［19］ Wang XL, Meng XY, Song B, et al. SNPs in the myostatin gene of
the mollusk Chlamys farreri：association with growth traits. Comp
Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2010, 155 ：327-330.
［20］ He F, Wen SH, Dong S, et al. Identification of single nucleotide poly-
morphism cytochrome P450-c19a and its relation to reproductive
traits in Japanese flounder （Paralichthys olivaceus）. Aquaculture,
2008, 279 ：177-181.
［21］ Fischer SG, Lerman LS. Length-independent separation of DNA
restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis. Cell,
1979, 16 ：191-200.
［22］ Fodde R, Losekoot M. Mutation detection by denaturing gradient
gel electrophoresis （DGGE）. Hum Mutat, 1994, 3 ：83-94.
［23］ Gerard M. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural
ecosystems. Current Opinion in Microbiol, 1999, 2 ：317-322.
［24］ Muyzer G, Smalla K. Application of denaturing gradient gel electro-
phoresis （DGGE） and temperature gradient gel electrophoresis
（TGGE） in microbial ecology. Antonie Van Leeuwenhoek, 1998, 73
（1）：127-141.
［25］ 张振冬 , 王淑芬 , 曹宇峰 . DGGE 技术及其在海洋环境微生物
多样性研究中的应用 . 海洋环境科学 , 2008, 27 ：297-300.
［26］ 关晓燕 , 周遵春 , 姜冰 , 等 . DGGE 分析不同盐度仿刺参养殖
环境中菌群多样性 . 水产科学 , 2011, 5 ：276-280.
［27］ Oefner PJ, Underhill PA. Comparative DNA sequencing by denatu-
ring high-performance liquid chromatography （DHPLC）. Am J
Hum Genet, 1995, 57 ：A266.
［28］ 方能虎 , 蔺丽 , 任吉存 , 等 . 变性高效液相色谱—一种新的基
因突变检测方法 . 化学进展 , 2005, 17 ：343-349.
［29］ 李树珍 , 万慧荣 , 杨光 . DNA 池结合 DHPLC 和直接测序技术
在江豚 SNPs 检测中的应用 . 兽类学报 , 2009, 29 ：185-190.
［30］ Han W, Yip SP, Wang J, et al. Using denaturing HPLC for SNP disc-
overy and genotyping, and establishing the linkage disequilibrium
pattern for the all-trans-retinol dehydrogenase （RDH8） gene . J
Hum Genet, 2004, 49 ：16-23.
［31］ Wang DG, Fan JB, Siao CJ, et al. Large-scale identification, map-
ping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the hu-
man genome. Science, 1998, 280 ：1077-1082.
［32］ Polanowski AM, Schmitt NT, Double MC, et al. TaqMan assays for
genotyping 45 single nucleotide polymorphisms in the humpback
whale nuclear genome. Conserv Genet Resources, 2011, 3 ：
645-649.
［33］ Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, et al. Hybridization of synthetic
oligodeoxyribonucleotides to ΦX 174 DNA ：the effect of single
base pair mismatch. Nucleic Acids Res, 1979, 6 ：3543-3557.
［34］ Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, et al. Analysis of enzymatically
amplified β-globin and HLA-DQα DNA with allele-specific
oligonucleotide probes. Nature, 1986, 324 ：163-166.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期58
［35］ Howell WM, Jobs M, Gyllensten U, et al. Dynamic allele-specific
hybridization. A new method for scoring single nucleotide polymor-
phisms. Nat Biotechnol, 1999, 17（1）：87-88.
［36］ Prince JA, Feuk L, Howell WM, et al. Robust and accurate single
nucleotide polymorphism genotyping by dynamic allele-specific
hybridization （DASH）：design criteria and assay validation.
Genome Res, 2001, 11 ：152-162.
［37］ 张辉 , 吴清江 . 鲫不同种系线粒体 DNA 物理图谱的构建 . 水
生生物学报 , 2000, 24 ：219-227.
［38］ 王师 , 包振民 , 张玲玲 , 等 . 应用 PCR-RFLP 技术鉴别区分中
国沿海四种主要养殖扇贝. 食品科学 , 2006, 27 ：210-214.
［39］ Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point
mutation in DNA. The amplification refractory mutation system
（ARMS）. Nucleic Acids Res, 1989, 17 ：2503-2516.
［40］ Sommer SS, Groszbach AR, Bottema CD. PASA is a general method
for rapid detection of known single-base changes. Biotechniques,
1992, 12 ：82-87.
［41］ Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, et al. Allele-specific enzymatic
amplification of β-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell
anemia. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86 ：2757-2760.
［42］ Qi HG, Liu X, Zhang GF, et al. Mining expressed sequences for
single nucleotide polymorphisms in Pacific abalone Haliotis discus
hannai. Aquaculture Res, 2009, 40 ：1661-1667.
［43］ Li RH, Li Q, Kong LF. Characterization of expressed sequence tag-
derived single-nucleotide polymorphisms in the bay scallop Argop-
ecten irradians irradians. Fisheries Sci, 2009, 75 ：1389-1400.
［44］ Germer S, Higuchi R. Single-tube genotyping without oligonucleo-
tide probes. Genome Res, 1999, 9 ：72-78.
［45］ 李宏俊 , 梁瑜 , 邢坤 , 等 . 紫贻贝 EST-SNP 的筛选及多态性检
测 . 水产学报 , 2011, 35 ：348-355.
［46］ Wang J, Chuang K, Ahluwalia M, et al. High-throughput SNP geno-
typing by single-tube PCR with Tm-shift primers. Biotechniques,
2005, 39 ：885-893.
［47］ Li HJ, Zhu D, Gao XG, et al. Mining single nucleotide polymorp-
hisms from EST data of hard clam Meretrix meretrix. Conserv Genet
Resources, 2010, 2 ：69-72.
［48］ Zhang LS, Guo XM. Development and validation of single nucleotide
polymorphism markers in the eastern oyster Crassostrea virginica
Gmelin by mining ESTs and resequencing. Aquaculture, 2011, 302：
124-129.
［49］ Liu WD, Li HJ, Bao XB, et al. The first set of EST-derived
single nucleotide polymorphism markers for Japanese scallop,
Patinopecten yessoensis. J World Aquacult Soc, 2011, 42（3）：
456-461.
（责任编辑 狄艳红）