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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
Southern 印迹杂交技术因其高灵敏度、高特异
性已成为检测关键性 DNA 片段的经典方法之一［1］，
目前广泛应用于分子生物学和基因工程等研究领域。
Southern 杂交探针分为放射性和非放射性两类［2］，
早期以同位素标记的放射性探针为主，具有较高的
灵敏度和特异性，但存在半衰期，易造成放射性污
染。非放射性地高辛（DIG）标记探针具有敏感性
高、方便、安全和探针储存期长等优点，得到了广
泛的应用［3-5］。探针标记的方法主要有随机引物延
收稿日期 ： 2014-03-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31200503），现代农业产业技术体系建设专项（NYCYTX-34）
作者简介 ：李季，男，博士，助理研究员，研究方向 ：橡胶树转基因后代分子检测及橡胶树内源启动子的克隆 ；E-mail ：appleliji@163.com
通讯作者 ：黄华孙，男，研究员，研究方向 ：橡胶树种质创新与遗传育种 ；E-mail ：xjshhs@163.com
橡胶树转基因植株 Southern 杂交体系的优化
李季1  鲁旭1，2  黄天带1  华玉伟1  黄华孙1
（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室，儋州 571737 ；2. 海南大学农学院，海口 570228）
摘 要 ： 以地高辛标记的 Southern 杂交技术已广泛应用于多个物种中。选择橡胶树为材料，就基因组 DNA 的提取、探针标
记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。结果表明，至少 40 μg 高质量的 DNA 在 300 μL 的大酶切体系
中，酶切 12 h 可获得良好效果 ；PCR 法标记的探针杂交条带清晰、背景浅，其效率明显强于随机引物法标记的探针。本研究优化
的体系信号强、背景浅和灵敏度高，为橡胶树 Southern 杂交鉴定分析提供参考。
关键词 ： 橡胶树 转基因 Southern blot 地高辛 PCR 法标记
Optimization of Digoxigenin Based Southern Blot for Transgenic Hevea
brasiliensis Analysis
Li Ji1 Lu Xu1，2 Huang Tiandai1 Hua Yuwei1 Huang Huasun1
（1. Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences & Key Laboratory of Rubber Biology，Ministry of Agriculture，
Danzhou 571737 ；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）
Abstract:  Southern blot technology based on the DIG-chemiluminescent detection has been widely used in numerous species. Using
Hevea brasiliensis as materials, the DIG-labeled Southern blot analysis was improved through optimizing several key steps, including extraction
of genome DNA, usage of DNA samples amount, digestion system, the comparison between PCR and random-primed labeled method and a serial
of procedure in the process of the hybrid. The results showed that desirable digestion result could be achieved when at least 40 μg DNA samples
with high quality were enzymed in 300 μL reaction system for 12 hours. The efficiency of probe labeled with the method of PCR was higher than
that of probe labeled with random primer obviously, while the Southern blot result of PCR labeled was clear, and the background was lightly,
which was conducive to read the copy number accurately. Finally, Southern blot with DIG-labeled was optimized, and good result with high
sensitivity and low background was achieved．
Key words:  Hevea brasiliensis Transgene Southern blot DIG labeling PCR labeled method
伸标记法、缺口平移法、末端标记法、PCR 法和荧
光标记法等。但其中最为常用是 PCR 标记法和随机
引物法［6］。目前棉花［7］、烟草［8］、水稻［9］、油菜［10］、
小麦［11］等植物利用地高辛标记的 Southern 杂交均
获得较好的杂交效果，而橡胶树基因组结构较为复
杂［12］，同位素探针标记的 Southern 杂交技术虽已成
功应用［13-16］，但地高辛标记的 Southern 杂交还较为
困难，主要表现在条带模糊，背景较深，试验结果
读取不够准确等［17-20］。本研究主要以转基因橡胶树
2014年第8期 77李季等 ：橡胶树转基因植株 Southern 杂交体系的优化
PCR 检测阳性的植株为材料，结合大量的试验经验，
从基因组 DNA 的提取，探针标记的方法以及杂交过
程中的细节对橡胶树地高辛标记的 Southern 杂交方
法进行优化，旨在为转基因橡胶树 Southern 杂交鉴
定奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
转启动子陷阱载体的转基因植株 1 株［21］，命名
为启 T13，转 HbFCA 启动子的转基因植株 3 株［22］，
分别命名为 S 启 j10、S 启 j12 和 S 启 j13，上述 4 株
转基因植株骨架载体均为 pCAMBIA2301 ；转 pCAM-
BIA2301 空载体的转基因植株 2 株，命名为 PT55 和
PTj71，均由本课题组利用次生体胚发生方法获得，
以上植株均由 GUS 和 PCR 检测为阳性，对照植株
为非转基因植株。
1.2 方法
1.2.1 目的基因 Npt 扩增及序列分析 以 pCAMBIA-
2301 载体质粒为模板，利用引物 Npt-f/r PCR 扩增
453 bp 的目的基因 Npt 片段［23］，PCR 反应体系及程
序 参 照 PrimeSTAR® Max DNA 聚 合 酶（TaKaRa Cat.
#DR045A）说明书。1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结
果，并切胶回收，取部分回收产物加尾，溶液回收
后连接至 pMD®19-T 载体（TaKaRa Cat. #D102A）上，
挑取 3 个单克隆交由北京华大基因有限公司测序。
1.2.2 地高辛探针标记 分别采用随机引物法和
PCR 法对目的基因 Npt 进行标记。随机引物法和
PCR 法探针标记的具体过程分别参考地高辛标记试
剂盒 II（Roche Cat. #REF 11 585 614 910）及 PCR 法
DIG 探针合成试剂盒（Roche Cat. #REF 11 636 090
910）说明书，其中随机引物法和 PCR 法的模板均
为测序正确的 Npt 回收产物，浓度分别是 1 μg 和 50
ng。取 2 μL PCR 标记产物 1% 琼脂糖检测探针标记
效率及产量。
1.2.3 探针标记效率的检测 将上述两种方法标记
的探针以及地高辛标记试剂盒 II 中的阳性对照 DNA
稀释 100 倍后作为起始浓度按照试剂盒说明书进行
系列梯度稀释，各取 1 μL 点在带正电的尼龙膜上，
紫外交联（1200J），按照说明书的方法进行标记效
率的检测，并比较对照与 DIG 标记 DNA 稀释样品
的显色强度，根据稀释倍数换算出探针浓度。
1.2.4 橡胶树叶片基因组 DNA 的提取 DNA 提取的
过程详见 DNA 提取试剂盒（TIANGEN Cat. #DP320）
说明书，尽量选用的材料是转基因橡胶树淡绿期叶
片，每个样品抽提 10 管 DNA，用 100 μL 的灭菌蒸
馏水加入到第一管 DNA 的吸附柱内洗脱，将洗脱
液重新加回到原来的吸附柱内再次洗脱，而后用这
100 μL 的洗脱液重复上述步骤洗脱第 2 管，直至利
用这 100 μL 洗脱完这 10 管 DNA。取 1 μL 电泳检测
提取 DNA 的质量，确保无明显的蛋白质和 RNA 残
留后，分光光度计测浓度。
1.2.5 样品酶切及电泳 每个样品取 40-60 μg 进行
酶切，酶切体系为 300 μL，其中包含 30 μL 10×NEB
Buffer 2，8-10 μL 的限制性内切酶 Hind III（NEB）。
37℃酶切 12-16 h。酶切结束后，取 5 μL 检测酶切
是否彻底，之后无水乙醇沉淀 DNA，加入 loading
buffer 后上样，待溴酚蓝跑至凝胶底端后停止电泳。
1.2.6 真空转膜及固定 琼脂糖凝胶的变性与中和
参考地高辛标记试剂盒 II 说明书。使用真空转移仪
进行转膜，将转好的尼龙膜放在 2×SSC 浸泡 2 min
左右，浸洗 2 次后将膜洗至中性，并去除膜上的凝
胶碎片和杂质，紫外交联（1200J）固定。
1.2.7 杂交及显影 杂交及显影过程参照说明书，
略有改动。杂交液 42℃预热，将膜放置在杂交管中，
预杂交 2 h。取适量探针加入到 100 μL 杂交液中，
PCR 仪 99℃变性 10 min 后立即放置冰上，将 42℃
预热的杂交液 10 mL 倒入杂交管中，加入变性好的
探针，轻轻混匀，50℃（按照试剂盒说明书的方法
计算 Mpt 基因杂交温度为 48℃-53℃，取中间温度
50℃作为 Npt 基因的杂交温度）中速转动杂交 16 h。
膜洗涤时，0.5×SSC，0.1% SDS（预热到 68℃）中
68℃振荡洗膜 2×20 min。封闭溶液工作液和抗体溶
液工作液孵育时间延长至 40 min，其余过程与说明
书相同。依次进行显影（一般 1 min 左右）、水漂洗（10
s）、定影（30 s），定影结束后，用流动的清水冲洗
胶片两面，晾干，照相留存。
1.2.8 探针洗脱及再次杂交 探针的洗脱及再次杂
交参照说明书在杂交炉中进行。本研究中先用随机
引物标记的探针进行第一次杂交，剥离后，用 PCR
标记的探针进行再次杂交。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期78
2 结果
2.1 地高辛标记探针的检测
2.1.1 常规 PCR 检测 PCR 标记探针电泳检测结果
如图 1 所示，未标记的 Npt 基因片段大小为 453 bp，
而 PCR 法标记上地高辛后，由于 DIG 的分子量较大，
高效率掺入 DNA 后，探针的分子量明显增大，电泳
检测时导致迁移速率比没有掺杂 DIG 的对照慢，分
子量大小在 700 bp 左右，表明探针标记成功。
探针加入量为 0.30 μL/10 mL。
2.2 橡胶树基因组DNA的质量检测
Southern 杂交要求提取具有较高质量的 DNA，
本研究利用试剂盒提取橡胶树 DNA，电泳结果如图
3 所示，DNA 条带主带明显，并无拖尾现象，点样
孔处无明显残留。紫外分光光度计检测样品的 OD 值，
待测样品的 OD260/OD280 均在 1.8-1.9 之间，说明样
品中蛋白含量、RNA 含量均较少，而 OD260/OD230 均
大于 2.0，说明样品中无机盐小分子杂质较少。本研
究中利用 DNA 提取试剂盒提取的 DNA 纯度高，适
用于 Southern 杂交所需 DNA 的要求（表 1）。
1M
2000
bp
1000
750
500
200
100
2
M ：DL 2000 DNA Marker ；1 ：已标记的 Npt 基因 ；2 ：未标记的 Npt 基因
图 1 PCR 法标记 Npt 基因探针的电泳检测结果
2.1.2 地高辛标记探针效率的检测 检测结果如图
2 所示，对照 DNA 出现 4 个稀释的探针点，而随机
引物法和 PCR 标记法 6 个稀释的探针点均能较好地
显现。经亮度比对并根据稀释浓度换算发现，随机
引物法标记的探针浓度为 3 pg/μL×10×100×100=
300 ng/μL，PCR 标 记 的 探 针 浓 度 是 3 pg/μL×10×
3.3×100×100=990 ng/μL，根据地高辛杂交试剂盒
要求探针浓度为 25 ng/mL，因此随机引物法标记的
探针加入量为 0.85 μL/10 mL，而 PCR 标记法标记的
1
CK
A
B
2 3 4 5 6
1-6：稀释不同倍数的探针（按照地高辛试剂盒说明书要求稀释，分别为 10、3、
1、0.3、0.1 和 0.03 pg/μL），CK（出现 4 个点）：地高辛标记的对照 DNA；A：
随机引物法标记的 Npt 探针 ；B ：PCR 法标记的 Npt 探针 ；箭头表示亮度一
致的探针浓度，即 A 和 B 互换，A 是 PCR 法标记的 Npt 探针 ；B 是随机引
物方法标记的 Npt 探针
图 2 随机引物法和 PCR 法探针标记效率的检测
1 2 3 4 5 6 7
15000
bp
10000
7500
5000
2500
M
1 ：对照非转基因植株 ；2 ：S 启 j13 ；3 ：PT55 ；4 ：S 启 j10 ；5 ：PTj71 ；6 ：
启 T13 ；7 ：S 启 j12 ；M ：DL15000 Marker
图 3 橡胶树基因组 DNA 的提取
表 1 橡胶树基因组 DNA 浓度及 OD 值
材料编号 浓度（ng/μL） OD260/OD280 OD260/OD230
对照 900 1.83 2.01
S 启 j13 530 1.81 2.10
PT55 770 1.89 2.03
S 启 j10 800 1.85 2.08
PTj71 810 1.88 2.05
启 T13 500 1.85 2.09
S 启 j12 450 1.83 2.07
2.3 橡胶树Southern杂交酶切及转膜
本研究曾用 10 μg/80 μL 和 30 μg/300 μL 左右的
DNA 进行酶切，但是 Southern 杂交效果不理想，带
型很弱，甚至无法分辨拷贝数（结果未列出）。本试
验中利用至少 40 μg 的 DNA 量，在 300 μL 的酶切
体系中 Hind III 酶切过夜，取 5 μL 酶切过夜后的产
物检测如图 4-A，结果显示酶切产物高分子质量区
较亮，低分子质量区较暗，酶切效果较好。将剩余
的酶切产物回收后点样，低电压跑过夜，完全符合
Southern 杂交的酶切要求，2-3 样品亮度有些偏暗，
2014年第8期 79李季等 ：橡胶树转基因植株 Southern 杂交体系的优化
考虑可能是 DNA 模板较少，为 40 μg，酶切效果较好，
而 5-8 样品模板为 60 μg，亮度均一一致，与未酶切
DNA 相比可见酶切彻底，酶切效果好（图 4-B）。利
用真空转移仪将 DNA 转移至尼龙膜上，并将转移后
的胶放在成像系统中，观察 DNA 的转移情况，一般
1-1.5 h 可以将胶上的 DNA 完全转移至尼龙膜上。
显的黑色背景，符合预期结果。
3 讨论
3.1 不同方法探针标记比较
用于 Southern 杂交探针标记的方法有很多种，
常用的有随机引物延伸法、PCR 标记法和切刻平移
法。随机引物法标记探针需要大量的 DNA，制备耗
时较长，且探针需要纯化，否则会造成杂交背景过深，
影响对试验结果的分析研究［11，24］。如本研究采用
随机引物法标记的探针未进行纯化，杂交背景较深，
且有些单株产生颜色较浅且模糊带型，杂交结果不
易明确读取。切刻平移法只适用于双链 DNA 的标记，
对于小片段 DNA 标记效果不理想［25］。PCR 标记方
法较其他标记方法而言，操作简便、特异、高效且
灵敏度高［26］。PCR 标记的探针对模板 DNA 的质量
要求较低，仅需 2-10 ng 纯度适中的 DNA 模板即可
标记［27］。该方法采用专一的标记酶，价格相对昂
贵［6，25］，但单次杂交所需的探针量很少。一次标记
可产生 50 μL 的 PCR 产物，本研究中单次杂交探针
的使用量在 0.3 μL/10 mL 左右，一次标记可使用 150
次，不同的探针标记可以按照比例缩小 PCR 标记的
产物量，在一定程度上大大削减杂交成本。PCR 法
标记的探针灵敏度高于随机引物法，两者相差高达
一个数量级甚至更多［24，27，28］，本研究中两者标记
的效率相差仅 3 倍，考虑可能是本研究中随机引物
标记探针的起始 DNA 模板浓度较高，在相同时间
内标记的探针产物也较多。本研究室前期一直利用
随机引物法对目的基因探针进行标记，存在杂交条
带模糊，背景较深，甚至非地高辛标记 Marker 也可
杂交出条带等问题 ；本试验中利用 PCR 法标记的探
针均未出现上述问题，在一定程度上说明 PCR 法标
记探针其特异性优于随机引物法。从本次研究结果
分析，笔者认为橡胶树植株的 Southern 杂交检测时，
PCR 法标记法更有优势。
3.2 橡胶树基因组Southern杂交过程中注意事项
3.2.1 DNA 的提取方法及酶切 DNA 的质量是决定
后续 Southern 杂交顺利进行的关键，高质量的 DNA
酶切更为彻底、转膜更为充分。本研究室前期采用
传统的 CTAB 法对橡胶树基因组 DNA 进行提取［29］，
存在 DNA 中混杂一定量的 RNA 和其他杂质，导致
1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
A B
A ：酶切过夜后取 5 μL 检测酶切效果 ；1 ：对照 DNA ；2 ：S 启
j13 ；3 ：PT55 ；4 ：S 启 j10 ；5 ：PTj71 ；6 ：启 T13 ；7 ：S 启 j12 ；M ：
DL15000 Marker。B：酶切产物回收后低电压跑胶过夜；1：参考尺，
2-8 ：酶切产物，其中 2 ：对照 DNA ；3 ：S 启 j13 ；4 ：PT55 ；5 ：
S 启 j10 ；6 ：PTj71 ；7 ：启 T13 ；8 ：S 启 j12 ；9 ：pCAMBIA2301
质粒 DNA ；10 ：基因组 DNA（未酶切）；M ：DL15000 Marker
图 4 橡胶树基因组 DNA 酶切检测
2.4 Southern杂交检测结果
将尼龙膜固定后进行地高辛杂交，两种探针标
记方法的杂交结果中对照 DNA 酶切与未酶切的样品
均无杂交带，随机引物法的杂交背景较深，杂交条
带不清晰，探针中的杂质影响最终的结果，表现为
黑色背景，杂交效率较低，部分单株的拷贝数无法
识别（图 5-A）；而 PCR 标记法的杂交背景较浅，杂
交条带清晰，易分辨，整个结果（图 5-B）中无明
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A B
1-7 ：Hind III 酶切的样品，1 ：对照 DNA ；2 ：S 启 j13 ；3 ：PT55 ；4 ：S 启
j10 ；5 ：PTj71 ；6 ：启 T13 ；7 ：S 启 j12 ；8 ：pCAMBIA2301 质粒 DNA ；9 ：
基因组 DNA（未酶切）
图 5 橡胶树经过随机引物法标记（A）和 PCR 标记法（B）
的杂交结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期80
DNA 浓度检测不够精准，无法准确计算酶切体系中
加入的 DNA 量，且提取 DNA 耗时较长，需要约 2
d 时间。本研究中采用适合富含多糖、多酚类物质
的 DNA 提取试剂盒对橡胶树基因组 DNA 进行提取，
相较传统的 CTAB 提取方法而言，试剂盒提取的
DNA 浓度虽然较低，但纯度大幅提高，紫外分光光
度计检测的浓度更为准确，酶切体系中加入的 DNA
模板可准确定量。且 DNA 提取时间仅需 2 h。橡胶
树的基因组较大，结构较复杂［12］，同等强度的杂交
信号所需的酶切量较大。本研究中高质量 DNA 样品
的酶切量至少在 40 μg 以上，利用扩大的酶切体系，
酶切充分的样品 DNA 产生若干大小不同的片段，呈
现连续的，荧光由深至浅的均匀条带，酶切效果更
为理想。酶切产物选用直接加乙醇沉淀［7］，避免酶
切产物的损失。
3.2.2 Southern 杂交过程中的注意事项 利用地高
辛标记的探针进行 Southern 杂交时，最常见的问题
是高背景［30］。本研究中将封闭溶液工作液和抗体
溶液工作液孵育时间延长至 40 min，非严谨性洗膜
采用 68℃高温，并延长洗膜时间至 20 min×2 次。
Solanas 等［4］认为足够量的地高辛抗体可以获得较
好的杂交信号，但是过高的抗体浓度可能会产生多
斑点的背景，本研究按照地高辛试剂盒的要求加入
抗体，杂交效果较好。Southern 杂交加入的探针体
积通常为几微升，本研究中将计算加入的探针量预
先加入 100 μL 杂交液中变性，而后将其加入杂交管
中，可最大程度减少探针的损失，且可避免高浓度
的探针直接黏附在膜上产生黑斑［31］。有文献报道在
碱转移结束后无需对尼龙膜上的 DNA 进行专门的固
定［32］，考虑到转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存，
且为防止长期保存过程中 DNA 结合不紧密影响杂交
效果，本研究中仍然利用紫外交联仪进行 DNA 固定。
在转基因植株的 Southern 检测过程中往往需要对同
一张膜进行多个探针的杂交，因此探针的剥离尤为
重要，在杂交和检测的过程中始终保持尼龙膜的湿
润 ；在用 NaOH/SDS 处理尼龙膜时，在杂交炉中保
证溶液与尼龙膜正面充分接触，并调整杂交炉的转
速为中速，减少膜上 DNA 的损失［33］。
4 结论
本研究针对基因组 DNA 的提取、PCR 法与随机
引物法标记探针的比较以及杂交过程中的注意事项
等方面对基于地高辛标记的橡胶树 Southern 杂交技
术体系进行了优化。使用 DNA 提取试剂盒提取的至
少 40 μg 高质量 DNA 在 300 μL 的大酶切体系中，酶
切 12 h 可获得良好的效果。利用 PCR 法标记探针的
效率及杂交结果明显强于随机引物法。延长封闭溶
液工作液和抗体溶液工作液孵育时间至 40 min，非
严谨洗膜采用 68℃，且延长时间至 20 min/次，并将
探针预先加入到杂交液中进行变性减少探针的损失
和避免膜上产生黑斑等方面进行了优化。
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（责任编辑 李楠）