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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-06-21
基金项目 : 国家重大专项（2008ZX08002-001，2009ZX08002-011B）, 科技部国际合作项目（2009DFA32020）, 江苏省农科院人才基金项目
（6510905）
作者简介 : 魏芳 , 女 , 博士 , 研究方向 : 植物逆境生理生化 ;E-mail:wfang545@yahoo.com.cn
通讯作者 : 马鸿翔 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 小麦遗传育种 ;E-mail:hongxiangma@163.com
小麦抗赤霉病品种 NBS 同源序列克隆与分析
魏芳 马鸿翔
（江苏省农业科学院农业生物技术研究所，南京 210014）
摘 要 : 根据二穗短柄草 NBS-LRR 类基因的保守序列设计同源引物，以小麦抗赤霉病品种苏麦 3 号、宁 7840 和望水白基
因组 DNA 为模板，通过 PCR 扩增，得到 43 条序列，其中 4 条为非编码序列或结构域不完整 ；39 条与植物抗病基因同源，其中的
7 条内部存在终止密码子，可能是假基因，经过比对分析，其余 32 条具有连续的开放阅读框和保守结构域，推导的氨基酸序列均
具有 Kinase-1a、Kinase-2 和 Kinase-3a 及 GLPL 区等几个保守区，在 GenBank 中均能找到与之高度同源的其他物种的核酸序列，并
且 Kinase-2 的最后一个氨基酸均为色氨酸（W），属于 non-TIR 类 NBS 基因。32 条序列可分为 4 大类，它们之间核苷酸同源性为
64%-98%，编码氨基酸同源性为 22%-98%。根据序列分析随机设计 5 对不同基因特异性引物，并利用 RT-PCR 技术进行表达分析，
结果表明，7-1、s-3、s-4 和 w-2 均能表达，说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列 ；7-13 不表达，再次证明属于假基因。
32 条序列在之前未被报道过，这些 RGA 可以作为筛选赤霉病功能性抗病基因的候选序列。
关键词 : NBS-LRR 抗病基因同源序列 小麦赤霉病
Isolation and Analysis of NBS Analogs from Wheat Fusarium
Head Blight Resistant Cultivater
Wei Fang Ma Hongxiang
（Institute of Agro-Biotechnology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014）
Abstract: The homologous primers were designed for Brachypodium distachyon NBS-LRR genes. Resistance gene analogs （RGA）
sequences were cloned from wheat genomic DNA of FHB resistant lines Sumai 3, Ning 7840 and Wangshuibai. Out of 43 RGA, 4 were non-
coding sequences or incomplete domain while 39 sequences had homology with plant resistance genes. Seven of them were interrupted by stop
codons, which may be pseudogenes. The blast analysis of remaining 32 sequences showed continuous open reading frame and conserved domains.
The deduced amino acids （aa） have Kinase-1a, Kinase-2, Kinase-3a and GLPL domains, which could find high homology in GenBank with other
plant nucleic acid sequences. Moreover, the last amino acid of Kinase-2 domain of these sequences is Trp （W）, so all belong to the non-TIR-
NBS. The 32 sequences could be diverse 4 classes and showed 64%-98% homology in nucleotides and 22%-98% in amino acid sequences.
To further analyze the expression o f these RGAs, RT-PCR was preformed. The results showed that 7-1, s-3, s-4 and w-2 could express, which
indicated that these fragments might be partial sequence of functional R genes ；whereas 7-13 didnt express, which indicated it might be
pseudogene again. These 32 RGAs are new and can be used as candidate sequences to confer functional resistance to the FHB.
Key words: NBS-LRR Resistance gene analogs Fusarium head blight of wheat（FHB）
小麦赤霉病是我国小麦生产中的重要病害，
赤霉病的发生不仅造成巨大的产量损失，也影响
小麦籽粒加工品质，特别是致病菌产生的真菌毒
素对人畜健康都存在潜在威胁。筛选和培育抗病
品种是防治小麦赤霉病最为安全、经济和有效的
方法。而抗病基因的克隆对于培育抗病作物品种
和研究病原物与寄主之间相互作用机制具有重要
意义［1,2］。
2012年第2期 129魏芳等 ：小麦抗赤霉病品种 NBS 同源序列克隆与分析
抗病基因是指寄主体内能特异识别病原并激发
抗病反应的基因，它与病原菌的无毒基因 Avr 直接
或间接编码产物互作后，启动并传导信号，激发过
敏反应或系统获得抗性等抗病反应［3］。目前已经发
现的多个植物抗病基因在氨基酸水平上表现出一定
程度的相似性，在一些区段高度保守，大部分植物
抗病基因编码 NBS-LRR 类抗病蛋白［4,5］。NBS 区
被认为是许多蛋白质执行功能的必需元件，与 ATP
和 GTP 的结合有关，而且它还具有激酶活性，可
以激活其他功能蛋白。LRR 结构域则可能在蛋白
质的相互作用中起重要作用，参与抗病反应的识别
及识别后的抗病信号传导。NBS-LRR 类抗病基因
的 NBS 区含有一些高度保守的结构域，如 kinase-
1a 区（即 P-loop 区）、kinase-2 区、kinase-3a 区和
GLPL 区等。根据这些保守结构域设计特异性的简
并引物，以植物基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩
增，可得到抗病基因的同源序列（Resistance gene
analog，RGA）。
二穗短柄草基因组测序已经完成，而且可以作
为小麦的模式植物加以利用。通过比较基因组学可
为小麦的相关基因的克隆提供依据。本研究利用二
穗短柄草 NBS-LRR 类基因的同源序列设计简并引
物，从抗小麦赤霉病栽培品种苏麦 3 号、宁 7840 和
望水白基因组中克隆 NBS-LRR 类基因的同源序列，
旨在得到来源于赤霉病抗病品种中的抗病基因同源
序列，为抗病基因克隆以及利用基因工程提高小麦
抗病性提供帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
以 3 个高抗小麦赤霉病材料为试材，苏麦 3 号
为江苏省农科院太湖地区农科所通过阿夫 / 台湾小
麦杂交育成的品种，宁 7840 为江苏省农科院以阿芙
乐尔 / 苏麦 3 号 / 安农 11 为材料育成的小麦品种，
望水白为江苏溧阳地方品种。
1.2 方法
利用 CTAB 法提取苏麦 3 号、宁 7840 和望水白
3 个小麦抗赤霉病品种的基因组 DNA，利用二穗短
柄草 NBS-LRR 类抗病基因设计一对简并引物 NBSP，
如表 1 所示。PCR 扩增程序 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，
50℃ 1 min，72℃ 1 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，50℃
1 min，72℃ 1 min，28 个循环 ；72℃ 10 min。用 1%
琼脂糖凝胶进行电泳。
得到的电泳条带，胶回收后，用 pEasy-T1 载
体连接转化大肠杆菌，挑取单克隆送华大基因进行
测序。
对得到的核酸序列用 nucleotide blast 和 blastx 进
行比对分析，并用 ClustalX 和 Bioedit 软件进行聚类
分析。
提取小麦总 RNA，反转录 cDNA，对其中 5 条
序列设计特异引物，通过 PCR 验证表达情况，引物
序 列 分 别 为 Ning-1-b、Sumai-3-b、Sumai-4-b、Wsb-
2-b 和 Ning-13-b，如表 1 所示。
引物名称 正向引物序列（5-3） 反向引物序列（5-3）
NBSP GGNATGGGNGGNNTNGGNAARACNA NACYTTNAGNGCNAGNGGNAGNCC
Ning-1-b ATTTAGCAATGGTGCAGAGGAGC TCCCCCACATTTGTTGACAATACG
Sumai-3-b GAAGACAGATGGATGTGGGAGAA AAGACCCGCATTTACTGACAAT
Sumai-4-b ACTTGAAGAAAGAAATAAAGCGGAAGC CGGCGTGTCAAGTGAGCAACAGAA
Wsb-2-b TGCCAACCCATATTCATGCTCTG CACATTTCCTTGTAATCTTT
Ning-13-b TTTGGGCACCGAGTCACTGAGGA GTGGCATCCTCTATTTGTAGGTG
表 1 引物序列
2 结果
2.1 类RGA序列克隆及结构域分析
利用一对简并引物 NBSP，分别以苏麦 3 号、宁
7840 和望水白基因组 DNA 为模板，PCR 扩增，获
得的片段大小为 500 bp 左右（图 1），与设计引物预
期的扩增片段大小一致。目的片段经回收、连接克
隆载体和转化大肠杆菌，得到大量白斑重组子。各
随机挑选其中的 20 个共 60 个白斑重组子，摇菌，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期130
进行 PCR 检测，鉴定插入 T 载体中的片段及其长度。
结果获得了 43 个阳性重组子，苏麦 3 号的编号从 s-1
到 s-12，宁 7840 编号从 7-1 到 7-15，望水白的从 w-1
到 w-16，NCBI 登 录 号 ：JF957106-JF957135。 图 2
为部分重组质粒的 PCR 检测结果。
剩余的 32 条序列具有完整开放读码框和 NBS
功能域，而且最佳匹配序列均为 NBS-LRR 序列，初
步确认这 32 条序列为 RGA。经过 blast 比对分析这
些序列在 GenBank 中最匹配序列如表 3 所示，其他
序列与 RGAs 序列特征相差较远，故未予考虑。
通过 BLAST 比对发现，这些序列与已知的抗
病基因都有一定关联。对应匹配序列之间的同源
性 在 64%-98% 范 围 内， 这 些 序 列 之 间 的 同 源 性
为 38%-98%。 另 外， 39 条 RGA 序 列 中，7 条 与
HM124452.1 匹 配，10 条 与 AJ507094.1 匹 配，9 条
与 AJ507098.1 匹配，3 条与 HM124453.1 匹配。
2.3 氨基酸推导序列的聚类分析
用推导出的氨基酸序列在 pfm 网站进行功能域
分析，从结构上看 , 推导的氨基酸均具有 Kinase-1a
（GGVGKTT/GGVGKTA）、Kinase-2（KRFLIVLDDXW）
和 Kinase-3a（GSR/KILVTTR）及 GLPL 区（GLPLAL）
等保守区，这是 NBS-LRR 类 RGA 基因共有特征（图
3）, 据此可确定这 32 条序列均为 NBS-LRR 类抗病
基因同源序列。根据 N 端信号肽的不同，NBS-LRR
基因可分为 TIR-NBS-LRR 和 CC-NBS-LRR 两大类［6］。
NBS 的 Kinase-2 区的最后一个氨基酸可以用来区分
这两类抗病基因 ：当此位点的氨基酸是色氨酸（W）
时即归为 non-TIR 类 ；是天门冬氨酸（D）时则归为
TIR 类抗病基因，其准确度可达 95%［7］。我们获得
的 32 条小麦 RGA Kinase-2 区的最后一个氨基酸均
为 W（图 3），故对应的编码产物均为 non-TIR 型类
抗病相关蛋白，也证明作为单子叶植物的小麦和其
他单子叶植物一样，NBS 类 RGA 多属于 non-TIR 类。
在比较了 32 条推导出的编码氨基酸序列与其他
植物已知抗病基因 RGA 序列的同源性之后，对这些
氨基酸序列进行聚类分析。从图 4 可以看出，32 条
序列可分为 4 类，AlRPM1 在芥蓝头对白斑病菌的
抗性中起重要作用 , 拟南芥 RPP8 基因的表达可以增
强其对霜霉病的抗性，w-14、w-2、s-7、7-8 这些序
列所在的基因可归为此类。Pib 基因是水稻抗稻瘟病
基因、亚麻 L6 是抗亚麻锈病基因、PM3A 是小麦抗
白粉病基因，四大类序列均有同源的抗病基因，说
明在小麦中的这些 RGA 所在的基因功能不同，作用
方式可能与同源基因类似。另外，分析了 32 条序列
之间的关系，他们之间的同源性为 22%-99%，7-8
M.DL2000 DNA Marker ；1. 苏麦 3 号基因组 DNA 为模板 ；2. 宁麦 7840 基
因组 DNA 为模板 ；3. 望水白基因组 DNA 为模板
图 1 克隆 RGA 的 PCR 琼脂糖凝胶电泳图
2.2 核酸测序与氨基酸推导序列比对
对 43 个阳性克隆进行测序，其中 4 条未比对到
RGA 序列 ：3 条无 NBS-LRR 保守结构域，但可以比
对到小麦 3B 染色体上非编码区 ；另外一条最佳匹配
序列编码 ATP 依赖性 RNA 解旋酶。
将 39 条得到的序列在 ORF finder 中检查开放阅
读框（表 2），有 7 条虽然比对的最佳匹配序列是
RGA，但是对应的氨基酸存在一个或多个终止密码
子，如 7-6 序列有 18 个终止子，这些序列与其他植物
RGA 虽然存在高度同源性，但这些基因在编码区不
能编码完整多肽，认为它们是无功能序列或假基因。
M.DL2000 DNA Marker; 1-13. 重组质粒 PCR 检测
图 2 重组质粒 PCR 部分检测结果
表 2 存在终止密码子的序列分析
编号 终止密码子数 编号 终止密码子数
s-5 1 w-6 4
7-6 18 w-12 1
7-12 2 w-13 1
7-13 3
2012年第2期 131魏芳等 ：小麦抗赤霉病品种 NBS 同源序列克隆与分析
号序列虽然最佳匹配序列是小麦 ABA54554.2，但是
氨基酸同源性只有 79%，说明此序列存在于小麦其
他 RGA 基因中，w-14 与山羊草 CAC11106.1 对应序
列氨基酸同源性达到 99%，说明此序列所在基因可
能与 CAC11106.1 对应基因功能相似。
2.4 RGA核苷酸序列与最佳匹配基因序列差别比较
在分析过程中发现（图 5），s-3、s-5 与 7-12、
7-1、w-5、w-8 和 7-3 序列匹配一致性在 90% 以上，
与 HM124452.1 大麦 NBS3-RDG2A 高度同源，序列
间最大的差别在于第 148 与 149 位碱基之间多出 39
个核苷酸，在最佳匹配同源蛋白序列 ADK47521 中，
不存在此区段对应的编码序列。类似的情况还有，
在与大麦 AJ507098.1 匹配的序列中，s-4 和 s-1 与其
他序列在第 141-148 位碱基之间缺少 6 个核苷酸，
以及第 451 与 452 位碱基之间多出 6 个核苷酸。这
些差别碱基数目都是 3 的倍数，表现在氨基酸的编
码有所不同。
2.5 小麦RGA表达分析
根据 32 条 NBS 类 RGAs 相似性分析 , 对其中的
5 个 RGAs（7-1、s-3、s-4、w-2 和 7-13）设计基因特
异引物，以对应品种总 cDNA 为材料进行表达分析。
用 actin 引物扩增反转录得到的 cDNA 检测 cDNA 的
质量。然后用 5 对特异性引物进行 PCR 扩增和电泳
检测这些片段的表达情况。结果（图 6）显示，7-1、
s-3、s-4 和 w-2 均能表达，而 7-13 未检测到表达。
3 讨论
植物 R 基因在植物生长发育过程中起到重要
保护作用，随着功能基因研究的逐步深入，克隆植
物特异 R 基因并将其转入植物中已成为育种专家追
求的目标。抗病基因的克隆主要是通过转座子标记
技术和图位克隆技术获得的，如亚麻的 L6 基因［8］、
拟南芥 RPS2 基因［9］、番茄 MI-1 基因［10］等。转座
子标签技术是以合适的转座系统、成熟的根癌农杆
菌转化系统和有效的大规模突变体筛选手段为前提，
对于小麦等缺乏转座子突变体的高等植物很难应用
此方法。图位克隆技术的前提是有高密度的分子标
记连锁图谱，通过分子标记筛选获得大片段基因组
文库，找到包含目的基因的克隆，最后通过遗传转
组别 克隆序列 NCBI 中最匹配比对结果 核苷酸登录号 对应蛋白登录号
Ⅱ s-3, s-5, 7-1, 7-12, w-5, w-8, 7-3 Hordeum vulgare subsp. vulgare cultivar Thibaut RDG2A （Rdg2） gene, Rdg2-a allele, complete cds HM124452.1 ADK47521.1
Ⅲ s-8, 7-10, 7-11, 7-13, 7-14, w-4, w-6, w-15, w-16, 7-7
Hordeum vulgare mRNA for NBS-LRR disease resistance protein homologue
（rga S-9202 gene） AJ507094.1 CAD45030.1
Ⅳ s-4, s-11, 7-4, 7-9, 7-15, w-1, w-7, w-10, w-11
Hordeum vulgare mRNA for NBS-LRR disease resistance protein homologue
（rga S-L8 gene） AJ507098.1 CAD45034.1
Ⅱ s-12, 7-2, w-9, w-13 Hordeum vulgare subsp. vulgare cultivar Mirco NBS1-RDG2A （nbs1-rdg2a） pseudogene, complete sequence HM124453.1 ADK47523.1
Ⅱ s-2 Triticum aestivum NBS-LRR type resistance protein RGA-A mRNA, partial cds HQ702206.1 ADU05411.1
Ⅰ s-7 Lolium perenne clone PRA7 resistance protein gene, partial cds AY923216.1 AAX19067.1
Ⅰ w-14 Aegilops ventricosa partial rae7 gene for resistance gene alike AJ249949.1 CAC11106.1
Ⅳ w-3 Hordeum vulgare partial rga S-L8 gene for NBS-LRR disease resistance protein homologue AJ506140.1 CAD44596.1
Ⅰ 7-8 Triticum aestivum disease resistance protein mRNA, complete cds DQ205351.2 ABA54554.2
Ⅲ 7-6 Hordeum vulgare partial rga S-9202 gene for NBS-LRR disease resistance protein homologue AJ506137.1 CAD44593.1
Ⅱ 7-5 Hordeum vulgare NBS-LRR type resistance protein （b9） gene, partial cds AF032687.1 AAB96984.1
Ⅱ w-12 putative blight resistance protein ［Oryza sativa japonica Group］ AP003269.2 BAD87306.1
Ⅰ w-2 disease resistance protein ［Triticum aestivum］ DQ205351.2 ABA54554.2
s-1, s-6 Triticum turgidum cultivar Langdon clone BAC 1156G16, complete sequence AY663391.1
s-10 Triticum aestivum chromosome 3B-specific BAC library, contig ctg0091b FN564428.1
s-9 Toxoplasma gondii ME49 ATP-dependent RNA helicase, putative, mRNA XM_002368170.1
表 3 RGA 根据在 DNA 数据库中最匹配序列分组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期132
化或基因敲除等方法鉴定并获得目的基因，但是对
于像小麦这样基因组庞大（1.6×1010 bp）、重复序列
多（>75%）的高等植物也存在较大难度。因此至今
为止，利用转座子标签和图位克隆技术虽然已从多
种作物中克隆了几十个不同的植物抗病基因，但相
对于众多的致病菌及其生理小种来说仍远远不够，
为了提高植物的抗病性必须采取多个策略和方法以
克隆更多的抗病基因。近年来，应用同源克隆的方
法已经分别从小麦、水稻、大麦、大豆、菜豆、拟
南芥、马铃薯、番茄、辣椒和柑橘等植物中扩增出
了抗病基因的同源序列，其中有些 RGA 已经得到成
功的应用，实践证明，这一方法在克隆小麦相关抗
病基因方面是可行的［11-15］。本研究共得到 32 条可
用 RGA 序列，可作为抗小麦赤霉病的候选基因作进
一步研究。
植物 NBS 类抗病基因存在着高度的保守性 , 本
研究根据二穗短柄草的 NBS 类抗病基因保守结构域
设计简并引物对 3 个小麦赤霉病抗源进行 RGA 的克
隆。 通过 PCR 扩增，得到 43 条序列，其中 4 条为
非编码序列或者结构域不完整 ；39 条与植物抗病基
因同源，其中的 7 条内部存在终止密码子，可能是
假基因，经过比对分析，其余 32 条具有连续的开
放阅读框和保守结构域，推导的氨基酸序列均具有
Kinase-1a、Kinase-2 和 Kinase-3a 及 GLPL 区等几个
图 3 抗病基因同源氨基酸序列比对和保守结构域分析
2012年第2期 133魏芳等 ：小麦抗赤霉病品种 NBS 同源序列克隆与分析
AlPM1（AF122982.1），AtRPM1（CAA61131），RcRPP8（XP_002528440.1），AtRPP8（BAA97426.1），AtRPP13（AAS93958.1），SbRpi（ACU65457.1），
SlPRP（AAC67237.1），OsXal1（BAD31282.1），TaPM3A（AAY21626.1），LuM（AAB47618.1），LuL6（AAA91022.1），AtRPS2（AAA21874），OsPib（BAA76282.2）
图 4 小麦 RGA 与已知植物 R 基因相应氨基酸序列聚类树状图
A. 最佳匹配序列为 HM124452.1 的几个序列部分差别区段比较 ；B. 最佳匹配序列为 AJ507098.1 的几个序列部分差别区段比较
图 5 同源序列比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期134
保守区，在 GenBank 中均能找到与之高度同源的其
他物种的核酸序列，并且 Kinase-2 的最后一个氨基
酸均为色氨酸（W），属于 non-TIR 类 NBS 基因。32
条序列可以分为四大类，它们之间核苷酸同源性为
64%-98%，编码氨基酸同源性为 22%-98%，根据这
些序列对应匹配的基因，我们认为序列的丰富度不
同。根据序列分析随机设计 5 对不同基因特异性引
物，并利用 RT-PCR 技术进行表达分析，结果表明 7-1、
s-3、s-4 和 w-2 均能表达 , 说明这些片段可能是功能
性抗病基因的部分序列，7-13 不表达，再次证明属
于假基因。
Muharren 等［16,17］利用多种植物 R 基因的保守
区设计引物得到新的 NBS-LRR 类序列 20 条，同时
得到 NB 类激酶序列 42 条，本研究中利用特定物种
二穗短柄草的多个 NBS 类基因设计简并引物增加
了得到该类序列的特异性，结果中发现无其他 NB
类激酶的干扰。在小麦中已经有研究人员获得一批
RGA 抗病序列，Bozkurt 等［18］ 从几个小麦六倍体
栽培品种和几个野生品种中得到 40 条 NBS-LRR 类
RGA。利用 3 个小麦抗赤霉病的抗源来克隆 NBS-
LRR 类 RGA，不同的基因型由于基因表达不同，造
成表型不同，所选择的 3 个有抗赤霉病表型的小麦
品种是得到具有抗赤霉病相关功能基因的前提。研
究发现，拟南芥中有 149 个 NBS-LRR 类基因，12
条 是 假 基 因［19］；水 稻 中 发 现 存 在 约 500 个 NBS-
LRR 基因，其中超过 100 条被认为是假基因［20］。水
稻基因组大小是拟南芥的 3.7 倍，如果 NBS-LRR 类
基因数量与基因组大小正相关，小麦基因组是水稻
的 40 倍，推测小麦 NBS-LRR 类基因总数量超过上
千条，而且有众多的不表达基因。目前已经登录的
NBS-LLR 类 型 的 序 列 有 近 200 条（http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/sites/entrez）， 在 此 基 础 上 已 经 有 一 些
NBS-LRR 类基因得到全长，如抗条锈病基因 Yr10
（AF149114.1）、叶锈病基因 Lr21（ADK32525.1）和
Lr1（ABS29034）以及白粉病抗病基因（AAQ96158.1）
等。本研究克隆的这些序列丰富了小麦 RGA 的数量，
为发现新的 RGA 基因提供资源，并且对下一步克隆
抗赤霉病基因全长提供依据。
4 结论
本研究从小麦抗赤霉病品种苏麦 3 号、望水白
和宁 7840 基因组 DNA 中，通过 PCR 扩增，得到 43
条序列，初步判定其中 32 条为 RGA，这些序列丰
富了小麦 RGA 的数量，为发现新的 RGA 基因提供
资源。
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（责任编辑 马鑫）