全 文 ：植物在生长发育过程中均会受到病虫不同程度
的侵害，其中包括细菌、真菌、病毒、线虫、螨虫和昆
虫。在与有害生物的长期抗争中，植物逐渐进化出了
一系列复杂的防御机制来保护自己， 一类是依靠简
单的物理屏障和化学反应，另一类则是基于 1971年
Flor 提出的“基因对基因假说”，在植物和侵染病原
物之间产生复杂的生化反应，其中植物抗病基因（R
基因） 在识别病原物无毒基因 Avr产生的蛋白效应
子中起重要作用[1]。 自从 1992年 Johal等[2]克隆得到
第一个抗病基因——玉米抗圆斑病基因 Hm1 后，目
前人们已经从植物中克隆得到 100 多个抗病基
因 [3]。 基于抗病基因中功能保守结构域，可从广义上
将植物抗病基因至少分为 5 类：第 1 类以玉米 HM1
基因为代表，编码 HC-毒素还原酶，目前只有 HM1
基因 1 个；第 2 类为 NBS-LRR 类，占 R 基因总数的
72%；第 3 类以番茄 Pto 基因为代表，编码 STK 蛋白
激酶结构域，占 R 基因总数的 3%；第 4 类以 Xa21
为代表， 编码胞外 LRR 和一个胞内激酶结构域，占
R基因总数的 3%；第 5 类以番茄 Cf 基因为代表，编
码一个胞外的 TM-LRR和一个胞内的 STK 激酶，占
中 国 瓜 菜 专题综述2014，27（3）： 1-4，9
RGA法克隆 NBS-LRR类抗病基因同源序列
及其在葫芦科作物上应用的研究进展
薛莹莹 1，2，孙守如 1，孙德玺 2，邓 云 2，朱迎春 2，刘君璞 2
（1. 河南农业大学园艺学院 郑州 450002； 2. 中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009）
摘 要： RGA克隆法是利用抗病基因产物的保守结构域人工设计简并引物，以植物 gDNA 或 cDNA 为模板进行
PCR 扩增而克隆植物抗病基因同源序列的方法。 随着各种植物基因组测序计划的完成及计算机和生物信息学的发
展，植物抗病基因的克隆取得了很大进展，目前人们已经从植物中克隆得到 100 多个抗病基因。 研究表明，大多数抗
病基因都存在 NBS-LRR、STK、LZ、TIR 等功能保守的结构域，其中大部分都为 NBS-LRR 类型，利用 NBS-LRR 保守
结构域设计 PCR 引物已经从植物中扩增出大量的 RGA。 简要综述了已克隆 NBS-LRR类抗病基因的结构特点和功
能、RGA法克隆 NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展，并探讨其未来的发展与应用。
关键词： RGA； NBS-LRR； 抗病基因； 西瓜； 甜瓜； 黄瓜
Cloning of NBS-LRR-encoding Resistance Gene Analogues Using RGA
Approach and the Advance in Cucurbit Crops
XUE Ying-ying1，2， SUN Shou-ru1， SUN De-xi2， DENG Yun2， ZHU Ying-chun2， LIU Jun-pu2
（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002， China; 2. Zhengzhou Fruit Research Institute，
CAAS， Zhengzhou， Henan 450009， China）
Abstracts： As majority resistance genes encode a highly conserved protein domain，RGA approach is a method of using the
conserved protein domain design degenerate primers to clone resistance gene analogs from plant gDNA or cDNA. With the
assembling of genome sequence in various plant species and the development of bioinformatics，the cloning of plant disease
resistance genes have made great progress，more than 100 resistance genes have been cloned. Related studies showed that
majority of plant disease resistance genes encode a conserved NBS-LRR，STK，LZ，TIR functional structure and majority of
them belonging to NBS-LRR class. Using conserved NBS-LRR-encoding domain to design degenerate primer has amplified
a number of RGA. In this article，the structure characteristics and function of NBS-LRR-encoding resistance genes and the
advance in cloning NBS-LRR-encoding resistance genes using RGA approach and application in cucurbit crops has been
reviewed and its future development and application has also been discussed.
Key words： RGA； NBS-LRR； Resistance gene；Watermelon； Melon； Cucumber
收稿日期： 2014-03-28； 修回日期： 2014-04-10
基金项目： 国家西甜瓜产业技术体系项目（CARS-26-14）； 中国农业科学院基本科研业务费（0032012024）
作者简介： 薛莹莹，女，在读硕士研究生，研究方向为蔬菜遗传育种与分子生物学。 电话： 15824893361； 电子信箱： henauxyy@126.com
通信作者： 刘君璞，男，研究员，主要从事西瓜遗传育种及栽培技术研究。 电子信箱：liujunpu@caas.cn
· ·1
试验研究 中 国 瓜 菜 27 卷专题综述
R基因总数的 11%。 除第 1类外的 R基因编码均可
识别病原物 Avr基因产生的蛋白受体，符合“基因对
基因假说”， 还有一些其他类抗病基因占 R 基因总
数的 11%[4]。 可见 NBS-LRR 类抗病基因在植物 R
基因中占有重要地位，因此，植物 NBS-LRR 类抗病
基因的克隆对植物抗病机制的研究、植物基因工程
改良及抗病品种的选育等方面具有重要意义。
1 NBS-LRR 类植物抗病基因编码蛋
白的结构特点和功能
R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成
部分， 在目前已经发现的植物抗病基因中，NBS-
LRR 类占了绝大多数，且进化程度很高，被推测存
在于细胞质中。 该类抗病基因所编码蛋白的结构特
点是具有核苷酸结合位点 （NBS）、 富亮氨酸重复
（LRR） 和 N 端的一些结构域， 根据 N 端结构的不
同，又可以将 NBS-LRR基因分为 TIR-NBS-LRR和
non-TIR-NBS-LRR 两大类，简称 TNL 和 non-TNL，
其中 TIR 为果蝇 Toll 蛋白及哺乳动物白细胞介素-
1 受体的胞外相似区域，non-TNL 主要是在 N 端含
有一个 CC 卷曲螺旋结构。 Van der Biezen 等 [5]在
1998 年提出 NB-ARC 结构域是一种植物抗病基因
产物和动物细胞死亡调控子所共有的新的信号基
序，并且可能揭示了在植物、线虫和哺乳动物中细胞
程序性死亡调控核心的某些保守性。
NBS 结构域是 NBS-LRR 基因编码蛋白中最保
守的部分，含有 8 个保守基序，包括 P-loop（又称
Kinase-1a）、Kinase-2a、Kinase-3a 和 GLPL 疏水结
构域等。其中 P-loop用于结合 ATP或 GTP的磷酸，
其共有序列为 GM （G/P）G （I/L/V）GKTTLA（Q/R）；
Kinase-2a 的特点是 4 个疏水氨基酸残基后紧跟 1
个不变的带负电荷的天冬氨酸，但在植物中，这一区
域的两端还具有高度保守的氨基酸， 共有序列为 K
（R/K）x LLVLDDV （W/D）， 参与磷酸转移反应；Ki-
nase-3a 保守区含有一个酪氨酸（Y）或精氨酸（R）残
基，参与结合嘌呤或核糖；GLPL 疏水结构域的共有
序列为 GGLPL （A/G）LK [6]。 NBS 结构域能够结合
ATP 或 GTP， 在植物抗病的过敏性反应生理过程
中，可能参与抗病信号的传导。 NBS 存在于真核生
物的许多蛋白中，如 ATPase、延伸因子异质三聚体、
GTP结合蛋白、R基因编码蛋白等，这些蛋白对于细
胞的生长、分化、细胞骨架的形成、小泡运输和防御
反应都起关键性的作用[7]。
LRR 是一段连续且重复的富含亮氨酸的氨基
酸序列，胞内的 LRR 结构模式不很规则，多样性较
高，基本骨架模型为 LxxLxxLxxLxLxxxx（x 为不确定
的氨基酸），空间结构由 α 螺旋和 β 折叠构成，有利
于和其他分子紧密结合， 被认为在病原体识别上起
作用。 Hwang 等[8]对番茄抗线虫基因 Mi-1.2 和其横
向同源基因 Mi-1.1的研究表明，LRR不仅在病原体
识别上起作用，在下游信号传导中也起作用。
2 RGA法克隆 NBS-LRR类抗病基因
的研究进展
RGA 法又称为同源序列克隆法，其原理是利用
抗病基因蛋白产物的保守结构域， 人工设计简并引
物， 以植物 gDNA 或 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，
得到植物的抗病基因同源序列 （resistance gene
analogs， RGA）。 自 1996 年在 PNAS 上连续两篇关
于用抗病基因产物的保守序列为引物来扩增 RGA
的文章发表以来， 人们已经从多种植物中扩增到抗
病基因同源序列[9]。 RGA既可以是一种 DNA分子标
记，也可以是植物本身所携带的抗病基因，在植物中
普遍存在， 多以成簇的方式随机分布于植物基因组
中。 它与 R基因之间存在 3种关系：第一，与已知抗
病基因具有很高的相似性或为抗病基因的一部分；
第二，与已知抗病基因连锁或为抗性基因家族成员；
第三，与抗病基因无关，只是序列上存在相似性。 所
以 RGA与植物抗病基因仍然有较大区别，但它们均
含有抗病基因编码蛋白的保守结构域，最有可能参
与植物抗病反应过程，可作为候补抗性基因，再通过
与已知的遗传图谱进行分析比较，就可以确定它们
与已知抗病基因的关系或克隆出新的抗病基因。 这
一方法已经成为分离克隆和寻找新的抗病基因的最
简捷、最经济和最有效的途径[9-10]。
自从 1996 年 Kanazin 等[11]和 Yu 等 [12] 分别利用
NBS-TM 和 NBS 保守结构域设计引物从大豆基因
组中获得 RGA以来，抗病基因同源序列克隆法已得
到广泛应用，现已从水稻 [13]、玉米[14]、大麦[15]、小麦 [16]、
拟南芥 [17]、番石榴 [18]、菜豆 [19]、丝瓜 [20]、花生 [21]、芒果 [22]
等多种植物中扩增出抗病基因同源序列。 Okuyama
等 [23]从水稻的 12 条 NBS-LRR 类 RGA 中筛选得到
抗稻瘟病基因 Pia，且稻瘟病菌中含有 AVR-Pia 无
毒基因，符合“基因对基因”假说。 Calenge 等[24]利用
苹果中高度保守的 NBS 结构域内的 P-loop 基序设
计简并引物，最终得到 43条分子标记，其中 23条为
RGA分子标记，25 条分子标记与抗病基因主效基因
或者 QTL 紧密连锁。 Perazzolli 等 [25]在 2014 年从苹
· ·2
专题综述薛莹莹等： RGA 法克隆 NBS-LRR 类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展3 期
果中分离得到 868 条 RGA 并研究了它们在蔷薇科
中的进化史。 Hunger等[26]利用抗病基因保守序列设
计简并引物从甜菜中扩增得到 47条 RGA并对其进
行了连锁性分析， 其中 21条为NBS-LRR 类抗病基
因同源序列。Tian等[27]也根据 NBS-LRR 保守结构域
设计简并引物扩增甜菜RGA， 结果表明甜菜基因组
中可能缺失 TIR 类型的 RGA。 安然等 [28] 以柑橘的
gDNA为模板，根据 NBS-LRR 保守结构域设计简并
引物， 从对柑橘溃疡病菌表现不同抗性的 6个柑橘
品种中扩增得到 9 条 RGA， 并对其进行了分析和
Sourthern 鉴定，为定位、克隆柑橘抗病基因及利用
分子标记辅助选择育种提供了研究基础。 Rout 等[29]
利用 NBS-LRR 抗性基因编码蛋白中的 NBS保守结
构域设计简并引物，从抗 FBR（洋葱干腐病）的大蒜
材料中分离到 28 条 RGA，qRT-PCR 分析它们在
根、茎、叶中的表达水平，结果显示其中一条命名为
AsRGA29 的 RGA 受 FOC 侵染后表达量显著上调，
进一步研究表明，在 SA、MeJa、H2O2 和 ABA 四种防
御信号分子处理下也得到相同结果。 该研究虽然没
有得到 FBR 抗病基因， 但是为今后研究与 FBR 抗
病基因连锁的 RGA分子标记奠定了基础。目前成功
的案例有 Paal 等 [30] 以马铃薯 NBS 同源序列 St332
为探针最终克隆得到抗马铃薯金线虫 Gro1-4基因，
Chen 等 [31]以茄科植物抗病基因保守结构域设计简
并引物并结合 RACE 技术从辣椒中克隆得到根结
线虫抗病基因 CaMi。
3 NBS-LRR类 RGA在葫芦科作物中
的研究进展
葫芦科作物中的西瓜、 甜瓜和黄瓜是我国重要
的经济作物。 丁国华等[32]利用简并引物从黄瓜基因
组 DNA 中分离得到 15 条 NBS 类 RGA，其中 10 条
为可通读序列，且与已报道的甜瓜 RGA有较高同源
性。Huang等[33] 2009年公布了黄瓜基因组序列，分析
发现黄瓜中仅有 61 条 NBS 类抗病基因， 在数量上
和番木瓜中 55 条 NBS 类抗病基因相近， 但是远低
于拟南芥（200 条）、白杨（398 条）和水稻（600 条）中
NBS类抗病基因的数量。 Harris等[34]根据 NBS-LRR
抗病基因家族中的 NBS 保守结构设计简并引物，从
西瓜材料‘Calhoun Gray’、‘PI296341’和‘PI595203’
中克隆得到 66 条 RGA 片段， 测序结果显示这些
WRGA 含有 NBS-LRR 抗病基因保守结构基序，聚
类分析将 WRGA 分为 8 组分别包含 TNL 和 non-
TNL 类型， 其中 WRGA1、WRGA7 和 WRGA147 被
定位于第 13 连锁群 8 cM的区域内， 因为它们分属
于不同的 TNL 类抗病基因同源序列，却被定位在同
一连锁群上，表明该区域上很可能存在抗病基因，有
待于进一步研究。 Guo等[35]以西瓜材料‘PI97103’构
建西瓜基因组图谱，在西瓜基因组中仅发现 44 条
NBS-LRR 基因，远低于水稻、苹果和玉米中 NBS-
LRR 基因的数量。 Brotman 等 [36]根据已知抗病基因
设计简并引物从甜瓜中分离得到 15 条 NBS-LRR
基因家族的同源序列，其中几条 NBS-LRR 相关序
列定位于抗番木瓜环斑病毒病、抗枯萎病 Fom-1 和
Fom-2、抗蚜虫基因位点附近，为甜瓜抗病育种分子
标记的应用和 R 基因的克隆奠定了基础。 Garcia-
Mas 等 [37] 2012 年公布了甜瓜双单倍体 DHL92 的基
因组序列，其中细胞质 NBS 类抗病基因总数量为
81 个，而同类别的抗病基因在拟南芥、葡萄和水稻
中的总数量分别是 212、302 和 548 个，这些数据显
示 NBS-LRR 类基因数目在植物中并不保守，而且
在甜瓜属中的数值更低，可能该类物种中 NBS-LRR
类基因发生了相似的进化。 Wan 等[38]比较了葫芦科
作物 NBS 类抗病基因同源序列的系统进化关系，系
统发生分析显示，基因复制、序列差异和基因缺失是
葫芦科植物NBS类基因进化的三大主要模式。
4 存在问题及展望
自从 1996 年 RGA 法出现以来，人们已经从多
种植物中克隆得到抗病基因同源序列，但是成功得
到植物抗病基因的例子却不多，因为 RGA并不等同
于抗病基因，可能是 R 基因的一部分或者与之连
锁，也可能与 R 基因没有关系。 其中，Paal 等 [30]和
Chen 等[31]分别成功克隆得到了马铃薯 Gro1-4 和辣
椒 CaMi 抗病基因，这 2 个基因均存在于茄科植物，
且简并引物的设计模板也是源自茄科植物。 这可能
说明 2 个问题：第一，茄科植物内 NBS 类抗病基因
保守性较高；第二，同一科属内植物间的 NBS 类抗
病基因保守性较高。 虽然 NBS-LRR 类抗病基因存
在保守结构域，但是不同种属之间仍然有较大的序
列差异，在利用 RGA法克隆抗病基因时应当引起注
意。
葫芦科作物黄瓜、西瓜和甜瓜基因组测序已经
完成，这 3 种植物内的 NBS-LRR 类抗病基因也逐
渐呈现在人们面前。 研究表明，黄瓜、西瓜和甜瓜基
因组中 NBS-LRR 类抗病基因数量相对比拟南芥、
水稻等植物都显示较低水平，可能是植物本身NBS-
LRR 类抗病基因在进化过程中缺失，也可能是还有
· ·3
试验研究 中 国 瓜 菜 27 卷专题综述
部分 NBS-LRR类抗病基因人们尚未发现。 Jupe[39]在
2013 年应用 RenSeq 方法 （RenSeq： Resistance gene
enrichment and sequencing method， 抗性基因富集测
序法） 成功在已经完成了基因组测序和分析的马铃
薯中将 NBS-LRR数量从 438条增加到755 条，可能
将来也会应用到葫芦科植物抗病基因的克隆中，为
发现新的葫芦科植物抗病基因提供技术支持。
随着计算机技术和生物信息学的快速发展，越
来越多的植物基因组序列将会呈现在人们面前，在
今后的研究中势必要求我们开发更高效的技术手段
发现新的抗病基因， 同时， 结合先进的基因芯片、
RenSeq 等技术，优化 RGA 的分离方法，并运用生物
信息学快速识别、比较更多的 RGA，预测其中的基
因结构及功能，从而为后续研究奠定基础。
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