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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):193-199
毕赤酵母表达系统作为目前应用广泛的真核表
达系统，已有约 500 种外源蛋白获得成功表达，毕
赤酵母工业化生产中通常进行高密度发酵，细胞密
度随着发酵时间的延长不断增加，氧气在发酵液中
的溶解度和传质效率逐步降低，使得溶氧控制成为
影响毕赤酵母高表达目的蛋白的重要因素，而用于
通气和搅拌的能耗已占毕赤酵母发酵成本的 50% 以
上，又使得该工程菌发酵成为高能耗项目。通常在
收稿日期 ：2015-04-23
基金项目 ：山东省轻工生物基产品清洁生产与炼制协同创新中心项目（03082001）
作者简介 ：张晓龙，男，硕士研究生，专业方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：qingshuang0302@163.com
通讯作者 ：肖静，女，博士，副教授、研究生导师，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：xiaojing8168@163.com
共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产 β-甘露聚糖酶
发酵过程的影响
张晓龙1  肖静1  王瑞明1  汪俊卿1  王兴吉2  王正祥3 
（1. 齐鲁工业大学生物工程学院 山东省微生物重点实验室，济南 250353 ；2. 山东隆利特酶制剂有限公司，临沂 276000 ；
3. 天津科技大学，天津 300222）
摘 要 ： 为了改善高密度发酵生产 β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制，提高 β-甘露聚糖酶产量，将 VHb 和 β-甘露聚糖酶基因
置于 AOX1 启动子调控之下，进行 VHb 和 β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成 VHb 基因，插入表达载体
pPICZαA，整合到 β-甘露聚糖酶工程菌中，通过 G418 和 Zeocin 抗性筛选共表达 VHb 基因的重组酵母工程菌。在 30 L 发酵罐水平
上分析共表达 VHb 菌株（VHb+）与初始菌株（VHb-）对 β-甘露聚糖酶表达的差异。结果显示，限氧条件下，VHb+ 菌株的 β-甘露
聚糖酶的表达量比对照菌株 VH b- 高 90%，且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性，缩短发酵周期约 40 h。
关键词 ： 透明颤菌血红蛋白 ；β-甘露聚糖酶 ；毕赤酵母 ；高密度发酵表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.028
Effect of Co-expression of Vitreoscilla Hemoglobin on Expression of
β-mannanase in Pichia pastoris
Zhang Xiaolong1 Xiao Jing1 Wang Ruiming1 Wang Junqing1 Wang Xingji2 Wang Zhengxiang3
（1. Institute of Biological Engineering of Qilu University of Technology，Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering，Jinan
250353，2. Linyi Longkete Enzyme Preparation Co. Ltd，Linyi 276000，3. Tianjin University of Science and Technology，
Tianjin 300222）
Abstract: In order to improve the limitation of dissolved oxygen and increase β-mannanase production in the process of high-density
fermentation, the β-mannanase gene and Vitreoscilla hemoglobin gene（VHb）were co-expressed in Pichia pastoris under the control of
AOX1 promoter. The VHb gene was synthesized by codon optimization and inserted into expression vector pPICZαA, then integrated into the
engineering bacterium of β-mannanase gene, P. pastoris GS115/Ppic9K-β-MAN. The recombinant P. pastoris of co-expressing VHb was selected
by G418 and Zeocin resistance screening. Finally, the discrepancies in β-mannanase expression between the co-expressed strain VHb+ and initial
strain VHb- were analyzed in 30 L fermenter. The results showed as below, compared with the controlled strain, the expression of β-mannanase
by VHb+ strain was increased by 90% under oxygen-limited condition. Furthermore, Vitreoscilla hemoglobin was improved on the methanol
tolerance, and fermentation period was shorted about 40 h, which could be an important industrial value.
Key words: Vitreoscilla hemoglobin ；β-mannanase ；Pichia pastoris ；high-density fermentation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12194
工业化生产中，通过改善发酵罐通气管道设计、罐
压以及通纯氧来提高溶氧量，但现有工艺极限供氧
传输速率约为 500 mmol/（L·h），难以满足毕赤酵
母高达 2 000 mmol/（L·h）的需氧量［1］。另一方面，
虽然较低的甲醇流加速率（5 mL/（L·h））可以降低
需氧量，但过长的发酵周期（150 h 以上）又极大的
增加了发酵成本。
透 明 颤 菌 血 红 蛋 白（Vitreoscilla hemoglobin，
VHb）是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌在低氧
环境中产生的一种分子量约为 15.8 kD 的可溶性蛋
白，具有较高的氧吸附和解离速率常数［2］。在毕赤
酵母中共表达目的蛋白和 VHb 是改善高密度发酵过
程中溶氧限制的一种有效方式，已在多种宿主中成
功表达，提高代谢物产率［3］。同时，有研究表明，
VHb 在毕赤酵母中的表达不仅能提高氧的利用率和
S-腺苷甲硫氨酸的产率，还能促进 ATP 合成，增强
甲醇代谢活性［4］。VHb 基因在各种表达系统中均有
重要应用，如在大肠杆菌中，Khosravi 等［5］发现将
VHb 基因在大肠杆菌中共表达时，可使细胞密度提
高 1.4 倍，α-淀粉酶的产量提高 3.3 倍 ；在酵母表达
系统中，1944 年 Wilfred 等在 Biotechnical Prog 上发
表了 VHb 在酵母中的应用研究结果，并进一步研究
了它对好样代谢的影响，并证明 VHb 在酵母中主要
存在于细胞质中 ；在毕赤酵母中应用尤其广泛。王
清路等［6］在毕赤酵母中以 Ppic9K 为研究对象，转
化 GS115 后，经发酵验证在贫氧条件下可以明显促
进酵母菌体生长和目的基因的分泌表达 ；在霉菌中，
李兵等［7］ 将 VHb 基因构建至表达载体 pMK4-LV，
并转化产黄青霉的原生质体，获得转化子后发酵表
明，VHb 的表达使得生物量提高 9.76%，青霉素的
产量提高 9.68%。
β-甘露聚糖酶可降解饲料中含有的甘露聚糖，
有助于解除甘露聚糖对机体胰岛素分泌和胰岛素
样生长因子生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收效
率，是一种优良的饲料添加［8］。本课题组前期通
过筛选高表达基因以及工程菌构建，优化发酵条件
等方法，使 β-甘露聚糖酶在 30 L 发酵罐水平达到
29 600 U/mL，达到工业化生产要求。但为从根源解
决毕赤酵母发酵工业生产中溶氧限制、发酵周期长
等问题，本实验将经密码子优化后的透明颤菌血红
蛋白基因（VHb）导入 β-甘露聚糖酶毕赤酵母工程
菌中，使 VHb 和 β-甘露聚糖酶都在 AOX1 启动子下
表达，并通过 30 L 发酵罐高密度发酵，讨论限氧条
件下共表达 VHb 蛋白对毕赤酵母产 β-甘露聚糖酶的
影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 β-甘露聚糖酶表达菌株 Pichia
pastoris GS115/Ppic9K-β-MAN、大肠杆菌（Escherichia
coli）DH5α 和 质 粒 pPICZαA 均 由 本 实 验 室 保 存，
VHb 基因以及相关引物由上海生工生物工程有限公
司合成。
1.1.2 主 要 试 剂 限 制 性 内 切 酶 Asu Ⅱ、Not Ⅰ、
Sac Ⅰ、T4 DNA 连接酶等均购自宝生物工程（大连）
有限公司 ；G418 和 Zeocin 购自上海生工生物工程有
限公司 ；蛋白分子量标准购自赛默飞世尔科技公司，
核酸分子量标准、EasyPfu DNA Polymerase、酵母基
因组提取试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、纯化试剂
盒等购自北京全式金生物技术有限公司 ；其余试剂
均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 LB 培养基 ：氯化钠 10 g/L、胰蛋白
胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L ；YPD 培养基 ：葡萄糖
20 g/L、蛋白胨 20 g/L、酵母提取物 10 g/L ；发酵基
础培养基 ：葡萄糖 2.5%、KH2PO4 5 g/L、CaSO4 3 g/L、
K2SO4 15 g/L、MgSO4 15 g/L、NH4H2PO4 35 g/L、KOH 4.2
g/L、12 mL/L 微量元素 ；分批补料培养基 ：50% 甘油
（W/V）（含 12 mL/L 微量元素）；诱导剂 ：100% 甲醇
（ 含 12 mL/L 微 量 元 素 ）；补 料 培 养 基 ：NH4H2PO4
200 g、CaSO4 20 g、K2SO4100 g、MgSO4 100 g，定容
至 2 L ；微量元素溶液 ：参照 Invitrogen 表达手册。
1.2 方法
1.2.1 VHb 密码子优化与引物设计 根据已经报道
的 VHb 蛋白的氨基酸序列（GenBank ：AF274976），
VHb 蛋 白 共 有 441 bp， 编 码 147 个 氨 基 酸， 结 合
毕赤酵母密码子的偏爱性，使用 CodonW 软件包和
RNAstructure 分析基因序列，进行密码子优化。密
码子优化后的 VHb 基因提交 NCBI 数据库（登录号：
KM108313）。
使用 Primer Premier 5、Oligo7.0 软件进行引物
2015,31(12) 195张晓龙等：共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产 β-甘露聚糖酶发酵过程的影响
设计、分析，设计引物 ：
F1：5-AGTTCGAAACGATGTTGGACCAG-3（引
入 Asu Ⅱ酶切位点），
F2 ：5-TAAAGCGGCCGCCTACTCAACAGCCT
GG-3（引入 Not Ⅰ酶切位点）。
1.2.2 重组质粒的构建与转化 以上海生工生物工
程有限公司合成基因序列为模板，F1 与 F2 为引物，
进行目的片段的 PCR 扩增。基因扩增条件为 ：94℃
预 变 性 5 min，94℃ 30 s，54℃ 退 火 30 s，72℃ 延
伸 3 min，循环 30 次，72℃后延伸 10 min。将 PCR
扩增得到的目的片段纯化、双酶切，并与经过同样
双酶切处理表达载体 pPICZαA 连接，转化感受态
大肠 DH5α，利用 Zeocin（100 μg/mL）筛选抗性菌
落，PCR 鉴定重组质粒，且送交上海生工生物工程
有限公司测序，测序正确后得到重组质粒 pPICZαA
-VHb。重组质粒别分经 Sac Ⅰ线性化后，电击转化
至 GM115 中。
1.2.3 重组菌株的筛选和摇瓶复筛 将电击转化产
物涂布于含 100、200、300 μg/mL 的 Zeocin 梯度 YPD
平板（且含 500 μg/mL 的 G418），30℃培养 3-4 d，至
菌落出现。原始菌株为非 Zeocin 抗性，只有重组质
粒 pPICZαA -VHb 整合入 GM115 基因组中，才能在
含有 Zeocin 和 G418 的抗性 YPD 平板上生长。从平
板上挑取重组工程菌，使用 TaKaRa 的 lysis buffer 提
取酵母基因组，以 F1、F2 为引物进行菌落 PCR，条
件为：94℃预变性 10 min，94℃ 30 s，54℃退火 30 s，
72℃延伸 3 min，循环 30 次，72℃后延伸 10 min。
挑 取 经 PCR 验 证 正 确 的 重 组 菌 株， 接 种 至
YPD 液体摇瓶培养基中，30℃、240 r/min，培养至
OD600≈8.0，按 10% 接种量接入发酵基础培养基中，
28℃，240 r/min 培养 24-30 h，初始碳源耗尽后，补
充 1 mL 50% 甘油，甘油耗尽后饥饿培养 0.5 h，每
24 h 补充 100% 甲醇 1.5 mL，发酵 120 h，取上清测
定 β-甘露聚糖酶酶活力，筛选高表达菌株进行 30 L
发酵罐放大实验。
1.2.4 30 L 发酵罐放大试验 发酵罐装液量 60%，
控制 pH5.5，YPD 种子罐移种后，调节转速 400 r/min、
温度 30℃、空气流量 1 m3/h、罐压 0.05 MPa，进行
分批发酵，基础培养基中碳源耗尽后，DO 值急速上
升，此时以 15 mL/（L·h）速度流加 50% 甘油（W/V，
含 12 mL/L 的 PTM1），稳定罐压为 0.08 MPa，调节
通气量、搅拌速度控制溶氧为 20% 左右。
当菌体浓度达到 30 g/L 左右时，停止流加甘油，
饥饿 40 min，耗尽细胞内残留的甘油。诱导阶段采
取连续补料方式添加甲醇（含 12 mL/L 的 PTM1），
初始流加速度为 1 mL/（L·h），之后每小时增加一
个单位，直至添加量为 10 mL/（L·h）后，调节转
速 为 800 r/min、 温 度 28.5℃、 空 气 流 量 4-6 m3/h、
罐压 0.1 MPa，同时离线检测甲醇浓度在 0.08%±0.02
（V/V）左右，控制 DO 为 10%-20%，诱导 β-甘露聚
糖酶基因表达。
1.2.5 β-甘露聚糖酶酶活测定方法 采用 DNS 法测
酶活力，酶活力单位定义：在 37℃、pH5.5 的条件下，
每分钟从浓度 3 mg/mL 的甘露聚糖（Sigma G0753）
溶液降解释放 1 μmol 还原糖所需的酶量为一个酶活
力单位。
1.2.6 细胞质量浓度测定方法 细胞干质量（80℃
烘干）与发酵液体积之比即为细胞质量浓度，根据
测量数值绘制线性回归曲线，细胞干重与 OD600 的
关系为 ：DCW=0.226OD600+0.017（R
2=0.989 2）。
1.2.7 VHb 表达产物活性检测方法采用 CO-差示光
谱法检测［9］。
2 结果
2.1 VHb基因PCR扩增产物及重组克隆质粒的
鉴定
VHb 基因 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，
在约 460 bp 处可见特异的 DNA 条带，大小与预期
相符（图 1）。重组表达质粒 pPICZαA-VHb 双酶切
产物（Asu Ⅱ、Not Ⅰ）经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，
均可见与目的基因大小相符的目的条带（图 2），且
测序结果与人工合成的基因序列一致，表明重组质
粒构建正确。
2.2 胞内VHb蛋白表达的鉴定
甲 醇 诱 导 5 d 后， 离 心 取 菌 体， 采 用 玻 璃 珠
法，破碎细胞提取胞内总蛋白，经 SDS-PAGE 分析，
可见相对分子量约 16 kD 的 VHb 特异性条带（图
3），大小与预期相符，说明 VHb 在毕赤酵母内成功
表达。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12196
2.3 胞内VHb蛋白活性的检测
经甲醇诱导培养 VHb 重组酵母和原始菌株，收
集菌体，破碎提取胞内蛋白，分别对两个样品作
CO-差示光谱分析，结果见图 4。VHb 重组菌的 CO-
差示光谱图为典型的 VHb 特征曲线，而原始对照菌
的 CO-差示光谱图为一条在 420 nm 处无特殊吸收峰
的平缓曲线，表明 VHb 重组毕赤酵母表达的透明颤
菌血红蛋白具有正常的生物活性。
2.4 低溶氧条件下VHb对高密度发酵产β-甘露聚
糖酶的影响
为了考察低溶氧条件下 VHb 对高密度产 β-甘露
聚糖酶的影响，在 30 L 发酵罐中，调节转速及罐压
控制溶氧在 10%±5%，其他条件不变，进行发酵研
究。由图 5 可知，在低溶氧条件下，共表达 VHb 工
程菌与原始菌株相比 β-甘露聚糖酶表达量有明显提
高。VHb 重组菌在发酵 96 h 后，酶蛋白表达量增速
明显，而对照菌株增速缓慢，发酵 132 h 后，共表
达 VHb 工程菌的菌体浓度和酶活力达到最高值，为
130 g/L 和 29 900 U/mL，分别是原始菌株的 1.3 倍、
1.9 倍。
8000
bp M 1
5000
3000
2000
1000
750
500
250
M ：DNA marker ；1 ：VHb 基因 PCR 产
图 1 VHb 基因扩增产物电泳图
8000
bp
M 1
5000
3000
2000
1000
750
500
250
8000
bp M 2
5000
3000
2000
1000
750
500
M ：DNA marker ；1 ：VHb 基因质粒 PCR 产物 ；2 ：VHb 重组质粒双酶切
图 2 重组表达质粒的 PCR 及双酶切鉴定
130
kD M 21
100
70
55
40
35
25
15
VHb㳻ⲭ
M ：蛋白 Marker ；1 ：原始菌株 ；2 ：共表达 VHb 重组菌
图 3 胞内 VHb 蛋白表达的 SDS-PAGE 分析
0.6
0.5
৏࿻㧼
VHb䟽㓴㧼
0.4
0.3A
0.2
0.1
0.0
400 410 420 440 450
λ/nm
460 470 480 490 500430
图 4 CO- 差示光谱
160 VHb-, DCW
VHb+, DCW
VHb-, β-Mannanase activity
VHb+, β-Mannanase activity
140
120
100
80
D
C
W
/g·L-1 
60
40
20
0
12 24 36 48 60
Fermentation time/h
72 84 96 108 120 132 144 156 168
0
β-
M
an
na
na
se
a
ct
iv
ity
/U·mL-1 32000280002400020000
16000
12000
8000
4000
图 5 低溶氧条件下 VHb 对菌体生长和酶活力的影响
2.5 甲醇添加量对VHb重组菌产β-甘露聚糖酶的
影响
在不同甲醇补料量下，通过摇瓶考察了 VHb
基因对毕赤酵母产 β-甘露聚糖酶的影响，结果如图
2015,31(12) 197张晓龙等：共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产 β-甘露聚糖酶发酵过程的影响
6 所示。每天补充甲醇 1% 时，VHb 重组的最高菌
体量和酶活与原始菌株一致，但随着甲醇补料量的
增加，VHb 重组菌在 2% 甲醇添加量下，最高菌体
量和酶活并未出现受抑制现象，而原始菌株则下降
50% 以上，当甲醇补料量增至每天 3% 时，VHb 重
组菌和原始菌株菌体量和酶活均出现大幅下降。
甲醇诱导阶段采取连续补料方式添加甲醇（含
12 mL/L 的 PTM1），初始流加速度为 6 mL/（L·h），
之 后 每 小 时 增 加 3 个 单 位， 直 至 添 加 量 为 15
mL/（L·h），维持高甲醇流加速度至发酵结束，其
余条件保持不变。诱导表达阶段提高甲醇流加速
度一方面会促进酵母菌加速繁殖，提高目的产物表
达 ；另一方面，过高的甲醇流加速度会对细胞造成
毒害作用，进而影响发酵过程。如图 7 所示，原始
菌株限于高甲醇的毒副作用，菌体量和酶活严重下
降，而 VHb 重组菌同摇瓶验证结论相同，耐甲醇能
力显著提高。同时，得益于高甲醇添加量，VHb 重
组菌发酵 96 h 后，菌体量和酶活达到最高值，分别
为 129 g/L 和 28 500 U/mL，与低甲醇补料下相比没
有大幅度波动，但发酵时间缩短约 40 h。
搅拌速率、通气量、罐压、优化通气系统设计、使
用空气与氧气的混合气等［10］，但优化工艺并不能
从根本上解决溶氧限制问题，更难以解决 100 m3 规
模以上发酵罐中由于溶氧分布不均导致的低溶氧和
溶氧波动问题，因此众多学者尝试在工程菌中引入
透明颤菌血红蛋白共表达的方法，提高重组细胞对
氧的利用率、促进细胞生长、改善细胞的表达量、
降低发酵过程的动力成本［11］。在工业化的基因工
程菌中，酵母是更易于工业化及表达更优越的系
统，VHb 在酵母中的成功应用，无疑对微生物发酵
行业有着深远的影响，而对于毕赤酵母高密度发酵
而言，孟志刚等［12］报道其可使得酵母生长速度表
快，细胞密度增加等，这对于提高发酵效率，缩短
发酵周期有着重要工业化价值。另一方面，唐辉桂
等［13］的研究却表明 VHb 对宿主细胞的生长没有明
显影响，但是却使植酸酶活性提高了 3 倍。而本研
究表明 VHb 菌株对菌体浓度有一定影响，但酶活力
没有提升，但是宿主菌对甲醇的耐受能力得到了提
高，这使得发酵周期可以进一步缩短。综上，VHb
对不同工程菌影响效果不一，在对 VHb 作用机制尚
不完全了解的前提下，目前公认的 VHb 的作用机制
主要在两方面 ：其一是清除对细胞生长不利的自由
氧与 NO，其二是促进氧的扩散，提高细胞对溶氧的
利用，而最近报道它与细胞膜脂可能才在一定的相
互作用［14］。
在毕赤酵母表达系统中，透明颤菌血红蛋白
的启动子有多种选择，应用 AOX1 强启动子［15］和
VHb-, DCW
VHb+, DCW
VHb-, β-Mannanase activity
VHb+, β-Mannanase activity
60
50
40
D
C
W
/g·L-1 
30
20
10
0
1 2 3
0
β-
M
an
na
na
se
a
ct
iv
ity
/U·mL-1 12001000800
600
400
200
1 ：1% 甲醇 /24 h ；2 ：2% 甲醇 /24 h ；3 ：3% 甲醇 /24 h
图 6 甲醇添加量对 VHb 重组菌、原始菌生长以及产 β-甘
露聚糖酶的影响
3 讨论
β-甘露聚糖酶在动物饲料业具有广阔的应用前
景，毕赤酵母作为成熟的商业菌株，便于大规模高
密度发酵以及外源蛋白的高表达，而溶氧限制却成
为毕赤酵母高密度发酵的瓶颈，已有众多学者致力
于解决发酵供氧问题。在工艺设备方面，尽量提高
160
140
120
100
80
D
C
W
/g·L-1 
60
40
20
0
24 36 48 60
Fermentation time/h
72 84 96 108 120
0
β-
M
an
na
na
se
a
ct
iv
ity
/U·mL-1 320002800024000
20000
16000
12000
8000
4000
VHb-, DCW
VHb+, DCW
VHb-, β-Mannanase activity
VHb+, β-Mannanase activity
图 7 30 L 发酵罐中高甲醇添加量对 VHb 重组菌、原始菌
生长以及产 β-甘露聚糖酶的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12198
PsADH2 低氧压力启动子［16］均有促进外源蛋白表达
的报道，根据前期试验数据，该工程菌在正常溶氧
下外源蛋白表达量已经达到 10.9 g/L，在毕赤酵母系
统中已属较高水平。因此为了降低动力消耗以缩减
成本，以及通过控制低溶氧水平以获得尽可能快的
甲醇补料速度，本实验计划在整个发酵中采用低溶
氧条件发酵，这就要求在整个发酵过程中血红蛋白
应在诱导期连续表达，因此选择 AOX1 强启动子在
低氧水平下与目的蛋白同时表达，以期最大程度缩
短发酵周期。
在低甲醇浓度下共表达 VHb 菌与原始菌株相比
生长情况并无区别，此时毕赤酵母菌体量已达 130
g/L，接近毕赤酵母表达系统菌体浓度的峰值，由此
说明 VHb 的胞内表达对宿主的生长并没有明显的促
进作用，结果见图 6（1% 甲醇组），这也与唐辉桂［13］
和卢俊裕［17］等的报道相一致。酶蛋白表达方面，
Hu 等［18］发现，诱导型 Pichia pastoris 进入甲醇诱导
期后，胞内 ATP 供应不足成为蛋白合成的主要限制
性因素，而 Chen 等［19］的研究则表明 VHb 的表达
虽然对 ATP 水平影响不明显，但能提高 ATP 的合
成速率达 1.68 倍，因此 Chen 等猜测 VHb 可能对和
氧有关的代谢途径的产物有直接的作用。图 6、图 7
也表明高甲醇浓度下，VHb 共表达菌株酶蛋白表达
速率明显较高，高效的 ATP 合成速率可以促进细胞
的呼吸［20］，提高能量代谢水平，加快了毕赤酵母目
的蛋白的表达速率。诱导期高甲醇浓度条件下，由
于甲醇浓度较高致使细胞内产生大量的甲醇及过氧
化氢，从而导致细胞的死亡［21］，但本实验中共表达
VHb 工程菌耐甲醇能力明显提高，这可能与 VHb 的
抗氧化胁迫性质有关［22］，VHb 蛋白具有的高氧吸附
和解离速率常数［2］，提高了氧气的利用效率，提高
了毕赤酵母对甲醇的耐受性。
在不同甲醇添加量下，通过 30 L 发酵罐对比考
察了共表达 VHb 工程菌和原始菌株的生长与 β-甘露
聚糖酶的合成情况，如图 5 中，在低甲醇浓度下，
两株菌均在发酵 130 h 左右达到菌体浓度和酶蛋白
的峰值，而图 7 中在高甲醇浓度下，共表达 VHb 工
程菌在 96 h 左右便达到峰值，发酵周期缩短近 40 h，
根据 Mayson［23］、Hong 等［24］的研究，诱导期尽量
提高甲醇补料速度有助于菌体生长和酶蛋白的表达，
而共表达 VHb 工程菌较高耐甲醇能力又极大的缩短
了发酵周期。
4 结论
本研究将密码子优化后的 VHb 基因，构建到表
达 β-甘露聚糖酶的毕赤酵母中，共表达 VHb 基因
能明显提高毕赤酵母对甲醇的耐受性，当控制溶氧
10%±5%，甲醇流加速度维持为 15 mL/（L·h）时，
使得 β-甘露聚糖酶酶活力未有明显变化，但发酵周
期降至 96 h，缩短约 40 h，在动力成本占到总成本
约 50% 以上的毕赤酵母高密度发酵生产中。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）