全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
随着分子高通量测序、基因芯片和 RNA-seq 技
术的产生、发展，复杂基因组中未知基因功能的探
索对生物学的定点研究、临床医学及基因治疗都有
着不可替代的前景和作用。从人们对基因功能探索
开始，研究者就利用 DNA 损伤修复的天然机制（自
然重组）来实现靶基因的定点修饰，然而自然情况
下重组效率极低，且实验重复性差，致使后续试验
不能顺利进行。经过科研工作者的不断探索，获得
了一些对基因组中特定位点的基因进行靶向敲除或
敲入的方法，并取得一定的成效。近年来，人工核
酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN）方法的
出现使基因靶向敲除变得简单，同时也提高了实验
的重复性。ENN 能够通过特异性的核酸序列介导，
收稿日期 ：2013-11-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31272429），江苏省研究生培养创新工程（CXLX12_0934）
作者简介 ：左其生，男，硕士研究生，研究方向 ：动物胚胎工程与遗传工程 ；E-mail ：744366503@qq.com
通讯作者 ：李碧春，女，博士，教授，研究方向 ：动物胚胎工程与遗传工程 ；E-mail ：yubcli@yzu.edu.cn
CRISPR-Cas 介导的基因编辑工具
左其生  李东  张亚妮  李碧春
（扬州大学动物科学技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009）
摘 要： 近年来，随着人们对 CRISPR-Cas 系统研究的不断深入和改造，CRISPR-Cas 系统已成为一项新的基因靶向修饰技术，
能够定向对靶基因进行定向沉默，目前该项技术已经成功地用于 HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株，
在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas 以其设计简单，耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔
应用前景的基因靶向敲除技术。就 CRISPR-Cas 的发现、结构、作用机理以及 Cas9/gRNA 目前的一些应用进行综述。
关键词 ： CRISPR-Cas 基因修饰 基因敲除
Gene Editing Tools Mediated by CRISPR-Cas
Zuo Qisheng Li Dong Zhang Ya’ni Li Bichun
（Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province，College of Animal Science and Technology，
Yangzhou University，Yangzhou 225009）
Abstract:  Recently, with the deepening of the research and transformation of CRISPR-Cas system, it has been applied as a new gene
targeting modification technology, which can be directed to silence target genes. At present, this technology has been successfully used in
HEK293, mouse and zebrafish cells and generated stable gene knockout cell lines, meanwhile gene knockout models has been constructed on the
models animals such as mice and fruit flies. With the advantages of simple design, short time-consuming and higher efficiency, CRISPR-Cas has
become a gene targeting knockout technology with broad application prospect. In this paper, structure and function mechanism of the CRISPR-
Cas, also the current applications of Cas9/gRNA were reviewed.
Key words:  CRISPR-Cas Genetic modification Gene knockout
利用核酸内切酶对特异性的 DNA 位点进行酶切，产
生 双 链 断 裂 切 口（double strand breaks，DSB）， 当
DNA 损伤时，细胞为防止 DNA 降解启动 DNA 的自
我修复机制 ：同源重组（homologous recombination，
HR）和非同源末端重组（Non-homologous end joini-
ng，NHEJ），对断裂的双链核酸进行修复。非同源
末端重组修复过程极易产生碱基丢失，错配，在修
复过程中会产生不等数目的碱基缺失或者插入，进
而改变基因的密码子阅读框，使得翻译后的蛋白质
的功能出现差异甚至失活。精准的基因靶向修饰可
以清楚的了解目的基因的功能，有利于深入了解
疾病的发生机制并制定相应的治疗方案。目前应
用比较广泛的 ENN 主要有锌指核酸酶（Zinc-finger
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期38
nuclease，ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶
（Transcription activator-like effector nuclease，TAL-
EN），然而这两种技术的设计比较复杂，实验过程也
较繁琐，而作为第 3 代 ENN 技术的 Cas9/gRNA 系统
则是这两年兴起的一种快速基因靶向敲除技术，因
其具有实验过程简单、耗时短和工作量小等优势，
正逐渐地取代 ZFN 和 TALEN 技术。目前研究人员
已经利用 Cas9 系统在小鼠、斑马鱼和果蝇等动物中
成功的构建了基因敲除模型，并在 HEK293 和 iPS
等细胞中实现了基因的敲除并产生了稳定的细胞株，
实现了基因的定点修饰及其功能研究。因此，本文
就 Cas9 系统的作用原理、设计步骤及其应用进行系
统的综述。
1 CRISPR-Cas 的发现、结构及作用原理
规律性重复短回文序列簇（clustered regularly
interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）是细
菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免
疫防御机制，通过小片段的 RNA 介导对入侵的核酸
进行靶向定位并通过 Cas 酶对核酸进行酶切、降解［1］。
研究者根据 CRISPR-Cas 系统的特性对此系统进行改
造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术。利用此技术
能够对目的基因进行靶向的敲除（Knock out）或敲
入（Konck in）。
1.1 CRISPR-Cas的发现
1987 年，日本学者在研究细菌中编码碱性磷
酸酶基因时发现，在这个基因的编码区附近有一小
段 DNA 片段包含了大量的重复序列［2］，直到 2002
年， 科 学 家 才 将 其 正 式 命 名 为 Clustered regularly
interspaced short palindromic repeats（CRISPR）［3］。
研究发现，大约有 40% 的细菌中含有 CRISPR 位点，
但是不同细菌种属在该位点的基因序列具有特异
性［4］。2005 年，科研人员发现 CRISPR 中的重复序
列与细菌的外源核酸入侵的免疫过程有关，其功能
类似于真核生物的 RNAi 干扰方式。此后，科研人
员陆续的探索了 CRISPR 的功能和机制，并将其应
用于生物、医药、农业等领域，使之成为继 ZFN 和
TALEN 之后的又一重要的基因靶向修饰技术。
1.2 CRISPR/Cas9 的结构
CRISPR 是一种特殊的 DNA 序列重复家族，是
细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的一种特异
性免疫防御机制。CRISPR-Cas 主要分为 I、II、III
3 个类型，Type I 系统分布于细菌和古细菌中，组
分复杂，核心蛋白元件为 Cas3 蛋白，该蛋白具有
DNA 核酸酶和解旋酶功能，在防御外源核酸入侵时，
多个 Cas 蛋白与 crRNA 形成复合物 CASCAD（CRISPR
associated complex for antivirus defense），在 crRNA 的
介导下与外源核酸特异性结合，Cas3 启动核酸酶作
用，对外源核酶进行酶切，降解。Type II 系统主要
分布于细菌中，尤其是产链脓杆菌。该系统组分简
单，核心蛋白元件为 Cas9 蛋白，Cas9 蛋白与成熟的
crRNA 结合形成复合物即可对外源的核酸进行酶切，
降解。Type III 系统主要分布于古细菌中，在细菌中
比较少见。该系统的核心蛋白元件为 Cas10，其作
用于 Type I 的 CASCAD 类似，主要参与 crRNA 的成
熟以及外源核酸的降解。根据系统的靶标对象的不
同可将 Type III 分为 Type III A 和 Type III B，前者的
靶标对象为 mRNA，后者为 DNA［5］。
由于 II 型 CRISPR 的系统组分相对简单，因此
目前研究多集中于 II 型 CRISPR 系统。II 型 CRISPR/
Cas 的组成，如图 1 所示，首先是 5 端的 tracrRNA，
此 tracrRNA 能 够 与 3 端 的 spacers 序 列 转 录 剪 切
成熟后的 crRNA 通过碱基互补配对形成双链 RNA，
tracrRNA/crRNA 二元复合体指导 Cas9 蛋白在 crRNA
引导序列靶标的特定位点剪切双链 DNA ；其次是
Cas 蛋白的编码序列 Cas9、Cas1、Cas2 和 Csn2，不
同的亚型蛋白分别在 DNA 的复制、转录和翻译过
程中发挥不同的作用，其中 Cas9 具有核酸酶的作
用。Cas9 包含 HNH 核酸酶结构域和 RuvC-like 结构
域，HNH 核酸酶结构域能够剪切与 crRNA 互补的序
列而 RuvC-like 结构域则剪切非互补的序列 ；3 端为
CRISPR 基因座，由启动子区域和众多的重复序列
（21-48 bp 左右，序列并不严格保守）和间隔序列组
成，重复序列中的回文序列在 Cas 蛋白形成核糖核
蛋白复合物的过程中起着重要的作用。间隔序列决
定了 CRISPR 系统的特异性，间隔序列的差异来源
于外源入侵的噬菌体和质粒，一般在 21-72 bp，不
同的间隔序列能够记录不同的噬菌体或者质粒的入
侵的时间和顺序。
2014年第7期 39左其生等 ：CRISPR-Cas 介导的基因编辑工具
1.3 CRISPR-Cas 系统的作用原理
任何一种生命体都可以通过某一 RNA 介导的防
御机制来保护自身的基因组免受外源核酸的干扰和
破坏，如真核生物中 miRNA 干扰现象，CRISPR-Cas
系统则是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的
特异的免疫防御机制，当外源核酸入侵时对其靶向
定位并进行降解，其作用过程主要分为 3 步 ：首先
CRISPR 间隔序列的获得和整合 ；其次，CRISPR 基
因座的表达 ；再次，CRISPR-Cas 功能的发挥，即对
外源核酸的干扰［6］。
当噬菌体或者外源质粒初次入侵时，其核酸
的一小段 DNA 片段将被动的整合到宿主的基因组
中，整合部位位于 CRRSPR 的 5 端的初始的重复
序列中形成间隔序列，而噬菌体或质粒中与之对应
的序列则为原间隔序列（Protospacer），而原间隔
序列的 5 端和 3 端延伸的几个序列是非常保守的，
称 之 为 原 间 隔 序 列 临 近 基 序（Protospacer adjacent
motifs，PAM），PAM 的一般形式为 NGG，其作用是
将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的 DNA 序列
中，即宿主对入侵的外源核酸进行扫描，在其 DNA
序列中定位若干个 PAM，并将 PAM 5 端或 3 的序
列定义为新的原间隔序列并被剪切后陆续的整合到
CRRSPR 系统 5 端新合成的两个重复序列之间（图
2）。间隔序列的产生与 Cas2 的功能是分不开的，大
量研究发现所有的 CRISPR 系统中都含有 Cas2 基因
编码区，表明 Cas2 在 CRISPR 系统作用的过程中起
着非常重要的作用，研究结果也表明 Cas2 参与了新
的原间隔序列的形成。
正 常 情 况 下 细 菌 中 的 CRISPR 的 表 达 水 平 较
低且相对恒定。当噬菌体或外源质粒再次入侵时，
CRISPR 会被迅速的诱导上调表达。重复序列和间隔
序列在前导序列的启动下进行转录形成 pre-crRNA，
pre-crRNA 通过剪切形成成熟的 cr-RNA。cr-RNA 由
两部分组成即间隔序列和侧翼的部分重复序列。cr-
RNA 与 tracrRNA 形成双链的 RNA，对入侵的外源
核酸进行靶向的定位并介导 Cas9 核酸酶对外源核酸
进行切割降解。目前发现并非只有 cr-RNA 与外源
DNA 完全匹配的才会被酶切，随着该技术的不断发
展，研究表明 Cas9 技术在实验过程中存在脱靶效应，
即 cr-RNA 与外源 DNA 不完全匹配的情况下序列也
有可能被酶切。
tracrRNA
Cas9
pre-crRNA
mature crRNA
processed
tracrRNA
Cas9
protospacer
PAM
2. maturation by RNase III & unknown nucleases1. pre-crRNA transcription
3. target
recognition
4. Cas9-
mediated
DSB
Cas1 Cas2 Csn2 spacers
direct repeats
Streptococcus pyogenes SF370 type II CRISPR Locus
图 1 II 型 CRISPR/Cas 结构示意图
Conjugation
Plasmid
DNA
Viral
DNA
Novel
spacerCleavage
Cas
complex
Infection
Virus
Insertion of a novel
repeat-spacer unit
CRISPR array
L
csn2csn1 cas2cas1
5 4 3 2 1
图 2 II 型 CRISPR-Cas 系统原间隔序列形成过程
2 Cas9/gRNA 的体外构建步骤
研 究 人 员 发 现 Cr-RNA 与 tracrRNA 形 成 的 双
链 RNA（guide RNA，gRNA） 介 导 的 双 链 DNA 剪
切系统的核心，人为的改造这一双链 RNA 可以了
解细菌 Cas9 对不同物种的 DNA 系列进行任意的切
割，gRNA 介导 Cas9 对靶基因进行切割并形成 DSB
是实现基因修饰的基础。Hwang 等［7］利用人工合
成的 sgRNA 指导了细菌蛋白 Cas9 对斑马鱼胚胎基
因进行了修饰，其效率类似于 ZFN 和 TALEN 技术。
Cas9/gRNA 系统体外构建的一般步骤（图 3）：（1）
从已知的序列中通过 PAM 进行定位寻找合适的靶
位点并合成 gRNA，在设计靶位点应尽量靠近第一
外显子附近，这样能够获得较高活性的 gRNA ；（2）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期40
将合成好的 gRNA 与 Cas9 序列构建重组质粒。目
前在构建重组质粒过程中有两种主要方案 ：一是将
gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子
启动，载体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪
筛选）或抗性基因（用于药物筛选）。二是将 gRNA
与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不
同的荧光报告基因或抗性基因 ；（3）对构建好的重
组质粒进行活性检测，即敲除活性的计算 ；（4）挑
选活性较高的敲除质粒或者质粒对通过转染或者显
微注射的方法导入培养的细胞或者生物体内进行基
因组定点编辑操作 ；（5）利用测序、RFLP 等方法检
测基因组定点修饰的结果。与 ZFN、TALEN 不同的是，
Cas9 系统的 gRNA 的设计比较简单，而第 3 步的活
性检测则关系到后期基因的敲除效率，为 Cas9 系统
实验过程中的关键一步。
位点的检测，选择 PAM 5 端存在酶切位点的原间隔
序列作为 gRNA，可以通过酶切鉴定基因修饰的结果；
研究还发现在设计 sgRNA 时，如果 DSB 的侧翼存在
重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介
导断裂位点碱基的缺失。
综上，sgRNA 的设计原则有以下几点 ：（1）选
择 PAM（NGG）5 端的一段碱基序列作为原间隔序
列，即敲除的靶位点。（2）选择的序列必须在全基
因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对
其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。（3）优
先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列 ；（4）PAM 的
5 端尽量存在酶切位点。
2.2 gRNA的活性检测
对设计好的 sgRNA 进行活性检测以获得突变效
率较高的 sgRNA 用于后期的实验。目前主要采用的
方法有限制性内切酶法、非配对内切酶法和 SSA 活
性检测。
2.2.1 限制性内切酶法 生物体内存在着一些内切
酶类，它们能够特异性的识别 DNA 双链中的特定序
列并对其进行切割，这些酶能够降解外源的 DNA 使
之失活却对本身固有的 DNA 没有影响，所以称之为
限制性内切酶。根据限制性内切酶的这种特性，设
计 sgRNA 时 应 选 择 在 PAM 的 5 端 存 在 酶 切 位 点
的原间隔序列（特异性的靶位点）。在 Cas9/sgRNA
靶点位置中间序列中有限制性内切酶切位点，如
HindIII，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，这个位点
将可能被破坏，而不能被 HindIII 酶切 ；同时野生型
的细胞则可被 HindIII 酶切。可采用电泳的方法估计
突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。
Wang［8］等在设计针对 Tet1、Tet2 和 Tet3 这 3 个基
因的 sgRNA 时分别引入 Sca I、EcoR V 和 Xho I 酶切
位点，利用相应的内切酶对转染了 Cas9/sgRNA 细胞
的 DNA 进行酶切后，其突变效率分别为 36%、48%
和 36%。
2.2.2 非 配 对 内 切 酶 法 T7 核 酸 内 切 酶 I（T7
endonuclease I，T7E1） 能够识别不完全配对 DNA 并
对其进行切割，还能对十字型结构 DNA、Holliday
结构或交叉 DNA、异源双链 DNA 进行识别和切割，
该酶切割错配碱基 5 端的第 1、第 2 或第 3 个磷酸
1ᐢ⸕ᒿࡇѝራ᢮ਸ䘲Ⲵ
gRNAս⛩ˈᒦਸᡀgRNA2Cas9/gRNA䟽㓴䍘㋂䖭փ⍫ᙗỰ⍻3Cas9，gRNA䟽㓴䍘㋂䖭փᶴᔪ4ሬޕษޫⲴ㓶㜎ᡆ⭏⢙փ޵ˈ䘋㹼สഐ㓴ᇊ⛩㕆䗁᫽֌5Ự⍻ᇊ⛩؞侠㔃᷌৺л⑨ᇎ傼 ᰐ⍫ᙗᡆ㘵⍫ᙗ䖳վˈ䟽ᯠਸᡀJ51$
图 3 Cas9/gRNA 系统体外构建步骤流程图
2.1 gRNA的设计
sgRNA 是体外人工合成的一小段单链核糖核苷
酸， 约 19-23 bp， 其 中 PAM 和 5 端 的 8-12 bp 的
seed seqence 对靶向切割双链 DNA 最为重要。PAM
的存在形式主要为 NGG，其中 N 为 5 端，PAM 的
主要作用是对目标 DNA 序列中的原间隔序列进行定
位，使 sgRNA 能够与靶位点进行特异性结合并介导
Cas9 蛋白识别并在其 5 端实现切割。除了 PAM 和
seed seqence 之外的 5 端的其他碱基序列在对靶位
点的识别时容易脱靶，这也是 Cas9 在试验过程中出
现脱靶效应的原因 ；在试验过程中为方便后期突变
2014年第7期 41左其生等 ：CRISPR-Cas 介导的基因编辑工具
二酯键。如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组
DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA
的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对
DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。若没
有发生突变，将产生配对 DNA 片段，而无法被非配
对内切酶 T7E1 剪切。用电泳的方法估计突变效率，
以 突 变 效 率 的 高 低 来 衡 量 sgRNA 的 活 性。Chang
等［9］利用此法估算 Cas9/sgRNA 和 TALEN 技术处理
的突变效率，结果表明 Cas9/ sgRNA 的突变效率比
TALEN 技术的突变效率要高 10%-15%。
2.2.3 SSA 活性检测 SSA 活性检测原理如图 4 所
示 ：一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中
央（红色标记），luciferase（GFP）就会失去活性。
为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA
的靶点位置序列插在终止子后（蓝色标记）。在
Cas9/ sgRNA 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞
通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的
luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/
sgRNA 剪切的活性水平。Chang［9］在对斑马鱼胚胎
基因组进行修饰时以 GFP 为报告基因进行了 SSA 活
性检测，结果显示 Cas9/sgRNA 处理组的荧光强度是
对照组的 9 倍。
人员利用显微注射等方法获得小鼠、大鼠和斑马鱼
等模式动物的敲除个体并顺利产生后代。
3.1 Cas9/sgRNA系统细胞水平进行基因的修饰
目前，科研人员已经利用产链脓杆菌的 typeII
型系统改造的 Cas9 系统在人类细胞，小鼠及斑马鱼
等物种中完成基因修饰并取得良好结果。
Jinek［10］课题组以人类细胞为实验材料进行基
因的靶向修饰，试验中筛选的细胞顺利产生 DSB，
说明 Cas9 系统可用于人类细胞。他们对 Cas9 系统
进行了改造，改造过程中发现 TracrRNA 是 Cas9 系
统具有活性必不可少的组分，作者还详细阐述了
Cas9 系统的切割原理以及切割的具体位置 ；试验还
表明 gRNA 的表达对 Cas9 的活性是必不可少的，而
且 gRNA 的 3 端的适当延伸能够显著增加 Cas9 系统
的活性。Jinek 等的试验结果为后续的 Cas9 系统的
研究和应用奠定了基础，为基因靶向修饰提供了一
个除 ZFN 和 TALEN 之外的另一个宝贵的实验工具，
这为基础医学尤其是基因治疗提供了新思路、新方
法、新途径。
随后研究人员对 Cas9 系统中不同组分对对实
验的影响进行了探索。Cho［11］团队以人的细胞为
试验材料，通过试验证明在共转染体系中 gRNA 的
浓度的增加能够提高基因的敲除效率，最高效率达
到 33%。Mail 等［12］改造了 Cas9 系统以用于人类基
因组编辑，并顺利地在 HEK 293 和 K652 细胞中实
现基因的靶向敲除。Cong 等［13］ 利用 Cas9 系统在
小鼠的 nero2A 细胞中的 Th 基因以及 HEK293 细胞
的 EMX1 基因，PVALB 基因实现定点敲除。Cong 和
mali 通过试验表明 gRNA 在结构上越接近 crRNA 和
tracrRNA 复合体，则在试验过程中能够获得较高的
敲除效率。
目前利用 Cas9 进行基因敲除的技术已经日渐
成熟，利用此技术在细胞中可实现单基因或者多
基因的敲除。Mali 等［12］利用此技术在人的细胞中
实现了基因的敲除，靶向敲除效率分别为 HEK 293
为 10%-25%，K562 为 8%-13%，iPS 为 2%-49% ；
Wang 等［8］通过共转染的方法在小鼠的胚胎干细胞
中对 Tet1、Tet2、Tet3、Uty 和 Sry 等基因中实现了
单基因、双基因及多基因的敲除，敲除效率达 40%
Truncated luciferase
Stop Target site
DSB
SSA
Active luciferase
图 4 SSA 活性检测原理示意图（颜色标识见电子版）
3 Cas9/sgRNA 系统的应用
虽然 CRISPR/Cas 的发现可以追溯到 1987 年，
但是这种技术的应用和发展却是近两年才开始的，
目前这项技术已经被广泛应用于动物的细胞水平或
者个体水平的基础研究，也已经在 HEK293 细胞、
iPS 等细胞中产生了稳定的敲除细胞株。另外，科研
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期42
左右，并通过测序、RFLP 及 DNA 印迹等方法进行
了验证。Cong 等［13］也在人和小鼠的细胞中也实现
了多基因的同时敲除。利用多基因敲除试验的成功
将有利于科研人员在体内研究冗余基因以及上位基
因的功能。
3.2 Cas9/sgRNA系统个体水平进行基因的修饰
自 20 世纪 80 年代第一只基因敲除小鼠的产生，
科研工作者一直致力于基因敲除模型的制备，期间
虽然 ZFN 和 TALEN 也曾一时兴起，然而这两种方
法耗时耗力，过程也很繁琐。Cas9 系统的产生为基
因敲除模型的制备提供了新方法。
Friedland 等［14］以线虫为生物模型，通过显微
注射的方法向线虫胚胎细胞中注射 Cas9/gRNA 质
粒，实现基因在个体水平上的基因敲除，敲除效率
约为 88%，为保证这种方法的顺利使用，作者还介
绍了一种新的检测基因突变的方法——高分辨率融
化分析（High-resolution melt analysis）。Hwang 等［7］
利用 Cas9/ gRNA 通过对斑马鱼胚胎 drd3、gsk3b 基
因进行修饰，获得了这两个基因位点的突变的突变
体 ；Li 等［15］利用 Cas9 系统在小鼠的个体上实现了
基因的靶向修饰，通过显微注射的方法将 Cas9 以及
gRNA 的 mRNA 共注射进小鼠的胚胎干细胞对 Uhrf2
基因进行定点修饰，获得了 Mc3R、Mc4cRL 两只双
基因敲除小鼠。Wang 等［8］通过显微共注射 mRNA
的方法获得了 Tet1、Tet2 的单基因敲除小鼠以及双
基因敲除小鼠，并在其后代中仍然为敲除阳性。利
用 Cas9 技术产生基因敲除模型能够很好的应用于基
因治疗以及家畜育种过程中。
4 存在的问题
根据实验的需要以及 gRNA 的设计原则设计出
符合实验需求且特异性较高的 gRNA，并能在活性
检测过程中具有较高的活性（即较高的敲除效率）
为试验难点之一。
避免试验过程中 Cas9 系统的脱靶效应。虽然
Wang［8］对 Cas9 系统的脱靶效应进行了研究，结果
表明无脱靶效应，但是由于物种之间存在差异以及
所设计的 gRNA 之间有差别，因此 Cas9 系统的脱靶
效应有待于进一步研究。
Cas9 系统在高度分化的细胞、细胞系以及个体
上都有较为理想的试验结果，但是在未建系的干细
胞上尚未有成功的先例，尤其是在转染 Cas9/gRNA
质粒或者 mRNA 后如何筛选出阳性克隆进行后续试
验这一问题有待解决。
Cas9 系统的毒性问题。Cas9 为细菌蛋白，目前
尚不清楚其在其他物种的细胞中作用是否会产生毒
性。Wang 等在他们的试验中对 Cas9 的用量进行了
梯度实验，结果表明，在适当的范围内提高 Cas9 的
浓度有利于提高基因的敲除效率，但是 200 ng 的浓
度不能证明对其他物种也适用。因此 Cas9 系统的毒
性问题有待于进一步解决。
5 展望
II 型 CRISP/Cas 应用为一种新型的基因靶向修
饰技术，虽然这种应用尚处于起步阶段，但是相比
于 ZFN、TALEN 技术的耗时、耗力以及设计繁琐等
缺点而言 Cas9 以其设计简单，耗时短，实验操作性
强等优势而被科研人员广泛使用。一般而言，以小
鼠为试验材料，Cas9 系统最快可在 6-8 周内产生基
因敲除模型，这就大大的节省了试验时间而且成功
率高。ZFN 和 TALEN 以 Fox I 酶为核心，而 Cas9 系
统则以 Cas9 酶为核心，在修饰过程中 Cas9 系统在
gRNA 的介导下的特异性比 ZFN、TALEN 更强，能
够更加准确的对基因进行修饰 ；当需要针对基因组
中不同的切割位点时，ZFN、TALEN 需要重新设计，
而 Cas9/gRNA 系统只要重新合成 gRNA 即可。这些
是 ZFN、TALEN 技术所达不到的。
虽然目前 II 型 CRISP/Cas 的研究尚属崭新领域，
但是此技术将成为基因工程研究的一种新工具，虽
然关于 CRISP/Cas 的系统具体机制不甚了解，部分
问题有待于进一步解决，但是我们相信随着科研人
员对 CRISP/Cas 系统研究的不断深入，CRISP/Cas 系
统将更好的帮助科研人员了解基因的功能，探索基
因组的奥秘。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）