全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 3期，第 593-597页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.3, 593-597
研究报告
Research Report
CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除拟南芥 AG基因表达载体的构建
王晓霞 苏哲 岳彩云 樊金会 *
山东农业大学林学院,泰安, 271018
*通讯作者, hjf2003@sdau.edu.cn
摘 要 CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在进化过程中逐渐形成的一种适应性免疫系统，通过 sgRNA介
导对靶位点进行定位并利用 Cas酶对核酸实现双链断裂(double-strand break, DSB)。CRISPR-Cas系统作为
一种新兴的基因定点编辑技术逐渐成熟并在多个植物中成功得到应用，以此技术对目的基因进行靶向的敲
除或敲入。本实验以拟南芥 AG基因为基础，构建 CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除拟南芥 AG基因的表
达载体，并利用农杆菌介导 CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除拟南芥 AG基因，以获得高效的敲除拟南
芥基因的遗传转化体系。
关键词 CRISPR-Cas9,基因敲除,拟南芥, AG,遗传转化
The Construction of Expression Vector of Knocking Out AG Gene in Arabid-
opsis thaliana by CRISPR-Cas9
Wang Xiaoxia Su Zhe Yue Caiyun Fan Jinhui *
College of Forestry, Shandong Agricultural University, Taian, 271018
* Corresponding author, hjf2003@sdau.edu.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000593
Abstrac t The CRISPR-Cas system is a kind of adaptive immune system, which was gradually formed in the
evolutionary process of bacteria and archaea. The CRISPR-Cas system positions to the targeted point with sgRNA，
and the nucleic acid is double-strand brokenby Cas enzyme. CRISPR-Cas system as a new gene fixed-point editing
techniques has been successful applied in many plants. Targeted genes can be targeting knock-out and knock-in by
the technology of CRISPRs. The experiment is based on the AG gene of Arabidopsis thaliana, and construced a
vector which knockout AG gene by CRISPR-Cas9 system, and then the high efficient genetic transformation system
is obtained which can knockout Arabidopsis thaliana genes by using the agrobacterium-mediated genetic transform-
ation of CRISPR-Cas9 system.
Keywords CRISPR-Cas9, Gene knockout, Arabidopsis thaliana, AG, Genetic transformation
基因组编辑技术正飞速发展，CRISPR-Cas系统
作为一种新兴的基因定点编辑技术逐渐成熟并成功
应用于多种动植物物种，促进了基因功能的研究。
CRISPR-Ca 系统是细菌和古细菌在进化过程中逐
渐形成的一种适应性免疫系统，通过小片段的 RNA
介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过 Cas 酶对
核酸进行酶切、降解可以降解入侵的病毒或质粒
DNA (Wiedenheft et al., 2012; Terns and Terns, 2011)。
利用此技术能够对目的基因进行靶向的敲除或敲入。
虽然目前为止，对 CRISPR-Cas9系统的作用机
制尚未作出完全详细的论述，但其作用机制的整个
过程已经基本明确，CRISPR-Cas9的作用机理(基本
工作原理如图 1)可分为三个阶段。第一阶段，CRISPR
的高度可变的间隔区的获得，在噬菌体入侵的起始
阶段，Cas蛋白复合物靶向并裂解噬菌体基因组中的
原型间隔序列，间隔序列接下来整合到宿主基因组
的 CRISPR位点的 5端；第二阶段，CRISPR基因座
的表达，这些插入的短间隔序列被转录成 crRNA；第
三阶段，CRISPR-Cas9系统发挥活性，对外源遗传物
质进行干扰。在 Cas蛋白复合物的参与下，靶向和干
扰侵入的噬菌体 DNA序列(李铁民和杜波, 2011;方
锐等, 2013)。
AG基因是最早克隆的花发育调控基因,与植物
花器官(心皮,胚珠,果实等)的发育有密切关系.由于
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1 CRISPR-Cas9工作原理示意图
Figure 1 Schematic diagram of CRISPR-Cas9
图 2菌落 PCR筛选
注: 1: pUC19-AG; 2: pCAMBIA1302-AG; M: Maker DL2000
Figure 2 Colony PCR screen
Note: 1: pUC19-AG; 2: pCAMBIA1302-AG;M:Maker DL2000
图 3 pUC19-AG酶切电泳图
Figure 3 Enzyme electrophoresis map of pUC19-AG
AG基因与植物性别分化,开花结果等密切相关,因
此研究 AG的调控机制有一定的实际应用价值。本
研究以拟南芥为材料，构建 CRISPR-Cas9敲除拟南
芥 AG基因载体，建立稳定的敲除拟南芥基因的转
化体系，并获得基因敲除的突变体。
1结果与分析
首先将靶位序列片段与克隆载体 pUC19-U3连
接，转化大肠杆菌，菌落 PCR筛选阳性克隆(图 2)，提
取质粒为构建好的克隆载体 pUC19-AG。中间克隆
载体 pUC19-AG利用 EcoRⅠ和 XbaⅠ双酶切回收
520bp左右片段(图 3)，表达载体 pCAMBIA1302-Cas9
利用 EcoRⅠ和 NheⅠ分别酶切后过滤小片段并线性
化。利用 T4DNA连接酶连接 520 bp片段和线性化
表达载体，构建 pCAMBIA1302-AG表达载体。
菌落 PCR筛选引物为 AG-P：5-GCAA ATCGT
CTTCTCTAGCCGTGG-3和 OsU3-D：CGGCTAGA
GAAGACGATTTG。
表达载体构建过程中 pCR筛选验证的电泳图说
明表达载体已构建成功，并可以进行转入植物体内
进行表达过程。
2讨论
虽然 CRISPR系统的发现可以追溯到 1987年，
但是 CRISPR-Cas9这种技术的应用研究还处于初始
阶段，是近几年才逐渐发展起来的。该技术已经成功
应用在多种微生物、动物细胞、动物和植物。2013年
Nature Biotechnology同时报道了在重要作物水稻、
小麦以及模式植物拟南芥和本生烟中取得了多个基
因定点敲除、插入等基因组定点编辑的操作的成功
案例，并首次证实 CRISPR-Cas9系统能够在植物基
因组中实现定点编辑(Shan et al., 2013; Feng et al.,
2013; Li et al., 2013; Nekrasov et al., 2013)。
利用 CRISPR-Cas9系统极性基因定点编辑可以
用更加灵活性的方式实现只利用载体定点编辑同一
个基因的不同位点和利用一个载体同时编辑多个靶
位点。由于此系统的靶位点很短，只有 20 bp左右，所
以可以设计几个串联在一起的 sgRNA，来实现对同
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一基因多个位点的同时编辑以及多个不同基因靶位
点的编辑。同时定点编辑多个基因，可以有助于研究
基因间的相互作用机制和研究同一基因家族的不同
基因的功能。
CRISPR-Cas9在各项研究领域必将有越来越有
广阔的应用前景，为基因组定向编辑领域的研究带
来突破性的技术革命，特别是在基因功能解析和加
速重要农作物水稻、小麦性状改良与分子定向育种
等方面(李君等, 2013)。
拟南芥作为模式植物，在分子研究领域有着植
株小、结实多、生命周期短、基因组简单、遗传操作简
便等优势，拟南芥基因组测序的完成使得大量涉及
重要生命过程的基因被发现，对于开展遗传分析、基
因克隆和功能研究意义重大。
3材料与方法
3.1实验材料
3.1.1植物材料
试验采用在实验室中培养室进行培养的拟南芥
无菌苗。
3.1.2菌株与质粒
CRISPR-Cas9植物基因敲除系统包含克隆载体
pUC19-U3和表达载体 pCAMBIA1302-Cas9；本实
验所用的大肠杆菌(E. coli)菌株为 E. coli DH5α，农
杆菌菌株为 GV3101。
3.1.3酶和生化试剂
Taq 酶、T4 DNA 连接酶、BbsⅠ酶、EcoRⅠ酶、
NheⅠ酶、DNA Maker DL 2000等试剂及 DNA纯化
回收试剂盒等。
3.2实验方法
3.2.1愈伤组织诱导
无菌环境下，切取实验室的无菌苗叶片，接种到
1/2MS基本培养基培养，附加激素 2,4-D和 6-BA进
行处理：2,4-D的浓度设 0、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L
和 2.0 mg/L5 个梯度，6-BA的浓度为 0.5 mg/L。每
种培养基接种 50个样，约 21 d后观察叶片愈伤形
态，统计愈伤组织的诱导率。
3.2.2表达载体构建
3.2.2.1 AG基因敲除靶位引物序列设计
(1)在 AG 基因序列中设计一对 20 bp 的 oligo
DNA片段：5-3：ATCGTCTTCTCTAGCCGTGG。
在基因的起始密码子 ATG后，找到 Cas9的识
别位点 PAM结构，找到 PAM结构 AGG (下划线标
出)，在 PAM结构前找 20bp序列片段设定为靶位序
列：ATCGTCTTCTCTAGCCGTGG。
5… GTCGCACTCATCGTCTTCTCTAGCCG
PAM靶位点
TGGTCGTCTCTATG…3
sgRNA 3………UAGCAGAAGAGAUCGGC....
.......5
(2)设计敲除靶位序列：
正义链 AG-P：5-GCAAATCGTCTTCTCTAGCCGT
GG-3；反义链 AG-D：5-AAACCCACGGCTAGA-
GAAGACGAT-3。其中 GCAA和 CAAA分别为上
游和下游 BbsⅠ酶切形成的粘性末端，以连接线性化
的 pUC19-U3。
引物由上海生工合成，纯化级别为 PAGE。
3.2.2.2构建克隆载体 pUC19-AG
(1)线性化克隆载体 pUC19-U3。使用限制性内
切酶 BbsⅠ酶切克隆载体 pUC19-U3载体，并利用
DNA 片段纯化试剂盒过滤除去 22 bp 片段，回收
3.2 kb的线性化片段；
pUC19-U3部分序列(标注下划线序列为酶切除
序列)
5-……CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATT
GCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGAC
GACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGG
CTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGA
GTTGTGGATGATCCGTGGCAAgggtcttcgagaagacct
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA
GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCA
CCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTTTGTGA
ACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAG
ATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGA
CGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC
CGCCTGGCTAACTAGAGATCTAGAGCGAC……-3
3.2.2.3重组克隆载体 pUC19-AG的构建
(1)插入片段制备。将设计的 AG敲除序列正负
义链(100 μmol/L)等比例混合后，加热到 95℃，3 min，
自然冷却至 40℃以下，得到所需双链 DNA；
(2)正负义链连接反应，连接体系(表 1)。将双链
DNA与酶切纯化后的 pP1C.2载体片段连接、转化
大肠杆菌，构建得到重组 pP1C.2-AG载体；
(3)测序。对重组载体进行测序，确认插入序列的
正确性。
CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除拟南芥 AG基因表达载体的构建
The Construction of Expression Vector of Knocking Out AG Gene in Arabidopsis thaliana by CRISPR-Cas9 595
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1连接反应体系
Table 1 Ligation reaction system
试剂
Reagent
pUC19-AG
插入片段
Insert fragment
dd H2O
总计
Total
用量(μL)
Amount (μL)
20
1
9
30
表 2 EcoRⅠ和 NheⅠ双酶切反应
Table 2 Double enzyme digestion reaction of EcoRⅠ and NheⅠ
试剂
Reagent
pUC19-AG
EcoRⅠ
NheⅠ
10×Buffer
dd H2O
总计
Total
用量(μL)
Amount (μL)
20
1
1
3
5
30
表 3酶切目的片段反应体系
Table 3 Enzyme reaction system of the objective gene fragment
试剂
Reagent
质粒
Plasmid
EcoRⅠ; NheⅠ
10×Buffer
dd H2O
总计
Total
用量(μL)
Amount (μL)
20
1
3
6
30
表 4表达载体连接反应体系
Table 4 Ligation reaction system for the construction of trans-
genic vector
试剂
Reagent
pCAMBIA1302-Cas9
520 bp DNA fragment
10×Buffer
T4 DNA ligase
总计
Total
用量
Amount
1 μg
1 μg
5 μL
2 μL
30 μL
3.2.2.4回收目的片段
利用 EcoRⅠ、NheⅠ双酶切重组载体 pUC19-
AG，DNA回收试剂回收约 520 bp的 DNA片段。
酶切反应：用 EcoRⅠ和 NheⅠ限制性内切酶对
pUC19-AG重组载体双酶切，置于 37℃进行双酶切
反应 3 h，然后置于常温下反应过夜，充分酶切，回收。
酶切反应体系(表 2)如下：
3.2.2.5重组表达载体 pCAMBIA1302-AG载体的构建
(1)线性化表达载体 pCAMBIA1302-Cas9。用
EcoRⅠ和 XbaⅠ先后分别酶切 pCAMBIA1302-Cas9，
回收线性化片段。
酶切反应：用 EcoRⅠ先对 pCAMBIA1302-Cas9
载体酶切，置于 37℃进行双酶切反应 3 h，然后置于
常温下反应过夜，充分酶切，回收线性化载体。NheⅠ
酶切回收的线性化载体，置于 37℃进行双酶切反应
3 h，然后置于常温下反应过夜，充分酶切，回收连接
反应需要的线性化片段。连接体系(表 3)。
(2)胶回收的 520 bp DNA片段与酶切后的 pCA-
MBIA1302-Cas9利用 T4 DNA酶进行连接，构建表
达载体 pCAMBIA1302-AG。
连接反应：连接体系(表 4)，将反应体系置于 16℃
反应一周，大片段充分链接。转化大肠杆菌，筛选阳
性克隆菌落。
3.2.2.6转化与重组载体(pCAMBIA1302-AG)的筛选
取 2-4 μL连接产物转化 E. coli DH5α 感受态
细胞。
热激法转化大肠杆菌与单克隆筛选：用 PCR及
质粒 DNA双酶切鉴定后，提取质粒 DNA，备用。碱
法小量提取质粒 DNA
3.2.3农杆菌转化
采用冻融法转化农杆菌，并进行菌落 PCR 验
证，然后保存菌液，取 700 mL菌液和 300 mL甘油混
于 1.5 mL的 Eppendorf管中，于-20℃保存，用于后
续拟南芥的遗传转化实验。
作者贡献
王晓霞是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；苏哲、岳彩云完成数据分析，负责论文初稿的写
作，并参与研究实验及结果分析；樊金会是项目的构
思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作
与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
感谢山东农业大学林学院和生命科学与技术学
596
院提供实验条件与技术支持。
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