全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-10
基金项目：国家“十一五”科技支撑计划课题（2006BAK02A13）
作者简介：徐君怡（1979-），女，工程师，从事生物安全检验研究；E-mail：skyxjy@yahoo.com
沙门氏菌 、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌
O157：H7 是引起细菌性食物中毒的常见致病菌。我
国近五年食物中毒统计资料表明，细菌性食物中毒
占食物中毒总数的 50％左右，其中沙门氏菌食物中
毒居首位，且多发生在食用畜禽肉、禽蛋类。沙门氏
菌主要通常导致健康成人的自身限制性肠胃炎，偶
变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和
肠出血性大肠杆菌
徐君怡 曹际娟 郑秋月 刘淑艳 徐杨
（辽宁出入境检验检疫局，大连 116015）
摘 要： 应用多重 PCR 反应（multiplex PCR，mPCR）结合变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid
chromatography，DHPLC）技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7的快速检测方法。以编码
沙门氏菌的 fimY基因、编码空肠弯曲菌的 gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌 O157：H7的 rfbE基因为靶基因，选择 3对
引物，建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7的多重 PCR 体系，扩增产物分别为
284、159和 499 bp，并验证了该多重 PCR 具有特异性。沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7标准菌株稀
释成不同梯度，做灵敏度检测。试验结果表明该方法有很好的特异性，且灵敏度高，检测限可达到：沙门氏菌 1.5 CFU/ml、
空肠弯曲菌 15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌 O157：H7 15 CFU/ml。在随机采集的 226份冷冻鸡肉类样品中，检出了 7份
样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌 O157：H7阳性。研究建立的多重 PCR -DHPLC
方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7的快速检测。
关键词： 沙门氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠杆菌 O157：H7 变性高效液相色谱
Identification of Salmonella，Campylobacter jejuni and
Enterohemorrhagic E.coli by Denaturing High-performance
Liquid Chromatography
Xu Junyi Cao Jijuan Zheng Qiuyue Liu Shuyan Xu Yang
（Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of China，Dalian 116015）
Abstract： A new molecular technique for the analysis of Salmonella，Campylobacter jejuni and enterohemorrhagic
E.coli based on the separation of PCR -amplified target fragments by denaturing high-performance liquid chromatography
（DHPLC） was reported. A multiplex PCR （mPCR） assay was developed by using 3 sets of primers that specifically
amplify segments of the fimY，gyrA and rfbE genes，the PCR Products of which were 284，159 and 499 bp，respectively.
Analysis of 22 strains demonstrated that this PCR system was specific. The detection limit of the mPCR was 1.5
CFU/ml for Salmonella，15 CFU/ml for Campylobacter jejuni and 15 CFU/ml for enterohemorrhagic E.coli 0157:H7. 10
of Campylobacter jejuni and 1 of O157：H7 were detected in 226 chicken meat samples. These results indicated that the
multiplex PCR -DHPLC assay can be used for specific and sensitive detection of salmonella，Campylobacter jejun and
enterohemorrhagic E.coli O157：H7.
Key words： Salmonella Campylobacter jejun Enterohemorrhagic E.coli O157：H7 Denaturing high-performance
liquid chromatography
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
尔可导致幼儿和老年人死亡 [1]。 肠出血性大肠杆菌
O157：H7 感染性腹泻是近年来新发现的危害严重
的肠道传染病，它除引起腹泻、出血性肠炎外，还可
发生溶血性尿毒综合症（HUS）、血栓性血小板减少
性紫癜 （TTP）等严重的并发症 ，后者病情凶险 ，死
亡率高，已经逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫
生问题 [2]。 90%以上的弯曲菌感染是由空肠弯曲菌
引起的，可导致人类急性肠炎、格林巴利综合症、反
应性关节炎、Reiter’s 综合症等多种疾病 [3]。 目前 ，
沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7
已成为我国进出口肉禽类产品检测的主要病原菌。
沙门氏菌 、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌
O157：H7 感染的初期症状非常类似，对这 3 种致病
菌的区分造成了一定的困难。 对沙门氏菌、空肠弯
曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7 的检测， 传统
的培养方法包括增菌、生理生化鉴定、血清学鉴定
等操作，但是所需检验时间长；而且病原菌在食品
样品中存在的数量相对较少，使用常规选择性平板
上挑取可疑菌落的方法也可能会造成阳性菌株的
漏检。 空肠弯曲菌生长条件要求苛刻，需要在微需
氧环境下培养 （5% O2、10% CO2 和 85% N2），并且
在一些特定条件下，空肠弯曲菌还存在着一种 “存
在但不可培养 ”的状态 [4]，这更是传统分离培养检
测方法无法克服的难题。因此，在检验检疫工作中，
急需一种灵敏的快速检测方法。
本研究的目的是建立一种简单准确且快速灵
敏的多重 PCR 反应， 结合变性高效液相色谱技术
（DHPLC）方法，鉴定沙门氏菌 、空肠弯曲菌和肠出
血性大肠杆菌 O157：H7，克服上述的难题。 DHPLC
利用样品分子对固定相亲和力的差异，在用流动相
洗脱时，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子
在固定相上移动速率不同，从而达到分离的目的 [5]。
根据各种食源性致病微生物的特有基因组序列，设
计引物进行 PCR 扩增 ，利用 DHPLC 检测 ，达到快
速检测食品中病原微生物的目的。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 标准菌株及标准菌株基因组 DNA 分
别购自美国 ATCC 标准生物品收藏中心和中国医
学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）（表 1）。 弯曲
菌属的菌株在弯曲菌选择性培养基上于 42℃微需
氧环境下培养（5% O2、10% CO2 和 85% N2）24 h；其
他的菌株在胰蛋白大豆琼脂 （TSA）上于 37℃培养
24 h。

 



Campylobacter jejuni ATCC 33291 1

 DNA Campylobacter jejuni genomic DNA ATCC 33560D-5 1

Campylobacter coli ATCC 43478 1

 DNA Campylobacter coli genomic DNA ATCC BAA-1061D 1

Campylobacter fetus ATCC 27374 1

 DNA Campylobacter lari genomic DNA ATCC BAA-1060D 1

Escherichia coli ATCC 25922 1

Enteropathogenic E.coli ATCC 43887 1

Enterotoxigenic E.coli ATCC 35401 1

Enterohemorrhagic E.coli ATCC 35150 1
 !
Enteroinvasive E.coli ATCC 43893 1
"#$%
Salmonella enteritidis ATCC 13076 1
&’(#$%
Salmonella. typhimurium ATCC 49416 1
)*+#$%
Salmonella. cholerae ATCC 10708 1
,-.’(#$%
Salmonella. enterica paratyphi A ATCC 9150 1
/012
Proteus vulgaris CMCC 49027 1
3"456%
Yersinia enterocolitica ATCC 9610 1
.78
Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 1
*+8
Vibrio cholerae CMCC 93-3 1
9:;<=>%
Listeria innocua ATCC 33090 1
?@ABCD<=>%
Liateria monocytogenes ATCC 19111 1
EFGHIJ
Staphylococcus aureus ATCC 29213 1


表 1 试验菌种及其编号
128
2009年第 3期
1.1.2 主要试剂 细菌基因组 DNA 小量纯化试剂
盒（TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extrac-
tion kit），Taq 酶及 PCR 缓冲液等试剂均购自宝生
物工程 （大连 ）有限公司 ；弯曲菌培养基 （Campylo-
bacter Agar Base）购自美国 BD 公司；布氏肉汤购自
北京陆桥技术责任有限公司。
1.1.3 主要仪器 全自动细菌培养系统 MART-II
（Mart Microbiology B.V.公司 ，荷兰 ）；普通 PCR 仪
PE 24000（PerkinElmer 公司 ，美国 ）；变性高效液相
色谱仪 NAV-99-4500（Transgenomic 公司，美国）；高
速离心机 Centrifuge 5804（Eppendorf 公司，德国）。
1.2 引物合成
根据 GenBank 上发表的序列，应用 Primer Pre-
mier 5.0 软件设计 3 对引物 ， 分别针对沙门氏菌
fimY 基因、 空肠弯曲菌 gyrA 基因和肠出血性大肠
杆菌 O157：H7 rfbE 基因（表 2）。引物序列由宝生物

   5´3´ bp
Salmonella fimY GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA
TCATCGCACCGTCAAAGGAACC
284
Campylobacter jejuni gyrA CAAATAAAGTTAGAGGTAGAATGT
CCATAAGCACTAGCTAGCTGAT
159
Enterohemorrhagic E.coli rfbE ATTGCGCTGAAGCCTTTG
CGAGTACATTGGCATCGTG
499


表 2 目的基因及其引物序列
工程（大连）有限公司合成。
1.3 细菌细胞计数
分别挑取 42℃微需氧环境下培养 24 h 的空肠
弯曲菌菌落和 37℃条件下培养的沙门氏菌、肠出血
性大肠杆菌 O157：H7 菌落，悬浮于 5 ml 8.5%生理
盐水中 ，分别调整菌液浓度至 0.5 麦氏单位 （相当
于 1.5×108 CFU/ml）， 然后 10 倍梯度稀释成 1×107
CFU/ml、1×106 CFU/ml、1×105 CFU/ml 等浓度的纯
菌液。
1.4 模板 DNA 制备
表 2 中所列试验菌种经培养后按细菌基因组
DNA 小量纯化试剂盒说明书的方法进行基因组
DNA 提取。
1.5 多重 PCR（multiplex PCR，mPCR）扩增条件
经过优化得到的最佳反应体系 ：10×PCR 缓冲
液 3 μl，引物 （10 μmol/L）各 1 μl，dNTP （10 mmol/
L）4 μl，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl）0.25 μl， 模板
DNA 2 μl， 加 ddH2O 补足 25 μl。 最佳反应条件 ：
94℃ 3 min；94℃ 60 s，56℃ 60 s，72℃ 60 s，35 个循
环；72℃ 7 min 结束反应；4℃保存反应产物。
1.6 DHPLC 分析条件
色谱柱 ：PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱 （4.6
mm×50 mm，粒度 3 μm）；柱温为 50℃。 流动相：0.0
min，55% 缓冲溶液 A，45% 缓冲溶液 B；0.5 min，
50.2% 缓冲溶液 A，49.8% 缓冲溶液 B；3.6 min，
41.8% 缓冲溶液 A，58.2% 缓冲溶液 B；6.8 min，
38.2% 缓冲溶液 A，61.8% 缓冲溶液 B；9.9 min，
36.3% 缓冲溶 液 A，63.7% 缓冲溶液 B；13 min，
35% 缓冲溶液 A，65% 缓冲溶液 B。 流速 ：0.9 ml/
min；检测器：荧光检测器（光源：150W Xenon 灯，激
发谱带宽 ：15 nm，发射谱带宽 ：15.3 nm，检测灵敏
度：在波长 350 nm积分 2 s）；上样量：PCR产物 5 μl。
1.7 多重 PCR 特异性分析
以表 1 中所列各菌的基因组 DNA 为模板 ，按
照“1.5 多重 PCR 扩增条件”和“1.6 DHPLC 分析条
件”进行病原菌的 mPCR-DHPLC 特异性试验。
1.8 多重 PCR 敏感性分析
按照“1.3 细菌细胞计数方法”分别对空肠弯曲
菌 ATCC 33291、肠炎沙门氏菌 ATCC 13076 和肠出
血性大肠杆菌 O157：H7 ATCC 35150 进行计数 ，将
菌悬液浓度调整至 1.5×105 CFU/ml， 并进行 10 倍
系列梯度稀释。每个梯度菌液采用试剂盒提取法制
备模板 DNA，进行 PCR 检测。
1.9 实际样品检测
采用多重 PCR-DHPLC 方法和国家标准方法对
随机采集的 226 份冷冻鸡肉类样品进行同时检测，
徐君怡等：变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 129
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
并对检测结果进行比较。
2 结果与分析
2.1 特异性试验
取表 1 中所列的空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆
菌和沙门氏菌等 22 株参考菌株的 DNA 进行 mPC-
R-DHPLC 检测 ， 多重 PCR 特异性检测结果的
DHPLC 图谱如图 1 所示。 PCR 扩增后可在一次反
应中同时出现空肠弯曲菌特异性吸收峰（159 bp）、
沙门氏菌属特异性吸收峰 （284 bp）和肠出血性大
肠杆菌 O157：H7 特异性吸收峰（499 bp）。而非沙门
氏菌、 空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 O157：H7
以及空白水对照的检测结果均为阴性。上述结果表
明， 适合于 mPCR-DHPLC 检测的引物可以特异性
扩增检测并鉴别空肠弯曲菌、沙门氏菌和肠出血性
大肠杆菌 O157：H7，具有很好的特异性。 图 2 箭头
所示为 3 种致病菌单一 PCR 产物的 DHPLC 峰形
图谱。
2.2 灵敏度试验
按照“1.3 细菌细胞计数”方法分别对空肠弯曲
菌 ATCC 33291、肠炎沙门氏菌 ATCC 13076 和肠出
血性大肠杆菌 O157：H7 ATCC 35150 进行计数 ，将
菌悬液浓度调整至 1.5×105 CFU/ml， 并进行 10 倍
系列梯度稀释。每个梯度菌液采用试剂盒提取法制
备模板 DNA，进行 PCR 检测。将含菌量分别为 1.5×
105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×101、1.5×100 CFU/ml
的模板 DNA，进行 PCR-DHPLC 检测。 沙门氏菌的
检测限为 1.5 CFU/ml， 空肠弯曲菌的检测限为 15
CFU/ml， 肠出血性大肠杆菌 O157：H7 的检测限为
15 CFU/ml（表 3）。
2.3 实际样品检测
采用多重 PCR-DHPLC 方法和国家标准方法对
随机采集的 226 份冷冻鸡肉类样品进行同时检测。
结果显示， 采用多重 PCR-DHPLC 方法检出 7 份样
1. 包含空肠弯曲菌 ATCC 33291， 肠炎沙门氏菌 ATCC
13076，肠出血性大肠杆菌 O157：H7 ATCC 35150；A.空肠弯
曲菌特异性吸收峰 ；B.沙门氏菌特异性吸收峰 ；C.肠出血性
大肠杆菌 O157：H7 特异性吸收峰 ；2. 结肠弯曲菌 ATCC
43478；3. 大肠杆菌 ATCC 25922；4. 肠致病性大肠杆菌
ATCC 43887；5.肠产毒性大肠杆菌 ATCC 35401；6.肠侵袭性
大肠杆菌 ATCC 43893；7. 普通变形杆菌 CMCC 49027；8.小
肠结肠炎耶尔森氏菌 ATCC 9610；9. 副溶血性弧菌 ATCC
17802；10.单核细胞增生李斯特氏菌 ATCC 19111
图 1 多重 PCR-DHPLC 峰形图谱
时间 （min ）
（A ）
时间 （min ）
（B ）
时间 （min ）
（C ）
A.空肠弯曲菌；B.沙门氏菌；C.肠出血性大肠杆菌 O157：H7
图 2 3 种致病菌单一 PCR 产物的 DHPLC 峰形图谱
PCR-DHPLC


 CFU/ml





 O157:H7
1.5×10
+ + +
1.5×10 + + +
1.5×10 + + +
1.5×10 + + +
1.5×10 + + +
1.5×10 + - -


表 3 细菌细胞计数与 PCR-DHPLC 检测结果灵敏度
mPCR-DHPLC
 GB
 

 




 
O157:H7





 
O157:H7


226 226 226 226 226 226


7 10 1 7 4 1
(%) 3.1 4.4 0.4 3.1 1.8 0.4


表 4 采用 mPCR-DHPLC 和 GB 方法对 3 种致病
菌检测结果的比较
130
2009年第 3期
品为沙门氏菌阳性、10 份样品为空肠弯曲菌阳性、
1 份样品为肠出血性大肠杆菌 O157：H7 阳性，采用
国家标准方法检出 7 份样品为沙门氏菌阳性，4 份
样品为空肠弯曲菌阳性，1 份样品为肠出血性大肠
杆菌 O157：H7 阳性。 对其余多重 PCR-DHPLC 检出
为阳性，而国家标准方法检出为阴性的样品 ，采用
增加筛选可疑菌株数量， 利用免疫学分析试剂条
（VIDAS）和快速生化鉴定 （API）等多种确认方法 ，
均证实为阳性结果（表 4）。
3 讨论
传统的细菌培养和鉴定是一项既耗时又复杂
的工作，由于某些生化试剂、血清等质量不稳定、特
异性不好等因素，经常给鉴定的结果带来差异。 目
前国内外针对食源性致病菌快速检测方法很多，如
PCR-凝胶电泳法、实时荧光 PCR 法、荧光免疫检测
法（VIDAS）、胶体金免疫测试条、基因芯片测试法、
API 生化鉴定卡、全自动细菌鉴定仪等。 尽管检测
方法很多，但各种方法都存在各自的优缺点。 PCR-
凝胶电泳法快捷 、成本低 ，但繁琐 ，灵敏度相对较
低， 且电泳检测步骤是极大的污染源 ； 实时荧光
PCR 技术具有特异性强，灵敏度高等优势，但检测
成本较高， 荧光探针保存时间较短；VIDAS 法和胶
体金免疫检测条法简单、快捷，但检测成本极高，且
均存在着假阳性结果的问题；API 生化鉴定卡虽然
质量稳定，但鉴定时认为影响因素较多，往往不同
的操作者结果不一；细菌的自动鉴定仪器重现性较
好，但成本极高，且由于只是局限在几个生化反应，
相似的菌株间鉴别存在难度和盲区；基因芯片测试
法虽然可以达到高通量检测的目的，但检测成本极
高，且实用性存在需解决的问题。 由于传统方法和
其他快速检测方法的局限性，微生物学检测工作者
都不断地致力于通过分子遗传方法对不同微生物
样品进行鉴定和分析。
变性高效液相色谱技术（DHPLC）是一种简单、
快速、非凝胶的核酸分析方法，该技术灵敏度和特
异性非常高， 产物分子量 1%大小的片段即能够被
分离检出。 意大利的 Franciosa 等 [6]报道了利用变性
高效液相色谱鉴定肉毒杆菌神经毒素 A、B、E 和 F
型基因的研究， 并指出 DHPLC 技术可以用于食品
病原微生物的检测。 Hurtle 等 [7]利用 DHPLC 能够分
析 rRNA 序列变化的特性，建立了鼠疫耶尔森氏菌
（Yersinia pestis）和炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的特
异性吸收谱图，为这 2 种菌的高通量检测提供了新
的方法。曹际娟等 [8]利用 DHPLC 对动物源性饲料中
沙门氏菌和志贺氏菌进行高通量检测，是国内首次
报道的利用 DHPLC 进行微生物检测
本研究是利用多重 PCR-DHPLC 方法对食源性
致病菌进行快速检测的创新性研究，且此方法对空
肠弯曲菌的检出率高于传统国家标准方法的检测
结果。 分析原因，一方面可能是因为以往检测技术
上的不完善和经验方面的不足导致检出率偏低，另
一方面可能是因为传统检测方法对于处于不可培
养状态的空肠弯曲菌不具有检测能力，故未能如实
反映样品中空肠弯曲菌的实际污染状况。而 mPCR-
DHPLC 方法对于处于不可培养状态的空肠弯曲菌
同样具有检测的能力，这一点对于开展冷冻食品中
空肠弯曲菌的污染状况监测具有很大的价值。
参考文献
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8 曹际娟，徐君怡，等.饲料工业，2008，29：50~53.
徐君怡等：变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 131