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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
细胞衰老是一种不可逆的生长停滞状态，与人
类衰老和肿瘤形成有着密切的关系［1］。体外培养的
人体成纤维细胞（Human diploid fibroblasts，HDFs）
像大部分体内细胞一样，在经历有限次的细胞分裂
后便失去增殖能力，进入复制性衰老状态。衰老细
胞的形态变化主要体现在细胞皱缩，膜通透性、脆
性增加，核膜内折，细胞器数量特别是线粒体数量
减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积等。
多种应激因素可以诱导细胞衰老的发生，目
收稿日期 ：2014-04-22
作者简介 ：李超群，男，硕士研究生，研究方向 ：DNA 损伤修复 ；E-mail ：BPRC_LI@126.com
通讯作者 ：裴华东，男，博士，研究员，博士生导师，研究方向 ：DNA 损伤修复与肿瘤细胞代谢 ；E-mail ：peihuadong@hotmail.com
肖冬光，男，硕士，教授，博士生导师，研究方向 ：现代酿造技术和微生物资源开发 ；E-mail ：xdg@tust.edu.cn
细胞衰老相关基因 MTMR2 功能初探及相互作用
蛋白的鉴定
李超群1  陈亚丽2  肖冬光1  裴华东1，2
（1. 天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457 ；
2. 北京蛋白质组研究中心 蛋白质组学国家重点实验室，北京 100850）
摘 要 ： 过氧化氢（H2O2）诱导的细胞衰老在肿瘤形成中有重要作用，为进一步研究其内在机制，通过全基因组 shRNA 文
库筛选出与之相关的 MTMR2（Myotubularin-related protein 2）基因，并通过 β-半乳糖苷酶染色试验证实其在 H2O2 诱导的细胞衰老
中发挥重要作用。通过克隆质粒、表达纯化并结合质谱分析，发现了 MTMR2 的一个可能的重要相互作用蛋白 14-3-3，并通过生化
方法对两者的相互作用进行确认。
关键词 ： 过氧化氢 细胞衰老 MTMR2 shRNA 文库筛选 shRNA
MTMR2 Interacts with 14-3-3 and Regulates H2O2 Induced
Cell Senescence
Li Chaoqun1 Chen Yali2 Xiao Dongguang1 Pei Huadong1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory Industial Microbiology College
of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457 ；2. State Key Laboratory of Proteomics，Beijing Proteome
Research Center，Beijing 100850）
Abstract: H2O2-induced cell senescence plays an important role in tumorigenesis. To further study the underlying mechanism, we
identified five relevant members through a genome wide shRNA screening and took MTMR2（Myotubularin-related protein 2） as an example
to figure out its function in H2O2-induced cell senescence. By plasmid construction and expression in combination with purification and mass
spectrometry, we found a significant interacting protein of MTMR2 ：14-3-3 proteins family, and their interaction was then confirmed using
biochemical methods.
Key words: H2O2 Cell senescence MTMR2 shRNA pool screening shRNA
前研究最广泛的是癌基因相关的衰老，癌基因的过
表达可促进细胞的增殖及肿瘤的形成，也可诱导细
胞趋向衰老，即癌基因诱导的细胞衰老（Oncogene-
induced senescence，OIS），从而抑制肿瘤的形成［2］。
细胞可通过多种机制调控 OIS 的发生。例如，癌基
因可激活 p16-Rb 途径，抑制 E2F 并最终导致细胞
周期阻滞及 OIS 的发生。此外，癌基因的表达可激
活 Arf-p53 途径，引起细胞凋亡或 OIS 的发生。p53
也 可 通 过 DNA 损 伤 应 答（DNA damage response，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期202
DDR）等不依赖于 Arf 的途径而被激活，研究证实
此过程同样在 OIS 的发生中发挥重要作用［3］。当
前，对于过氧化氢（H2O2）诱导的细胞衰老研究较
少，H2O2 常用于获得短时间内氧化应激诱导的细胞
衰老［4］。但是 H2O2 诱导细胞衰老的具体分子机制
仍不是很清楚。因此，深入研究 H2O2 诱导的衰老机
理，筛选参与该过程的相关基因，对进一步理解人
类的衰老和年龄相关性疾病的诊断治疗具有重要意
义。鉴于 shRNA 文库技术已经被广泛应用于筛选参
与某一信号通路或某一表型的基因［5］，本研究也采
用 shRNA 文库筛选 H2O2 诱导细胞衰老过程中的相
关基因，并对筛选结果进行生化分析，旨在为进一
步研究其内在机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、文库与细胞 带有 FLAG 标签的真核
表达载体 pIRES 为本实验室保存，人胚肾细胞 293T
和人胚肺成纤维细胞 WI38 均购自 ATCC。shRNA 文
库购自 Dharmacon 公司。MTMR2（Myotubularin-rel-
ated protein 2）shRNA 靶标序列 ：5-TCAGAGAATT-
CAGTGCATACA-3。
1.1.2 主要试剂 DNA 限制性内切酶、T4 DNA 连
接酶购自 NEB 公司 ；PEI 转染试剂购自 Invitrogen 公
司 ；Flag 标签抗体、Flag M2 Beads 及 H2O2 溶液购自
Sigma（中国）；14-3-3 蛋白抗体购自 Abcam（中国）；
DNA 快速纯化回收试剂盒，质粒提取试剂盒购自
Promega 公司，酶切片段回收试剂盒购自 OMEGA 公
司 ；细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色试剂盒（碧云天生
物技术研究所），其他常规试剂均为进口或国产分析
纯级产品。
1.2 方法
1.2.1 文库筛选 在 293T 细胞中将 shRNA 文库包
装病毒后，收集病毒上清，感染 WI38 细胞，用 100
μmol/L H2O2 处理 2 h 后，恢复培养 10 d 至单细胞克
隆形成，挑取培养皿上长出的单克隆，扩大培养，
提取基因组 DNA，PCR 扩增 shRNA 靶向序列，将
PCR 产物克隆到 T 载体，测序分析。
1.2.2 β-半乳糖苷酶染色 6 孔板中培养 WI38 细胞，
吸除细胞培养液，用 PBS 洗涤 1 次，加入 1 mL β-
半乳糖苷酶染色固定液，室温固定 15 min。吸除细
胞固定液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 3 min。 吸
除 PBS，每孔加入 1 mL 染色工作液［使用聚丙烯
（polypropylene）容器配制染色工作液，染色工作液
的配制方法参考试剂盒说明书］。37℃孵育过夜，用
Parafilm 或保鲜膜封住 6 孔板防止蒸发。普通光学显
微镜下观察。
1.2.3 pIRES-MTMR2 表达质粒的构建 以 cDNA 文
库为模板，分别设计酶切位点为 EcoR I 和 Sal I 的
引物序列（下划线部分为插入的酶切位点）：sense ：
5-CCGGAATTCATGACAAATATGCAGAAGATTT-3
（EcoR I）；anti-sense ：5-ACGCGTCGACGGATGGAG
AAGAGCTCGAGCTGCG-3（Sal I）， 通 过 PCR 扩 增
MTMR2 编码序列。PCR 程序：94℃ 4 min；94℃ 40 s，
60℃ 1 min，72℃ 2 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。
PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化并用 EcoR I 和
Sal I 限制性内切酶进行双酶切，载体质粒 pIRES 进
行同样的双酶切。回收酶切的片段和质粒经 T4 连
接酶过夜连接。最后连接体系转化大肠杆菌 DH5α，
挑取阳性克隆提取质粒，进行酶切和基因测序鉴定，
重组质粒命名为 pIRES-Flag-MTMR2。
1.2.4 pIRES-Flag-MTMR2 的表达纯化与质谱鉴定
用转染试剂 PEI 将 pIRES-Flag-MTMR2 表达质粒转
染 293T 细胞，6 h 后更换新鲜培养基，24 h 后将细
胞从培养皿刮下，经离心收集到 EP 管中，PBS 洗 2
次，再用 NETN 裂解液［20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），
100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5% NP-40］进
行裂解，20 min 后，离心收取上清，加入 5×SDS
loading buffer，100℃煮沸 8 min，样品经 SDS-PAGE
电泳和 Western blot 检测。若表达成功，则依上述步
骤，转染 12 个培养皿（直径 10 cm）293T 细胞，收
取总蛋白并加入 80 μL 的 Flag Beads 进行 IP 纯化，
4℃缓慢旋转孵育 4 h，然后离心除去上清，将 Flag
Beads 用 NETN 洗涤 3 次，最后在 Flag Beads 中加入
60 μL 的 2×SDS loading buffer，100 ℃ 煮 沸 15 min。
样品进行 SDS-PAGE 电泳，经考马斯亮蓝染色和
Western blot 确认后，剩余样品再经 SDS-PAGE 电泳，
切胶后进行质谱分析。
1.2.5 免疫印迹分析（Western blot） 将 Flag-MTM-
R2 蛋白样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，凝胶电泳结
2014年第11期 203李超群等：细胞衰老相关基因MTMR2 功能初探及相互作用蛋白的鉴定
束后，自上而下按照滤纸-胶-膜-滤纸的顺序在半
干转移仪上放置好，转膜 30 min 后将膜取出，放入
5% 脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75 r/min）封闭 1 h
以消除非特异背景。封闭完毕，加入 anti-Flag 的一抗，
于脱色摇床 4℃孵育（75 r/min）过夜，使一抗与特
异蛋白结合。回收一抗，用 TBST 洗 3 次（75 r/min），
每次 5-10 min。加入二抗，于脱色摇床孵育 1 h，使
二抗与一抗结合。用 TBST 洗 3 次。最后加入 ECL
试剂，于暗室压片曝光。
1.2.6 细胞免疫荧光试验 将 WI38 细胞接种于放
有盖玻片的 6 孔细胞培养板。细胞密度适中且完全
贴壁，用 4% 多聚甲醛固定 20 min，0.25% Triton X-100
透膜 15 min，用 1% BSA 封闭 1 h，一抗室温孵育 1 h，
荧光二抗室温孵育 1 h。取下盖玻片，细胞面朝下放
在滴有 50% 甘油 PBS 的载玻片上封片。荧光显微镜
下观察。
2 结果
2.1 shRNA文库筛选结果
经 基 因 组 范 围 的 文 库 筛 选， 发 现 一 个 基 因
MTMR2 和 H2O2 诱导的细胞衰老有关。如图 1 所示，
正常的 WI38 用 100 μmol/L H2O2 处理 2 h，培养 3 d 后，
用 β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Senescence β-Galacto-
sidase Staining Kit）染色，能发现 SA-β-Gal（Senesc-
ence-associated β-galactosidase）活性水平上调，表明
许多细胞发生了衰老。而当细胞转入了靶向 MTMR2
的 shRNA 敲低 MTMR2 蛋白水平时，SA-β-Gal 的活
性水平显著降低（图 1），此外，在过表达 MTMR2
的 WI38 细胞中，没有观察到 SA-β-Gal 活性水平的
变化，这可能是因为 WI 38 细胞内源 MTMR2 的量
已经足够使细胞衰老。以上结果表明，MTMR2 与
H2O2 诱导的细胞衰老紧密相关。
2.2 MTMR2 编码基因的扩增与表达质粒的构建
重组质粒转化大肠杆菌 DH5α，挑取阳性克隆
并提取质粒，利用 EcoR I 和 Sal I 进行酶切鉴定，双
酶切重组质粒后产生一条线性载体条带和一条约
1 900 bp 的目的条带（图 2）。对于酶切鉴定正确的
重组质粒进行测序，结果表明插入的目的基因核苷
酸序列完全正确。
MTMR2
shRNA: Control
Control shRNA MTMR2 shRNA
MTMR2
β-actin
A B C
A ：MTMR2 shRNA 下调 MTMR2 蛋白表达水平 ；B ：WI38 细胞感染 Control
shRNA 后的染色结果 ；C ：WI38 细胞感染 MTMR2 shRNA 后的染色结果
图 1 MTMR2 调控 WI38 细胞衰老
2000
bp
1M 2
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：pIRES/Sal I+EcoR I ；2 ：pIRES-Flag-
MTMR2/ Sal I+EcoR I
图 2 重组表达质粒 pIRES-Flag-MTMR2 酶切分析
2.3 Flag-MTMR2的表达纯化与质谱分析
将 重 组 质 粒 pIRES-Flag-MTMR2 转 染 293T 细
胞，24 h 后收集蛋白进行 Western blot 检测，分别用
标签抗体 anti-Flag 和内源抗体 anti-MTMR2 检测重组
蛋白的表达。结果（图 3）显示，Flag 抗体检测到
Flag-MTMR2 的表达，而 MTMR2 抗体则分别检测到
了内源和外源 MTMR2 蛋白的表达，表明重组质粒
pIRES-Flag-MTMR2 表达成功。
Flag-MTMR2
1 2
a b
3 4
MTMR2
β-actin
a ：anti-FLAG 抗体检测 ；b ：anti-MTMR2 抗体检测 ；1，3 ：对照组转染空载
体 pIRES 质粒 ；2，4 ：试验组转染 pIRES-Flag-MTMR2 重组质粒
图 3 Flag-MTMR2 融合蛋白的表达检测
在重组蛋白成功表达的基础上，在 12 盘（直
径 10 cm 细胞培养皿）293T 细胞中转染重组质粒
pIRES-Flag-MTMR2，24 h 后 收 集 蛋 白， 使 用 Flag
beads 进行 IP 纯化，样品经 SDS-PAGE 电泳后，通
过考马斯亮蓝染色和 Western blot 检测 Flag-MTMR2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期204
蛋白的纯化效果。结果（图 4）显示，考马斯亮蓝
染 色 和 Western blot 结 果 表 明 经 过 IP 纯 化，Flag-
MTMR2 主带明显，并结合许多相互作用蛋白。
3-3 蛋白与 MTMR2 的定位关系，发现二者可以共
定位（图 5）。此外，通过内源的免疫共沉淀试验检
测它们之间的相互作用，结果（图 6）显示，当用
MTMR2 的抗体做免疫沉淀时，能共沉淀下来 14-3-
3 蛋白的 θ 亚基，表明在细胞内 MTMR2 能够与 14-
3-3 蛋白的 θ 亚基相互作用，而 MTMR2 与 14-3-3 蛋
白其它亚基的相互作用，仍需进一步的试验确证。
1 2 M
kD
100
70
55
40
A B
3 4
1 ：总蛋白裂解液 ；2 ：Flag-beads 纯化后产物 ；M ：蛋白 Marker ；3 ：对照组 ；
4 ：Flag-beads 纯化后产物 ；箭头指示为 Flag-MTMR2 位置
图 4 纯化后样品的 SDS-PAGE（A）及 FLAG 抗体检测
的 Western blot 检验（B）
14-3-3 MTMR2 Merge
图 5 免疫荧光技术证明 14-3-3 蛋白与 MTMR2 蛋白共定位
MTMR2
14-3-30
IP
IgG 14-3-3θ cell lysis
图 6 内源免疫共沉淀试验证明 14-3-3 θ 亚基与 MTMR2
相互作用
3 讨论
H2O2 诱导的细胞衰老一直是人们研究的热点，
有报道指出 H2O2 处理 IMR90 细胞会使抑癌蛋白 p53
表达水平短暂增高，细胞周期依赖性蛋白激酶抑制
剂 p21 表达水平持续增强以及抑癌蛋白 Rb 的去磷
酸化［6］。也有文献报道 H2O2 通过调节 TGF-β1 的表
达水平影响细胞衰老［7］。
本试验利用 H2O2 诱导的细胞衰老模型，通过
shRNA 文库筛选，鉴定了 1 个可能与细胞衰老相
关 的 基因 MTMR2。MTMR2 是 肌 微 管 素 蛋 白 家 族
的一员，可以编码一种酪氨酸磷酸酶［8］，据报道，
MTMR2 可以将底物 PI-3-P 和 PI-3，5-P2 分别去磷酸
化成为磷脂酰肌醇和 PI-5-P，并且在 AKT 通路中发
挥重要的作用，MTMR2 的过表达可以抑制表皮生长
因子受体（EGFR）的降解，促进 AKT 的持续激活［9］。
该基因的突变会导致 4B 型进行性腓骨肌萎缩，这
是一种常染色体隐性脱髓鞘神经病［10］。也有报道该
将确认纯化成功的样品，再经 SDS-PAGE 和考
马斯亮蓝染色后，切胶进行质谱分析，鉴定 MTMR2
的相互作用蛋白。结果表明，在质谱结果中，除含
有已经确认的 MTMR2 的一个相互作用蛋白 SBF1
（Myotubularin-related protein 5）之外，还发现了高丰
度的 14-3-3 蛋白的 4 个亚基（表 1）。据报道，14-
3-3 蛋白家族在真核细胞中广泛表达并高度保守，它
通过介导或调解蛋白相互作用，在细胞周期、凋亡、
信号转导等方面发挥重要的作用。猜测 MTMR2 可
能通过与 14-3-3 蛋白相互作用而在细胞衰老过程中
发挥功能。
表 1 Flag-MTMR2 纯化后的质谱结果
Protein Peptides Coverage（%）
MTMR2 43 63.45
14-3-3 protein θ 15 50.61
14-3-3 protein ε 10 43.14
14-3-3 protein δ/ζ 10 38.78
14-3-3 protein γ 10 34.01
14-3-3 protein β/α 9 29.67
LDH 1 10 29.22
SBF1 8 29.12
GRP78 8 14.83
SHMT2 5 12.22
2.4 MTMR2与14-3-3蛋白相互作用的验证
为进一步确证 MTMR2 与 14-3-3 蛋白的相互作
用，首先在 WI38 细胞中通过免疫荧光技术验证 14-
2014年第11期 205李超群等：细胞衰老相关基因MTMR2 功能初探及相互作用蛋白的鉴定
蛋白可能与 DNA 损伤修复相关［11］。目前，人们对
该蛋白的了解仍然很少。我们通过质谱并结合生化
试验鉴定到 MTMR2 的一个可能的重要相互作用蛋
白 14-3-3，而 14-3-3 蛋白家族在真核细胞中广泛表
达并高度保守，通过识别磷酸化的苏氨酸 / 丝氨酸
而与靶蛋白结合［12］。14-3-3 蛋白可以（1）作为接
头分子诱导蛋白质之间的相互作用［13］；（2）调节蛋
白的亚细胞定位［14］；（3）激活或抑制酶的活性［15］。
通过这些功能进而影响信号转导、细胞周期调控、
凋亡、细胞应激等许多生命活动，这对我们进一步
研究 MTMR2 在细胞衰老中的功能以及 H2O2 诱导细
胞衰老的分子机制具有重要指导意义。
4 结论
本研究通过 shRNA 文库筛选，鉴定了 1 个可能
与 H2O2 诱导的细胞衰老相关的基因 MTMR2，并对
其进行了进一步的验证，发现其重要的相互作用蛋
白，为深入研究 H2O2 诱导细胞衰老的内在机制提供
了新的方向。
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（责任编辑 马鑫）