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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):219-224
金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类普遍
存在于生物体内的富含半胱氨酸、相对分子质量较
低的金属结合蛋白，具有高诱导特性和多种生物学
功能。目前比较明确的是 MT 具有清除体内自由基、
参与体内微量元素代谢、解除重金属的毒性、增强
机体各种不良状态的适应能力、调控机体生长发育
和细胞代谢等功能，MT 还参与纤维化疾病、神经退
行性疾病及肿瘤的发生发展［1］。采用基因工程方法
规模化生产制备金属硫蛋白，对其应用开发和作用
机理的研究具有重要的意义。目前，不同来源 MT
基因先后被克隆入不同的表达载体，在大肠杆菌中
进行表达［2-4］。在原核表达体系中常常采用 IPTG 作
为诱导剂。但是 IPTG 应用于大规模生产基因工程
药物有一定的局限性，例如易形成包涵体、对于人
收稿日期 ：2015-08-31
基金项目 ：长江大学大学生创新创业训练计划项目（104892013034），长江大学博士启动基金项目（801100010122）
作者简介 ：彭冬，男，研究方向 ：生物工程 ；E-mail ：1182359426@qq.com
通讯作者 ：柳忠玉，女，博士，讲师，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：zyliu2004@126.com
GST-SUMO-MT 融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达
彭冬  杨威  王昭  王席  柳忠玉
（长江大学生命科学学院，荆州 434025）
摘 要： 旨在考察在大肠杆菌中自诱导表达 GST-SUMO-MT 融合蛋白的可行性，并对自诱导培养条件及培养基成分进行优化，
以提高蛋白产量。采用摇瓶培养，利用单因素和正交实验对工程菌自诱导的培养条件（诱导时间、诱导温度）和培养基组分（蛋白
胨、酵母粉、甘油、葡萄糖、乳糖）进行优化，检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量。结果表明，自诱导培养基碳氮源的最
优配比为 ：2% 蛋白胨、2% 酵母粉、0.3% 甘油、0.05% 葡萄糖和 0.3% 乳糖。重组菌自诱导表达最优发酵条件为 ：采用两阶段温
度控制，37℃培养 3 h，25℃继续培养 13 h。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为 LB 培养基（IPTG 诱导）的 2.2 倍和
2.3 倍。
关键词 ： 金属硫蛋白 ；融合蛋白 ；可溶性表达 ；自诱导
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.030
Auto-inducing Expression of GST-SUMO-MT Fusion Protein in
Escherichia coli
PENG Dong YANG Wei WANG Zhao WANG Xi LIU Zhong-yu
（College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025）
Abstract: The auto-inducing expression of GST-SUMO-MT fusion protein in Escherichia coli BL21（DE3）was studied. In order to
increase the protein yield, we optimized both the auto-induction fermentation conditions and medium. Recombinant E. coli was cultured in shake
flask, of which the culture condition（time and temperature for induction）and medium composition（tryptone, yeast extract, glycerol, glucose
and lactose）were optimized by single factor and orthogonal tests, and bacterial concentration, expression level of soluble target protein were
determined. Result showed that the optimal carbon and nitrogen composition ratio in auto induction medium was obtained as followed ：2%
tryptone, 2% yeast extract, 0.3% glycerol, 0.05% glucose, 0.3% lactose. The optimum fermentation conditions were ：cultivating in 37℃ for 3
h firstly, then culturing in 25℃ for 13 h. Under the optimal condition, the expression level of soluble target protein and bacterial concentration
were 2.2 and 2.3 times of those in LB medium under induction of IPTG respectively.
Key words: metallothionein ；fusion protein ；soluble expression ；auto-induction
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2220
体具有潜在的毒性、价格贵成本高。2005 年 Studier
等［5］提出了外源基因表达自诱导的方法，自诱导
培养基中的乳糖是一种二糖，无毒且价格低廉。国
内外研究者发现乳糖作为诱导剂表达大肠杆菌重组
产物具有明显的优越性，可溶性表达高，蛋白产量
高，成本低等［6-8］。本实验室前期为了在大肠杆菌
中融合表达人金属硫蛋白 MT-1A，以 GST 为表达
标签和 SUMO 为分子伴侣，构建了融合蛋白表达载
体 pET20b-GSMT，并表达成功，但目的蛋白多以包
涵体的形式表达。本研究拟考察在大肠杆菌中自诱
导表达 GST-SUMO-MT 融合蛋白的可行性，通过优
化自诱导培养基的碳氮源组分及调整乳糖浓度，筛
选能高效可溶表达 GST-SUMO-MT 蛋白的工艺条件，
旨为进一步的研究及工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 表达融合蛋白 GST-SUMO-MT 的重组
基因工程菌 pET20b-GSMT/BL21（DE3）由暨南大学
医药生物技术研究开发中心黄亚东教授惠赠。蛋白
质分子量标准和 IPTG 均购自生工生物工程（上海）
股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 培养基 ZYM-5052 培 养 基 ：1% 胰蛋白胨，
0.5% 酵母粉，25 mmol/L Na2HPO4，25 mmol/L KH2PO4，
50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L
MgSO4，0.5% 甘油，0.05% 葡萄糖，0.2% 乳糖。LB
培养基 ：1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母粉，1% NaCl。
1.2 方法
1.2.1 菌体生长曲线 挑取含有重组质粒 pET20b-
GSMT 的单菌落接种到 5 mL LB 培养基的试管中，
在 37℃、200 r/min 条件下培养 14 h 作为种子。按
1∶100 接种到摇瓶中，分别加入新鲜 LB 培养基、
ZYM-5052 自诱导培养基，在 37℃条件下培养 24 h。
其中 LB 菌体培养至 3 h 后，菌体 OD600 值达到 0.5，
加入终浓度 0.5 mmol/L 的 IPTG 进行诱导。检测不同
培养时间菌体 OD600 值，绘制生长曲线。
1.2.2 目的蛋白的可溶性考察 培养结束后收集菌
体，加入菌液体积 1/20 的 PBS 悬浮菌体，冰上超声
裂解，12 000×g 离心 10 min，分别收集上清和沉淀，
进行 12% SDS-PAGE 电泳。经凝胶光密度扫描分析
可溶性蛋白表达含量。相对产量（%）＝ OD600× 可
溶性蛋白表达量 ×100%。
1.2.3 诱导温度的优化 以 1% 的接种量接种到
ZYM-5052 培养基，首先在 37℃培养 3 h 后，再分别
在 30、25 和 20℃继续培养。选取在 ZYM-5052 培养
基中 37℃恒温培养 20 h 作为对照。发酵结束时测定
菌体密度和可溶性蛋白的表达量，并计算相对产量。
1.2.4 诱导时间的优化 利用两阶段温度进行发酵，
37℃培养 3 h，然后降温至 25℃继续培养，分别在
降温后 1、5、9、13 和 17 h 取样检测菌体密度和可
溶性表达量，并计算相对产量。
1.2.5 正交实验设计 选取蛋白胨、酵母粉、甘油、
葡萄糖 4 个因素，每个因素选取 4 个水平，采用正
交表 L16（4
5）进行实验设计的优选。
1.2.6 乳糖浓度的优化 培养物以 1% 的接种量分
别接种于乳糖含量为 0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 和
0.6% 的优化后的培养基中，37℃培养 3 h，降温至
25℃再培养 13 h。培养结束后分别测定工程菌的菌
体密度及可溶性蛋白的含量。本研究中每 1 组实验
均重复 3 次，数据用 SPSS19 进行统计分析，并用
EXCEL 绘制图表。
2 结果
2.1 菌体生长曲线
用 ZYM-5052 自诱导培养基对重组基因工程菌
pET20b-GSMT/BL21（DE3）进行自诱导发酵，37℃
恒温培养 24 h。选取 IPTG 诱导的 LB 培养基作为对
照。结果（图 1 和图 2）显示，在 IPTG 诱导的 LB
培养基中，菌体在 0-6 h 内菌体密度呈对数增长，
10 h 后菌体密度不再增加，发酵终点菌体 OD600 为
2.21，可溶性蛋白表达量为 9.2%。自诱导培养基在
0-6 h 内菌体密度呈对数增长，10 h 后菌体密度继续
缓慢增长，发酵终点菌体 OD600 为 2.78，可溶性蛋
白表达量为 10.21%。结果表明，同 LB 培养基相比，
ZYM-5052 培养基更合适菌体密度的提高和可溶性蛋
白表达。
2.2 诱导温度对发酵的影响
对基因工程菌在 ZYM-5052 自诱导培养基中的
发酵条件进行优化。以 1% 的接种量接种到 ZYM-
5052 培养基，首先在 37℃培养 3 h 后，再分别在
2016,32(2) 221彭冬等：GST-SUMO-MT 融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达
30、25 和 20℃ 继 续 培 养。 选 取 在 ZYM-5052 培 养
基中 37℃恒温培养 20 h 作为对照。SDS-PAGE 电泳
（图 3）显示，自诱导后的重组菌可见相对分子质量
约 45 kD 的特异蛋白条带，与 GST-SUMO-MT 融合
蛋白理论值相符 ；37℃恒温培养时，大部分目的蛋
白在沉淀中以包涵体的形式存在，而两阶段培养时，
大部分目的蛋白可溶性地存在于离心后的上清溶液
中。随着温度的降低可溶性蛋白表达量明显提高，
GST-SUMO-MT 的相对产量在 25℃时为最大值，此
时的菌体 OD600 为 2.38，可溶性蛋白表达量为 18.3%
（图 4）。结果表明，同 37℃恒温发酵相比，两阶段
温度发酵的可溶性表达量大幅度提升，后续实验选
择利用两阶段温度控制进行发酵，培养条件为 37℃
培养 3 h，25℃继续培养。
2.3 诱导时间对发酵的影响
利用两阶段温度进行发酵，37℃培养 3 h，然后
降温至 25℃继续培养，分别在降温后 1、5、9、13
和 17 h 取样检测菌体密度和可溶性表达量。诱导不
同时间后 GST-SUMO-MT 的 SDS-PAGE 电泳和表达
量分析结果（图 5 和图 6）显示，随着时间的延长
菌体密度逐渐增大，降温后 5-13 h 内可溶性表达
量急剧升高，13 h 之后表达量不再明显增加。GST-
SUMO-MT 的相对产量在 13 h 已达最大值，13 h 以
后变化不明显。因此确定发酵条件为 37℃培养 3 h，
降温至 25℃后继续培养 13 h。
2.4 正交实验优化培养基
采用 L16（4
5）正交实验对培养基的碳氮比进行
优化，对蛋白胨、酵母提取物、甘油及葡萄糖进行
4 因素 4 水平的正交实验 ；考察培养基碳源、氮源
组分对菌体生长及表达的综合影响，选取最优的培
养基配方。正交实验因素水平见表 1，实验结果和
极差分析实验因素对指标的影响结果见表 2。结果
表明，培养基对相对产量的影响顺序为 B>C>D>A，
最终确定优化培养基的组分为 A4B4C1D2，即 2% 蛋
4.0
3.0
2.0
1.0
0
菌
体
O
D
60
0
0 2 4 6 8 10 12ᰦ䰤h14 16 18 20 22 24
ZYM-5052
LB+IPTG
图 1 pET20b-GSMT/BL21（DE3）工程菌生长曲线
O
D
60
0 ਟⓦᙗ㺘䗮䟿% ⴨ሩӗ䟿 %
16
14
12
10
8
6
4
2
0
35
30
25
20
15
10
5
0
LB+IPTG 㠚䈡ሬษޫส
OD600⴨ሩӗ䟿ਟⓦᙗ㳻ⲭ㺘䗮䟿
图 2 不同培养基对工程菌密度和可溶性表达量的影响
170
kD
130
100
70
55
40
35
25
10
ⴞḷᑖ 1 2 3 4 5 6 7 8 M
M ：蛋白 Marker ；1 ：37℃表达菌体超声波裂解后沉淀 ；2 ：37℃表达菌体超
声波裂解后上清 ；3 ：30℃表达菌体超声波裂解后沉淀 ；4 ：30℃表达菌体
超声波裂解后上清 ；5 ：25℃表达菌体超声波裂解后沉淀 ；6 ：25℃表达菌
体超声波裂解后上清 ；7 ：20℃表达菌体超声波裂解后沉淀 ；8 ：20℃表达
菌体超声波裂解后上清
图 3 不同温度诱导对可溶性表达的影响
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
60
50
40
20
30
10
0
A
㧼փᇶᓖOD 600 ਟⓦᙗ㳻ⲭ㺘䗮䟿%
B C D
⴨ሩӗ䟿%OD600⴨ሩӗ䟿ਟⓦᙗ㳻ⲭ㺘䗮䟿
A ：37℃ 恒 温 ；B ：两 阶 段 温 度 37℃/30℃ ；C ：两 阶 段 温 度 37℃/25℃ ；
D ：两阶段温度 37℃/20℃
图 4 不同温度对工程菌密度和可溶性表达量的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2222
ⴞḷᑖ1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MkD7055
40
35
25
M ：蛋白 Marker ；1-5 ：在 25℃培养 1、5、9、13 和 17 h 菌体超声波裂解后
上清 ；6-10 ：在 25℃培养 1、5、9、13 和 17 h 菌体超声波裂解后沉淀
图 5 诱导时间对可溶性表达的影响
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
60
50
40
20
30
10
0
1
O
D
60
0 ਟⓦᙗ㳻ⲭ㺘䗮䟿%
5 9ᰦ䰤h 13 17 ⴨ሩӗ
䟿%OD600⴨ሩӗ䟿ਟⓦᙗ㳻ⲭ㺘䗮䟿
图 6 诱导时间对工程菌密度和可溶性表达量的影响
表 1 优化培养基碳氮比实验的因素水平设计
蛋白胨 A%
（W/V）
酵母粉 B%
（W/V）
甘油 C%
（W/V）
葡萄糖 D%
（W/V）
0.5 0.5 0.3 0.03
1.0 1.0 0.5 0.05
1.5 1.5 0.7 0.07
2.0 2.0 0.9 0.09
白胨、2% 酵母粉、0.3% 甘油、0.05% 葡萄糖。在
此配比下，菌体 OD600 达到 4.26，可溶性表达量为
19.81%。
2.5 乳糖浓度对发酵的影响
在优化培养基的碳氮比的基础上，设置乳糖
终 浓 度 分 别 为 0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 和 0.6%，
37℃培养 3 h，降温至 25℃再培养 13 h。图 7 显示，
菌株在乳糖 0.2%-0.4% 时维持较高的可溶性表达，
乳糖超过 0.6% 时表达量急剧下降。图 8 显示，乳糖
在 0.2%-0.4% 对菌体的生长有一定的促进作用，超
过 0.6% 时菌体密度也明显下降，GST-SUMO-MT 的
相对产量在乳糖为 0.3% 时达最大值，此时的菌体
OD600 为 4.94，可溶性蛋白的表达量为 19.81%。综
合考虑可溶性表达量和菌体密度因素，工程菌表达
的最适乳糖的诱导浓度为 0.3%。
2.6 重组基因工程菌在3种培养基中的发酵情况的
比较
用优化后的 ZYM-5052 自诱导培养基对重组基
因工程菌进行自诱导发酵，并以 IPTG 诱导的 LB 培
养基、文献［5］给出 ZYM-5052 自诱导培养基为对
照进行比较。结果（表 3）显示，优化后的自诱导
培养基的发酵产量最高，其可溶性蛋白表达量和菌
体浓度分别为 LB 培养基（IPTG 诱导）的 2.2 倍和
2.3 倍。
3 讨论
自诱导培养基已经成功应用于多种酶和蛋白
的高效表达［9-11］。本课题组前期构建了基因工程
菌 pET20b-GSMT/BL21（DE3），但是目的蛋白 GST-
SUMO-MT 在 LB 培养基（IPTG 诱导）中以包涵体
的形式表达，为解决包涵体问题，本实验研究了在
ZYM-5052 培养基中自诱导表达 GST-SUMO-MT 融合
蛋白的可行性。
通过对温度优化，本实验选择利用两阶段温
度控制进行发酵，采用变温培养模式较单一温度培
养模式，可溶性蛋白表达量有明显提高。这主要是
由于先在 37℃下培养增加菌体量，然后低温培养
减缓重组蛋白的合成速率以促进蛋白正确折叠，这
种两阶段温度调控策略有助于提高蛋白的可溶性表
达［12，13］。张芙华等［13］提出利用枯草芽胞杆菌（Bu-
cillis subtilis）分批发酵生产角质酶的两阶段温度控
制策略，即 0-4 h 时发酵温度为 37℃，4 h 后将温
度设置为 30℃，采用该策略最高酶活比 37℃恒温培
养提高了 83.4%。杨鑫等［14］提出了利用灰产色链
霉菌发酵生产海藻糖合成酶的两阶段温度控制策略，
即 37℃培养 2.5 h，25℃继续培养 14 h，结果显示与
37℃恒温培养相比酶活提高了 55.25%。前人的研究
为本实验中两阶段温度控制策略的制定提供了依据。
在本研究中 37℃培养 3 h 时 OD600 为 0.7，菌体已经
进入对数生长期，可以进行蛋白的诱导表达。通过
诱导温度和诱导时间的优化，本研究确定了两阶段
2016,32(2) 223彭冬等：GST-SUMO-MT 融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达
温度控制策略，即 37℃培养 3 h，降温至 25℃继续
培养 13 h。
通常使用的 LB 培养基组成成分简单，不能满
足高密度发酵对营养的要求，本研究通过正交实验
对 ZYM-5052 自诱导培养基碳氮源的主要成分进行
了适当优化，对其含量进行适当的提高，大大提高
了该菌株的发酵密度。IPTG 的诱导极易形成包涵
体，并且对细胞生长有抑制作用，导致细胞不能高
密度生长［15］。本研究优化后的自诱导培养基的发酵
产量最高，其可溶性蛋白表达量和菌体浓度分别为
LB 培养基（IPTG 诱导）的 2.2 倍和 2.3 倍。这主要
是由于乳糖可以作为细胞生长的能源，促进细胞高
密度生长，同时可以作为诱导剂，从而提高细胞活
性和蛋白表达量，与传统培养基相比可以使菌体密
度和可溶性蛋白表达量增加数倍［16］。但本研究中当
表 2 优化培养基碳氮比对工程菌生长及表达的影响
编号 A B 空白 C D 菌体密度（A600） 可溶性蛋白表达量 /% 相对产量（表达量 × A600 值）
1 1 1 1 1 1 2.78 9.22 25.66
2 1 2 2 2 2 3.78 17.55 66.59
3 1 3 3 3 3 3.04 14.62 44.40
4 1 4 4 4 4 4.00 15.95 63.85
5 2 1 2 3 4 2.77 10.92 30.27
6 2 2 1 4 3 3.76 11.71 44.04
7 2 3 4 1 2 4.26 19.81 84.35
8 2 4 3 2 1 4.65 12.69 59.06
9 3 1 3 4 2 3.08 11.28 34.75
10 3 2 4 3 1 4.07 11.02 44.87
11 3 3 1 2 4 4.52 13.72 62.05
12 3 4 2 1 3 4.65 16.56 77.06
13 4 1 4 2 3 4.48 15.48 69.32
14 4 2 3 1 4 4.64 16.58 76.94
15 4 3 2 4 1 4.04 11.68 47.14
16 4 4 1 3 2 3.55 15.06 53.51
k1 50.123 39.998 66.002 44.181
k2 54.428 58.108 64.253 59.798
k3 54.681 59.484 43.262 58.704
k4 61.729 63.371 47.446 58.277
R 11.606 23.372 22.739 15.617
B>C>D>A
ⴞḷᑖ1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MkD7055
40
35
25
100
130
170
M ：蛋白 Marker ；1-5 ：乳糖浓度为 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6% 的菌
体超声波裂解后沉淀 ；6-10 ：乳糖浓度为 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%
的菌体超声波裂解后上清
图 7 乳糖浓度对可溶性表达的影响
30
25
20
15
10
5
0
120
100
80
40
60
20
0
0.2
ਟⓦᙗ㺘䗮䟿%
0.3 0.4ң㌆⎃ᓖ% 0.5 0.6 ⴨ሩ
ӗ䟿%OD600⴨ሩӗ䟿ਟⓦᙗ㳻ⲭ㺘䗮䟿
O
D
60
0
图 8 乳糖浓度对工程菌密度和可溶性表达量的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2224
乳糖浓度过高（0.6%）时产生抑制效应，与文献报
道类似［17］。乳糖自诱导表达系统既保证了乳糖诱导
蛋白表达的稳定性，同时自诱导发酵过程中无需检
测菌体的生长状态，避免了不必要的污染，并且节
省成本［18］。
4 结论
经过优化得出最优培养基成分为 ：2% 蛋白胨、
2% 酵母、0.3% 甘油、0.05% 葡萄糖、0.3% 乳糖。
在 37℃培养 3 h，降温至 25℃再培养 13 h。优化后
的自诱导培养基的发酵产量大幅度提高，其可溶性
蛋白表达量和菌体浓度分别为 LB 培养基（IPTG 诱
导）的 2.2 倍和 2.3 倍。本研究通过对培养基的调整
和发酵工艺的优化，降低了生产成本。
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（责任编辑 马鑫）
表 3 培养基优化前后培养工程菌效果的比较
培养基
菌体密度
（A600）
可溶性蛋白
表达量 /%
相对产量（表达
量 ×A600 值）/%
LB 2.20 9.20 20.24
ZYM-5052 2.78 10.21 28.38
优化后 ZYM-5052 4.94 19.81 97.86