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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
柴油污染对土壤和水体环境威胁巨大，具有致
癌、致畸、致突变等危害，直接影响到生态系统平
衡和人体健康。常规物理化学方法处理柴油污染物，
能耗和处理成本高，易对环境造成二次污染。而采
用微生物降解的方法处理柴油污染物具有明显的
优势［1］。
国内外已有研究证明柴油污染微生物修复技术
的基础和关键是筛选高效的柴油降解微生物。但是，
目前柴油降解菌株大多是在柴油浓度 1% 或者更低
浓度下分离筛选得到的［2-5］，而实际污染物中柴油
收稿日期 ： 2013-11-07
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（U1304332），河南工业大学引进人才专项基金资助项目（2009BS052），河南工业大学校科学研究基金
研究生教育创新计划项目（2012YJCX49）
作者简介 ：岳贵龙，男，硕士研究生，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：yueguilong@163.com
通讯作者 ：陈亮，副教授，博士，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：chenliang@haut.edu.cn
柴油高效降解菌株筛选及降解特性研究
岳贵龙  陈亮  刘娜
（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）
摘 要： 采用梯度富集培养、稀释涂布从受石油污染的样品中，分离得到柴油降解菌株 10 株，其中菌株 YR2 柴油降解率最高，
在含柴油 1%（w/v）的无机盐液体培养基中培养 7 d，降解率达到 92.8%，在 2%、4%、5% 的柴油浓度下降解率分别为 60.8%、
53.5%、41.0%。综合菌株形态特征观察、生理生化特性分析和 16S rDNA 序列比对，菌株 YR2 应为铜绿假单胞菌（Pseudomonas
aeruginosa）。菌株 YR2 具有较好的细胞表面疏水性、乳化性能和排油性能。薄层层析结果表明菌株 YR2 分泌糖脂类表面活性剂。
菌株 YR2 具有高效的柴油降解能力，有望应用于柴油污染的微生物修复。
关键词 ： 柴油 假单胞菌 糖脂 细胞表面疏水性 微生物降解
Screening of Diesel-degrading Strains and Their Degrading
Characteristics
Yue Guilong Chen Liang Liu Na
（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）
Abstract:  Ten diesel-degrading strains were isolated from oil-contaminated samples by gradient enrichment culture and dilution
coating. Strain YR2 with highest diesel degradation ability was chosen for further study. The degradation rate of strain YR2 was 92.8% when
it was inoculated in mineral medium with diesel concentration of 1 g/100 mL for 7 days. The degradation rate was respectively 60.8%, 53.5%
and 41.0% when the diesel concentration was 2 g/100 mL, 4 g/100 mL and 5 g/100 mL. Based on morphological, physiological-biochemical
features and 16S rDNA sequences comparison, strain YR2 was identified as Pseudomonas aeruginosa. Strain YR2 has the excellent cell surface
hydrophobicity, emulsifying ability and oil displacement ability. Strain YR2 can produce glycolipid biosurfactant. Strain YR2 with efficient diesel
degradation ability has the potential application in the microbial remediation of diesel pollution.
Key words:  Diesel Pseudomonas sp. Glycolipid Cell surface hydrophobicity Microbial degradation
浓度远远高于 1%。低浓度柴油下筛选得到的降解菌
株在实际应用中柴油降解效果欠佳。
本文从受石油污染的样品中通过梯度富集培养
分离筛选高浓度柴油降解菌株，并对降解菌株的乳
化性能、排油性能和细胞表面疏水性进行研究，以
期为柴油污染微生物修复提供菌株和参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 中原油田、南阳油田、普光油气田等
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期162
地受石油污染土壤以及油基钻屑。
1.1.2 培养基 无机盐液体培养基 ：NH4NO3 2 g，
K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，无
水 氯 化 钙 0.01 g，Na2EDTA·2H2O 0.01 g， 蒸 馏 水
1 000 mL，pH 7.2-7.4。
油平板培养基 ：无机盐液体培养基 1 000 mL，
柴油 10 mL，琼脂 18 g。
牛肉膏蛋白胨固体培养基［6］（NA 培养基）。
1.2 方法
1.2.1 梯度富集培养 取样品 10 g 加入到 100 mL
含柴油 1%（w/v）的无机盐液体培养基中，于 30℃、
170 r/min 富集培养 5 d 后，以 5% 的接种量接入到
柴油浓度 2% 的无机盐液体培养基继续富集培养 5 d，
然后依次转入到柴油浓度 3%、4%、5% 的无机盐液
体培养基进行富集培养。取培养液在固体油平板上
进行稀释涂布，挑取生长迅速的菌落进行划线分离
纯化，保存备用。
1.2.2 柴油降解率测定 将菌株活化培养液以 5%
（v/v）的接种量接入不同柴油浓度的无机盐液体培
养基中，于 30℃、170 r/min 下培养 7 d 后，采用重
量法［7］测定柴油降解率，以不接菌的培养液作为空白
对照，每个试验重复 3 次。降解率计算公式如下 ：
降解率（%）=W0-W1/W0×100%
W0 是对照组残油质量（g），W1 是试验组残油
质量（g）。
1.2.3 柴油降解菌株鉴定 参照《常见细菌系统鉴
定手册》［8］进行菌株形态特征观察和生理生化特性
分析。菌株形态特征观察包括菌落形态观察、结晶
紫染色、革兰氏染色，生理生化特性分析包括需氧
性试验、葡萄糖发酵试验、运动性试验、氧化酶试验、
硝酸盐还原试验、甲基红试验、V-P 试验、吲哚试
验等。
菌株 16S rDNA 序列比对参照文献［9］进行。使
用细菌基因组提取试剂盒（北京鼎国）提取菌株基
因组 DNA，以细菌 16S rDNA 扩增通用引物 27F 和
1492R 进行 PCR 扩增，PCR 产物经电泳检测后送样
测序。
1.2.4 菌株降解特性
1.2.4.1 乳化性能 菌株于柴油无机盐液体培养基
培养 5 d 后，于 12 000 r/min 离心 20 min，收集发酵
上清液，于带刻度试管中加入等体积的发酵上清液
和柴油，充分振荡 5 min 后静置 24 h，观察并记录
乳化层高度和稳定性，计算乳化指数（EI）［10］。以
未接种的培养液作为空白对照。
1.2.4.2 排油性能 发酵液排油性能以排油圈直径
计，采用排油圈法［10］测定。
1.2.4.3 表面活性物质分析 发酵液表面活性物质
分析采用薄层层析法。将等体积的发酵上清液和萃
取液（氯仿∶甲醇 =2∶1）混合，充分振荡后取样
进行薄层层析，展开后用苯酚硫酸试剂显色。
1.2.4.4 菌体细胞表面疏水性 细胞表面疏水性以
细胞表面疏水率计，测定采用 Rosenberg 测定方法
的改进方法［11］。菌株于柴油无机盐液体培养基培养
5 d，离心后重悬于灭菌的无机盐液体培养基中，取
悬浮液 1.5 mL 调节 OD600 至 0.5，加入 200 μL 柴油
涡旋 3 min，静置待水相和油相分层后，记录悬浮液
OD600 的变化。以无机盐液体培养基为空白对照，每
个试验重复 3 次。细胞表面疏水率计算公式如下 ：
细胞表面疏水率（%）=（1-Ac/A0）×100%
Ac 和 A0 分别是振荡后悬浮液的吸光值和振荡
前悬浮液的吸光值。
2 结果
2.1 柴油降解菌株筛选
经富集培养后分离纯化得到能以柴油作为唯一
碳源的细菌 10 株，其中菌株 YR2 降解效果最好。
分别在柴油浓度 1%、2%、4%、5% 的无机盐液体
培养基培养 7 d 后，降解率分别为 92.8%、60.8%、
53.5%、41.0%。
2.2 菌株鉴定
如图 1 所示，菌株 YR2 在 NA 平板上菌落黄色
微绿、不透明，菌落表面有褶皱、边缘裂纹，产黄
A B C
A ：菌株 YR2 菌落形态（NA 平板）；B ：菌株 YR2 结晶紫染色（1 000 ×）；
C ：菌株 YR2 革兰氏染色（1 000×）
图 1 菌株 YR2 形态特征
2014年第1期 163岳贵龙等 ：柴油高效降解菌株筛选及降解特性研究
绿色色素 ；细胞短杆状，单个或成对出现，革兰氏
阴性，无芽孢 ；菌株 YR2 需氧生长，利用葡萄糖产
酸不产气，运动性、氧化酶试验、硝酸盐还原为阳
性，甲基红试验、V-P 试验、吲哚试验为阴性，菌
株 YR2 生理生化特性与铜绿假单胞菌基本保持一致。
菌 株 YR2 的 16S rDNA 序 列（GeneBank 登 录
号 KF530279）经 BLAST 比对，发现与 Pseudomonas
aeruginosa strain S25（DQ095913） 和 Pseudomonas
aeruginosa strain D1（KF113578） 的 同 源 性 均 为
99%，构建 Neighbor-Joining 系统发育树如图 2 所示。
100
100
96
84
96
76
93
51
98
0.02
Pseudomonas syringae strain CP001AB504737
Pseudomonas amygdaleZ76654
Pseudomonas deceptionensis strain M1GU936597
Pseudomonas cedrellaAF064461
Pseudomonas rhodesiaeAF064459
Pseudomonas extremorientalisAF405328
Pseudomonas putidaD84020
Pseudomonas taiwanensis strain BCRC 17751EU103629
Strain YR2KF530279
Pseudomonas aeruginosa strain S25DQ095913
Pseudomonas halophila strain DSM 3050TAB021383
Pseudomonas saccharophila strain DSM 654TAB021407
图 2 菌株 YR2 系统发育树
a ：菌株 YR2，b ：空白对照
图 3 菌株 YR2 发酵液乳化效果
a b
综合菌株形态特征观察、生理生化特性分析
和 16S rDNA 序列比对，菌株 YR2 为铜绿假单胞菌
（Pseudomonas aeruginosa）。
2.3 菌株降解特性
2.3.1 乳化性能 如图 3 所示，菌株发酵液对等体
积柴油的乳化效果明显，乳化指数高达 75%，且静
置 24 h 后乳化层仍然稳定，表明菌株 YR2 在生长代
谢过程中分泌高效表面活性物质，有效增加了菌株
菌体细胞与烃类物质的接触面积。
2.3.2 发酵液排油性能 向油膜中心滴加培养 5 d
后的发酵液，经测定排油圈直径为 7.7 cm，表明菌
株在发酵液中分泌有高效表面活性物质。
2.3.3 表面活性物质定性分析 薄层层析展开后经
苯酚硫酸试剂显色，出现糖脂类物质的棕色斑点，
Rf 值 0.67，与鼠李糖脂标准品 Rf 值接近，由此可初
步判断菌株产糖脂类表面活性剂。
2.3.4 细胞表面疏水性 菌株 YR2 在柴油浓度为
2%、4%、5% 的无机盐液体培养基中培养 5 d，细
胞表面疏水率分别为 54.1%、54.3%、66.4%，说明
菌株具有良好的细胞表面疏水性。
图 4 所示为菌株 YR2 细胞与油滴微粒的黏附现
象。取菌株发酵液与美兰染液混合后于光学显微镜
下进行观察，发现在油滴微粒周围吸附有大量的菌
体细胞（菌体细胞蓝色、较小，油滴透明、较大），
⋩┤
㧼փ
图 4 菌体细胞与油滴的黏附（1000×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期164
即在菌株分泌的表面活性物质作用下，疏水性油滴
被分散为微粒进入水相，进而形成了油滴 -菌体细胞 -
水的混合体系。
3 讨论
菌株 YR2 柴油降解能力明显高于国内外相关报
道，详见表 1。由表 1 可知，国内外目前关于柴油
降解微生物菌株的研究大多在低浓度柴油（1%）下
进行。高浓度柴油会对微生物细胞产生明显毒害作
用以及形成的油膜会阻隔菌体细胞与外界环境的物
质运输，导致微生物菌株不能良好地生长。本研究
采用梯度富集培养筛选柴油降解菌株，提高了菌株
对高浓度柴油的适应性。
表 1 不同柴油浓度下菌株 YR2 降解能力
菌株
柴油浓度
1% 2% 4% 5%
YR2 92.8% 60.8% 53.5% 41.0%
Acinetobacter sp. F9［12］ 90% - - -
不动杆菌 W3［13］ 84.70% - - -
Rhodococcus erythropolis T7-2［5］ 75% - - -
假单胞菌 Y7［14］ 70% 42% - -
Rhodococcus baikonurensis EN3［15］ 60.70% 30.50% - -
假单胞菌 Y4［14］ 51% 33% - -
菌 株 YR2 在 柴 油 浓 度 2%、4%、5% 条 件 下，
细胞表面疏水率分别为 54.1%、54.3%、66.4%。即
随着柴油浓度的升高，菌株 YR2 的细胞表面疏水率
也随之升高，也说明菌株细胞经过富集培养后对于
高浓度柴油具有较好的适应性。
现有研究显示，疏水性的烃类化合物由于其本
身具有较高疏水性、固液分配系数，影响其与细菌
细胞的黏附，只能通过非特定扩散机理并在疏水性
最高的区域进入细胞内［16］。而良好的菌株细胞表面
疏水性可以促进菌体细胞、疏水性油滴微粒的充分
黏附，从而促进菌体细胞对烃类物质的摄取和降解。
菌体细胞表面疏水性高低将决定着烃类物质从
胞外环境进入到胞内的难易［17］，因此，细胞表面疏
水性越高，越有利于菌体细胞与烃类物质的黏附接
触，进而促进菌株对烃类物质的降解［18］。那么，柴
油降解菌株的选育过程中菌株细胞表面疏水性和降
解率同样重要。
4 结论
经 梯 度 富 集 培 养 分 离 筛 选 得 到 一 株 高 效 柴
油降解菌株 YR2，经鉴定菌株应为铜绿假单胞菌
（Pseudomonas aeruginosa）。
菌株 YR2 在 1%、2%、4%、5% 的柴油浓度下
降解率分别为 92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。
菌株 YR2 对柴油乳化效果明显且稳定，菌株发
酵液排油性能良好。菌株 YR2 具有较好的细胞表面
疏水性，可分泌糖脂类表面活性物质。
参 考 文 献
［1］ 禄立彦 , 邓超 , 段作营 , 等 . 两株柴油降解菌的筛选和降解特性
研究［J］. 工业微生物 , 2012, 42（6）：14-20.
［2］ Lee M, Kim MK, Kwon MJ, et al. Effect of the synthesized mycolic
acid on the biodegradation of diesel oil by Gordonia nitida strain
LE31［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, 100（4）：
429-436.
［3］ 马晓焉 , 陈德育 , 段敏 , 等 . 柴油降解细菌的筛选及生长特性初
探［J］. 西北农林科技大学学报 , 2013, 41（6）：85-90.
［4］ Lee M, Woo SG, Ten LN. Characterization of novel diesel-degrading
strains Acinetobacter haemolyticus MJ01 and Acinetobacter johnsonii
MJ4 isolated from oil-contaminated soil［J］. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 2012, 28（5）：2057-2067.
［5］ Huang L, Ma T, Li D, et al. Optimization of nutrient component for
diesel oil degradation by Rhodococcus erythropolis［J］. Marine
Pollution Bulletin, 2008, 56（10）：1714-1718.
［6］ 沈萍 , 范秀容 , 李广武 . 微生物学实验［M］. 第 3 版 . 北京 ：
高等教育出版社 , 1999 ：50-51.
［7］ 国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会 . 水和废
水监测分析方法［M］. 第 4 版 . 北京 ：中国环境科学出版社 ,
2002 ：490-491.
［8］ 东秀珠 , 蔡妙英 . 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京 ：科学出
版社 , 2001 ：162-167.
［9］ 李静琴 , 陈亮 , 岳贵龙 , 等 . 冬枣储藏期致腐真菌分离鉴定及
广谱拮抗菌株的筛选［J］. 河南工业大学学报 ：自然科学版 ,
2013, 34（2）：62-66.
［10］ 高小朋 , 姜钊 , 高秀梅 , 等 . 石油降解菌产表面活性剂的条件
优化［J］. 环境工程学报 , 2013, 7（8）：3244-3248.
［11］ Babita K, Singh SN, Singh DP. Characterization of two biosurfactant
producing strains in crude oil degradation［J］. Process
2014年第1期 165岳贵龙等 ：柴油高效降解菌株筛选及降解特性研究
Biochemistry, 2012, 47（12）：2463-2471.
［12］ Hou D, Shen X, Luo Q, et al. Enhancement of the diesel oil
degradation ability of a marine bacterial strain by immobilization on
a novel compound carrier material［J］. Marine Pollution Bulletin,
2013, 67（1-2）：146-151.
［13］ 孙敏 , 沈先荣 , 侯登勇 , 等 . 高效柴油降解菌 Acinetobacter W3
分离鉴定及降解酶基因扩增分析［J］. 生物技术通报 , 2012
（6）：159-164.
［14］ 田胜艳 , 刘廷志 , 高秀花 , 等 . 海洋潮间带石油烃降解菌的筛
选分离与降解特性［J］. 农业环境科学学报 , 2006, 25 ：301-
305.
［15］ Lee M, Kim MK, Singleton I., et al. Enhanced biodegradation
of diesel oil by a newly identified Rhodococcus baikonurensis
EN3 in the presence of mycolic acid［J］. Journal of Applied
Microbiology, 2006, 100（2）：325-333.
［16］ Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane
permeability revisited［J］. Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 2003, 67（4）：593-656.
［17］ 赵晴 , 张甲耀 , 陈兰洲 , 等 . 疏水性石油烃降解菌细胞表面疏
水性及降解特性［J］. 环境科学 , 2005, 26（5）：132-136.
［18］ Najafi AR, Rahimpour MR, Jahanmiri AHR, et al. Enhancing
biosurfactant production from an indigenous strain of Bacillus
mycoides by optimizing the growth conditions using a response
surface methodology［J］. Chemical Engineering Journal, 2010,
163（3）：188-194.
（责任编辑 李楠）