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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
香蕉枯萎病又称黄叶病、巴拿马病，是由尖孢镰
刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporium f. sp. cubense）
侵染香蕉植株引起的一种毁灭性土传维管束病害，
近年来在中国香蕉主产区持续爆发，严重制约着我
国香蕉产业的发展［1-3］。其病原菌有 4 个生理小种［4］，
其中 4 号生理小种（Fusarium oxysporium f. sp. cube-
nse 4，FOC 4）侵染范围最广，几乎危害所有的香蕉
品种，我国香蕉品种多为巴西蕉，受 FOC 4 威胁最
大，因此防治香蕉枯萎病迫在眉睫。据报道，目前
对该病防治的主要途径包括轮作、选用抗病品种［5］、
化学防治［6］及生物防治等。目前推广的抗病品种属
中抗品种，并不能完全控制枯萎病的发生，且农艺
收稿日期 ：2013-02-25
基金项目 ：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-32）
作者简介 ：刘小玉，女，硕士研究生，研究方向 ：香蕉枯萎病防控 ；E-mail ：liuxiaoyu06120210@163.com
通讯作者 ：张锡炎，男，博士生导师，研究员，研究方向 ：香蕉标准化与产业化 ；E-mail ：zxyan1981@163.com.
香蕉枯萎病拮抗放线菌 1-g-59 的筛选与鉴定
刘小玉1，2 周登博1，2 谭昕2 高祝芬2 陈波1，2 黄霄1，2 张锡炎2
（1. 海南大学园艺园林学院，海口 571737 ；2. 中国热带农业科学院生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： 通过对海南美台、南宝蕉园香蕉根际土壤的分离和筛选，获得 5 株对 FOC 4 具有拮抗作用的放线菌，其中以菌株
1-g-59 活性最强。根据进行形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分分析、16S rDNA 序列和系统发育分析等研究，
鉴定菌株 1-g-59 为 Streptomyces lunalinharesii。盆栽试验结果表明，菌株 1-g-59 发酵液对香蕉枯萎病具有较强的防治作用，防治效
果达 64.9%。
关键词 ： 香蕉枯萎病 拮抗放线菌 筛选 鉴定
Screening and Identification of Antagonistic Actinomyces 1-g-59
Against Fusarium oxysporium f. sp. cubense
Liu Xiaoyu1，2 Zhou Dengbo1，2 Tan Xin2 Gao Zhufen2 Chen Bo1，2 Huang Xiao1，2 Zhang Xiyan2
（1. College of Horticulture and Landscape，Hainan University，Haikou 571737 ；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，
Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101）
Abstract: Five antagonistic strains against Fusarium oxysporum f. sp. cubense were isolated and screened from the rhizosphere soil of the
banana garden in Meitai and Nanbao, strain 1-g-59 possessed the most prominent bioactivity. By studying the morphology, cultural, physiological
and biochemical properties, cell wall components analysis, 16S rDNA and phylogenetic tree, the results showed that strain 1-g-59 was identified
as Streptomyces lunalinharesii. Pot experiment showed that control effects of the fermentation filtrate of strain 1-g-59 on banana fusarium wilt
disease was 64.9%.
Key words: Banana Fusarium wilt disease Antagonistic actinomyces Screening Identification
性状不佳，品质较差，如台湾 1 号、GCTCV-215 等；
使用化学药剂，不仅会杀灭土壤中的有益菌类，且
长期使用，对环境污染影响较大。因此生物防治被
认为是目前最安全的防治措施，符合环境保护和有
机食品发展要求。
香蕉枯萎病的生物防治已成为各国的研究热点。
紫黑链霉菌（Streptomyces violaceusniger）［7］、荧光假
单胞菌（Pseudomonas fluorescens）［8］、枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis）［9］被证明对 FOC 4 具有明显的抑
制作用，Perez-Vicente 等［10］研究报道，抗病品种种
植与生防菌的施用相结合，对香蕉枯萎病的防效达
95% 以上，说明生物防治香蕉枯萎病是完全可行的。
2013年第8期 125刘小玉等 ：香蕉枯萎病拮抗放线菌 1-g-59 的筛选与鉴定
本研究是采集香蕉植株根际土壤，分离并筛选出对
FOC 4 有明显抑制作用的拮抗菌株，测定各拮抗菌
株的发酵液对 FOC 4 菌丝生长和孢子萌发的抑制作
用，筛选一株活性最强的拮抗菌株，旨在通过盆栽
试验研究其对香蕉枯萎病的防治效果，并通过形态
特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分
分析和 16S rDNA 序列及其系统发育分析等研究对该
菌株进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试病原菌 香蕉枯萎病病原菌（FOC 4）：
尖孢镰刀菌古巴专化型 4 号 生 理 小 种（Fusarium
oxysporium f. sp. cubense 4，FOC4），由本实验室保藏。
供试香蕉苗 ：巴西蕉，由中国热带农业科学院
种苗组培中心提供。
1.1.2 样品采集 供分离的土样采自海南临高美台、
南宝蕉园，去除大颗粒石块和植物残渣，备用。
1.1.3 主要培养基 分离放线菌采用高氏一号合成
培养基，为抑制细菌与真菌的生长，倒平板前加入
0.005% 的无菌重铬酸钾。
FOC 4 的培养及平板对峙试验采用 PDA 培养基。
拮抗菌的发酵采用黄豆粉液体培养基（可溶性
淀粉 20 g，酵母粉 5 g，氯化钠 4 g，黄豆粉 15 g，
蛋白胨 2 g，碳酸钙 4 g，pH7.2-7.4，1×105 Pa 灭菌
50 min）。
放线菌的形态学观察采用高氏一号琼脂、酵母
膏麦芽汁琼脂、燕麦片琼脂、无机盐淀粉琼脂、葡
萄糖天冬素琼脂、胨酵母膏铁琼脂、酪氨酸琼脂等
7 种培养基。
1.2 方法
1.2.1 放线菌的分离与筛选
1.2.1.1 土壤放线菌的分离 称取土样 10 g，加入
90 mL 无菌水，于 28℃、200 r/min 的摇床中充分震
荡 30 min，取其上清液用无菌水 10 倍逐级稀释，依
次稀释成 10-2、10-3 和 10-4 浓度，各吸取 100 μL 涂
布于加重铬酸钾的高氏一号培养基平板上，于 28℃
恒温培养箱中倒置培养，适时挑取不同形态的菌落
进行划线，纯化后保存。
1.2.1.2 拮抗放线菌的筛选 采用平板对峙法，在
无菌环境下，将培养 5-6 d 的 FOC 4（直径为 6 mm）
靶标菌接种至 PDA 平板中央，并在距离靶标菌边
缘 2.5 cm 处接种待测放线菌，以不接放线菌，只接
FOC 4 的 PDA 平板作为对照（CK），于 28℃恒温培
养箱中倒置培养 5 d 后，测量各抑菌带的大小，初
筛出对 FOC 4 有明显拮抗效果的菌株，连续接种 5
代进行复筛，最终筛选出拮抗效果最好的菌株进行
下一步试验。
1.2.1.3 拮抗放线菌发酵液对 FOC 4 抑制作用的测
定 拮抗菌发酵滤液的制备 ：拮抗菌接种于黄豆粉
液体培养基中，28℃、200 r/min 的摇床中振荡培养
7 d，取发酵液 8 000 r/min 离心 15 min，上清液用微
孔滤膜过滤除菌。
FOC 4 孢子悬浮液的制备 ：将 FOC 4 接种于
PDA 固体培养基上，28℃恒温培养箱中倒置培养，
待菌丝铺满平板后，用无菌水配制成 1×106 cfu/mL
孢子悬浮液。
拮 抗 放 线 菌 发 酵 液 对 FOC 4 菌 丝 生 长 的 影
响［11］：在熔融态的 PDA 培养基中加入拮抗菌发酵
滤液，摇匀制成平板。将直径为 6 mm 的 FOC 4 靶
标菌接种至平板中央，于 28℃恒温培养箱中倒置培
养 5 d 后，观察 FOC 4 菌丝的生长情况，并用显微
镜观察各处理的 FOC 4 菌丝形态变化，以纯培养的
FOC 4 菌落边缘菌丝为对照，每处理重复 3 次。
拮抗放线菌发酵液对 FOC 4 孢子萌发的影响 ：
将拮抗菌发酵滤液与 FOC 4 孢子悬浮液等体积混合
均匀并置于玻片上，于温度为 28℃，湿度为 80% 的
人工气候箱中光照培养 24 h，每一处理设 5 个重复。
取出玻片在显微镜下观察孢子的萌发情况（以孢子
萌发的芽管长度达到或超过孢子直径长度的一半定
为萌发）［12］，并计算各处理的孢子萌发率，以无菌
水处理为对照（CK），以 5 次重复的平均值作为测
定结果。
孢子萌发抑制率（%）=［（对照孢子萌发率 -
处理孢子萌发率）/ 对照孢子萌发率］×100%
1.2.2 拮抗放线菌 1-g-59 对香蕉枯萎病的盆栽效果
测定 试验设 3 个处理 ：①处理 1，清水 ；②处理 2，
接种病原菌 + 拮抗放线菌 1-g-59 发酵液 ；③处理 3，
接种病原菌。每处理 15 株香蕉苗，重复 3 次。
拮抗菌发酵液与病原菌孢子悬浮液的制备方法
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期126
同 1.2.1.3。
采用蘸根浸菌法接种［13］：用针刺伤香蕉组培苗
的根尖，再将根浸没于 1×106 cfu/mL 的孢子悬浮液
中，30 min 后移栽于盆钵中，并将剩余的病原菌孢
子悬浮液浇入栽有香蕉幼苗的土壤中，接种后置于
室温、自然光照条件下培养，常规的水肥管理。接
种病原菌 10 d 后，处理 2 施用拮抗菌发酵液，每株
灌注 100 mL。
病情分级 ：0 级为无症状 ；1 级为整株无变黄叶
片 ；2 级为 1-2 片叶萎蔫 ；3 级为全株 1/3-1/2 叶片
萎蔫 ；4 级为全株 1/2-3/4 叶片萎蔫 ；5 级为全株 3/4
以上叶片萎蔫或死亡。
DSI= ∑（病害的级别 × 该级别的植株数）/ 供
试植株数
相对防治效果（%）=［（对照病情指数－ 处理
病情指数）/ 对照病情指数］×100%
1.2.3 拮抗菌株的鉴定
1.2.3.1 形态特征 采用平皿插片法［14］，将菌株
1-g-59 接种于高氏一号固体培养基上，28℃培养 14 d，
取插片用台式扫描电镜进行菌株形态观察。
1.2.3.2 培养特征 参照《放线菌的分类和鉴定》［15］
和《链霉菌鉴定手册》［16］中的方法。将菌株 1-g-59
和 Streptomyces lunalinharesii RCQ1071T 分别接种于高
氏一号琼脂、酵母膏麦芽汁琼脂、燕麦片琼脂、无
机盐淀粉琼脂、葡萄糖天冬素琼脂、胨酵母膏铁琼
脂、酪氨酸琼脂等 7 种培养基中，28℃下培养 7-10 d，
观察菌丝体的颜色及可溶性色素情况。
1.2.3.3 细胞壁化学成分分析 采用 Hasegawa 等［17］
薄板层析法对菌株 1-g-59 进行全细胞水解液的氨基
酸和糖型分析。
1.2.3.4 生理生化特征 参照《放线菌的分类和鉴
定》和《链霉菌鉴定手册》中的方法观察菌株 1-g-59
和 Streptomyces lunalinharesii RCQ1071T 的生理生化特
性，进行明胶液化、鼠李糖、L-酪氨酸、木糖、棉子糖、
L-阿拉伯糖、精氨酸、蛋氨酸、淀粉酶水解、脲酶、
H2S 的产生等方面的检测。
1.2.3.5 16S rDNA 序列测定及其系统发育分析 基
因组 DNA 提取参照姜淑梅［18］的方法。根据放线
菌 16S rDNA 的结构特点，PCR 扩增选用通用引物
27 F ：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492 R ：
5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。反应体系 50 μL ：
1 μL 模板、1 μL 引物 1492 R 、1 μL 引物 27 F、25
μL PCR mastermix、22 μL ddH2O）。PCR 扩增程序 ：
94 ℃ 预 变 性 5 min ；94 ℃ 变 性 1 min，55 ℃ 退 火 1
min，72℃延伸 1.5 min，35 个循环 ；72℃终延伸 10
min，4℃保存。取 50 μL PCR 产物用 1% 的琼脂糖
凝胶进行电泳检测，在紫外灯下观察、并拍照保存。
电泳完成后的凝胶，经拍照保存后，对大小约
为 1 500 bp 的条带进行切胶回收。回收片段装入 2
mL 无菌离心管中，用爱思进生物技术有限公司提
供的 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行回收得到
DNA。回收得到的 DNA 用宝生物工程有限公司提供
的 pMD18-T Vector 进行克隆。将样品送至北京六合
华大基因科技股份有限公司进行测序。
经测序获得拮抗放线菌 1-g-59 的 16S rDNA 序
列，将该序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数
据进行比对分析（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
cgi），采用 BioEdit、Mega5.0 等软件对菌株进行系统
发育分析，采用邻接法（Neighbour-joining，NJ 法）
构建系统发育树。
2 结果
2.1 放线菌的分离与筛选
共分离出 117 株放线菌，采用平板对峙法进行
复筛，最终筛选出对 FOC 4 拮抗效果较强的 5 株放
线菌（表 1）。
表 1 五株放线菌的拮抗效果
编号 抑菌圈直径（cm） 拮抗效果
1-g-59 1.53aA ++++
混 -g2-65B 1.43bB ++++
3-M-03B 1.50aA ++++
混 -g2-65 1.28cC ++++
混 -g2-25A 0.90dD +++
抑菌圈直径 0.1-0.4 cm，拮抗效果记为“+”；0.5-0.7 cm 记为“++”；0.8-1.0
cm 记为“+++”；大于 1.0 cm 记为“++++”。同列数据后不同大、小写字母
分别表示 P<0.01 的极显著差异和 P<0.05 水平上的差异显著性，下同
2.2 5株拮抗放线菌发酵液对FOC 4抑制作用的测定
2.2.1 对 FOC 4 菌 丝 生 长 的 影 响 观 察 培 养 5 d
的 FOC 4 菌丝，发现经不同拮抗菌发酵滤液处理，
FOC 4 菌丝生长均受到不同程度的抑制，FOC 4 直
径均 <1.0 cm，混 -g2-65B 发酵滤液使 FOC 4 菌丝变
2013年第8期 127刘小玉等 ：香蕉枯萎病拮抗放线菌 1-g-59 的筛选与鉴定
为紫色，3-M-03B 发酵滤液使带靶标菌的培养基块
变黑，而 1-g-59 发酵液处理的 FOC 4 菌丝几乎消失，
靶标菌的培养基块变为黑色，且培养基块底部有浅
黄色黏性分泌物产生。此外，显微镜观察发现 1-g-59
发酵液处理的 FOC 4 菌丝体畸形、分枝增多、菌丝
破裂、消解 ；而对照 FOC 4 菌丝细长、光滑、均匀。
2.2.2 对 FOC 4 孢子萌发抑制作用的测定 结果表
明，对照组（CK）的 FOC 4 孢子萌发率达 92%，经
拮抗菌发酵液处理的 FOC 4 孢子萌发均受到不同程
度的抑制，混 -g2-25A 发酵液处理的 FOC 4 孢子萌
发率达 88%，抑制率为 4.3% ；混 -g2-65、3-M-03B、
混 -g2-65B 这 3 株拮抗菌发酵液处理的 FOC 4 孢子
萌发率均小于 6.25%，抑制率均大于 93.2% ；而 1-g-
59 发酵液处理的 FOC 4 孢子萌发率为 0，抑制率达
100%。图 1 为对照组（CK）和 1-g-59 发酵液处理
的 FOC 4 孢子萌发情况。
基上培养 5 d 后菌落呈灰白色，单菌落成不规则的
圆形，表面干燥、有皱纹。基内菌丝黄褐色，气生
菌丝灰白色，无可溶性色素。通过台式扫描电镜观察，
发现该菌株气生菌丝发达，非轮生，孢子成直或柔
曲的链，气生菌丝形成孢子链，孢子为圆柱状（图 2）。
A B
A ：CK（250×）；B ：1-g-59 发酵液处理（250×）
图 1 1-g-59 发酵液对 FOC 4 孢子萌发的影响
2.2.3 拮抗放线菌 1-g-59 发酵液对香蕉枯萎病的盆
栽效果测定 移栽 14 d 后，处理 3（只接种病原菌）
的植株出现黄叶，28 d 后处理 3 的植株出现假茎开
裂，45 d 后处理 3 的蕉苗发病严重，有的植株枯死，
病情指数为 4.24 ；处理 1（清水）的植株均健康生
长 ；处理 2（病原菌 + 发酵液）病情指数为 1.49，
防治效果为 64.9%（表 2）。结果表明，拮抗放线菌
1-g-59 发酵液对香蕉枯萎病有一定的防治效果。
表 2 1-g-59 发酵液对香蕉枯萎病的盆栽防治效果
处理 香蕉植株数（株） 病情指数 防治效果（%）
处理 1（清水） 45 0cC -
处理 2（病原菌 + 发酵液） 45 1.49bB 64.9
处理 3（病原菌） 45 4..24aA -
2.2.4 拮抗放线菌 1-g-59 的分类鉴定
2.2.4.1 形态学特征 菌株 1-g-59 在高氏一号培养
图 2 菌株 1-g-59 的孢子链照片（6 400×）
2.2.4.2 培养特征 由表 3 可以看出，菌株 1-g-59
在 7 种培养基中均能生长，但在无机盐淀粉琼脂和
甘油天门冬酰胺琼脂培养基上生长得慢，产孢较少；
在不同培养基上，基内菌丝颜色有黄褐色、灰黄色、
灰色 ；气生菌丝有灰色、灰白色、白色 ；在 7 种培
养基中均不产生可溶性色素。
表 3 菌株 1-g-59 在不同培养基上的生长特征
培养基 生长情况 基内菌丝 气生菌丝 可溶色素
高氏一号培养基 生长快，产孢多 黄褐色 灰白色 -
酵母膏麦芽汁琼脂 生长快，产孢多 黄褐色 灰白色 -
燕麦片琼脂 生长快，产孢多 灰色 灰白色 -
无机盐淀粉琼脂 生长慢，产孢少 灰色 灰色 -
甘油天门冬酰胺琼脂 生长慢，产孢少 黄褐色 灰色 -
胨酵母膏铁琼脂 生长快，产孢多 黄褐色 灰白色 -
酪氨酸琼脂 生长快，产孢多 灰黄色 白色 -
- ：表示不产生可溶色素
2.2.4.3 细胞壁化学成分 菌株 1-g-59 全细胞水解
液中含有 L，L-DAP 和甘氨酸，细胞壁属于 I 型，无
特征性糖，糖型 C，进一步验证菌株 1-g-59 为链霉
菌属。
2.2.4.4 生理生化特征 由表 4 可以看出，菌株 1-g-
59 能利用 L-酪氨酸木糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、精
氨酸、蛋氨酸 ；不能利用棉子糖 ；水解淀粉能力弱 ；
明胶液化。菌株 1-g-59 与 Streptomyces lunalinharesii
的生理生化特征基本相同。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期128
表 4 菌株与 Streptomyces lunalinharesii 表型特征的比较
特征 菌株 1-g-59 Streptomyces lunalinharesii
明胶液化 + NR
淀粉酶水解 - NR
脲酶 + +
L-酪氨酸 + +
木糖 + -
L-阿拉伯糖 + +
鼠李糖 + +
棉子糖 - -
精氨酸 + +
蛋氨酸 + +
+ ：阳性 ；- ：阴性 ；NR ：没有记录
2.2.4.5 16S rDNA 序列测定及其系统发育分析 将
菌 株 1-g-59 的 16S rDNA 进 行 PCR 扩 增 得 到 一 条
1 500 bp 左右的条带，经序列测定，其大小为 1 576
bp。将其 DNA 序列与 NCBI 数据库中相应的 DNA
序列进行 BLAST 相似性分析，结果表明，与菌株
1-g-59 的 16S rDNA 同源性较高的均为链霉菌，其
中 与 之 同 源 性 最 高 的 是 Streptomyces lunalinharesii
RCQ1071T，相似性达 99.26%。根据序列同源性从高
到低的原则，挑取 11 株菌株的 16S rDNA 序列，运
用 BionEdit、Mega5.0 软件构建系统发育树（图 3），
菌株 1-g-59 与 Streptomyces lunalinharesii RCQ1071T 处
于同一分支，亲缘关系最近。
Streptomyces albulus ISP 5492T AB024440
Streptomyces noursei NBRC 15452T AB184678
Streptomyces yunnanensis YIM 41004T AF346818
1-g-59
Streptomyces lunalinharesii RCQ1071T DQ094838
Streptomyces albospinus NBRC 13846T AB184527
Streptomyces chattanoogensis DSM 40002T AJ621611
Streptomyces lydicus NBRC 13058T AB184281
Streptomyces albofaciens JCM 4342T AB045880
Streptomyces sioyaensis NRRL B-5408T DQ026654
Streptomyces libani subsp. libani NBRC 13452T AB184414
Streptomyces tubercidicus DSM 40261T AJ621612
95
100
99
95
84
87
98
55
51
0.002
3 讨论
近年来土传病害的防治研究在中国发展很快，
尤其是在水稻、小麦和油菜方面，已有防治稻瘟病、
纹枯病、菌核病等病害的生物农药相继问世［19］。但
香蕉枯萎病的生物防治研究起步较晚，目前还没有
成功的商业化产品。本研究从蕉园的根际土壤中分
离出 117 株放线菌，通过筛选获得 5 株对 FOC 4 具
有较强拮抗效果的放线菌，其中菌株 1-g-59 的拮抗
效果最强，对 FOC 4 的菌丝生长和孢子萌发的抑制
作用最大，其发酵液处理的靶标菌培养基块底部有
浅黄色黏性分泌物产生，这有可能是拮抗菌发酵液
产生的具有抑制 FOC 4 菌丝生长的分泌物，其成分
有待进一步研究。菌株 1-g-59 发酵液能使 FOC 4 菌
丝体畸形、分枝增多、菌丝破裂、消解，还能有效
地抑制 FOC 4 孢子萌发，这与文献报道［20，21］生防
菌的作用机制一致 ；且其发酵液对香蕉枯萎病的盆
图 3 依据 16S rDNA 序列构建菌株 1-g-59 与链霉菌属相关种的系统发育树
栽防治效果达 64.9%，说明该菌株可能产生对 FOC
4 有拮抗效果的活性物质，具有较好的开发价值。
菌株 1-g-59 具有典型的链霉菌特征，16S rDNA
序列分析表明菌株1-g-59 与 Streptomyces lunalinharesii
RCQ1071T 序列相似性达 99.26%，在系统发育树上
处于同一分支，亲缘关系最近，且经研究发现二者
的形态特征、培养特征、生理生化特征基本相同［22］，
因此鉴定菌株 1-g-59 为 Streptomyces lunalinharesii。
本研究为该菌株今后的应用、香蕉枯萎病的生
防菌制剂的开发奠定了基础，该菌株的抑菌活性成
分以及其抑菌机理还有待进一步的深入研究。
4 结论
通过分离和筛选获得 5 株对 FOC 4 具有拮抗作
用的放线菌，其中以菌株 1-g-59 活性最强。菌株 1-g-
59 发酵液能使 FOC 4 菌丝全部消失，且其对 FOC 4
孢子萌发的抑制率达 100%。菌株 1-g-59 发酵液对香
2013年第8期 129刘小玉等 ：香蕉枯萎病拮抗放线菌 1-g-59 的筛选与鉴定
蕉枯萎病的盆栽防治效果达 64.9%。鉴定菌株 1-g-59
为 Streptomyces lunalinharesii。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）