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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):189-194
Sox（SRY-related HMG-box） 基 因 是 一 类 SRY （sex-determining region of Y chromosome）相关基因，
收稿日期 ： 2014-09-16
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31272655），国家科技支撑计划项目（2012BAD26B04），上海市科委重点基础科研基金项目（11JC140
4600），上海高校水产学一流学科建设项目（B5005120001）
作者简介 ：杨国翠，女，硕士研究生，研究方向 ：中华绒螯蟹生殖与发育 ；E-mail ：554025117@qq.com
通讯作者 ：邱高峰，男，教授，博士生导师，研究方向 ：虾蟹分子遗传与繁殖 ；E-mail ：gfqiu@shou.edu.cn
中华绒螯蟹性腺特异表达蛋白 EsSOX21b-like 的原核
表达与抗体制备
杨国翠  崔峥  邱高峰
（上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： Sox（SRY-related HMG-box）基因编码一类重要的转录因子，其产物都具有一个 HMG 基序保守区。之前我们在中
华绒螯蟹分离鉴定了一个只在性腺中特异表达转录本 EsSox21b-like，为了验证 EsSOX21b-like 蛋白是否也在中华绒螯蟹性腺中特异
表达，本研究原核表达了 EsSOX21b-like 蛋白，即将 EsSox21b-like 基因序列克隆到 pGEX-2T 表达载体，构建重组表达质粒 pGEX-
2T-EsSox21b-like，转化大肠杆菌 BL21，IPTG 诱导融合表达，经 SDS-PAGE 分析表明，融合蛋白主要以包涵体形式存在，分子量约
为 54 kD。利用 Ni 柱亲和纯化融合蛋白后免疫家兔，制备了多克隆抗体，Western blotting 检测表明该抗体能特异地识别性腺组织
中 EsSOX21b-like 蛋白，而在其他组织未检测到其表达，目的蛋白分子量约为 28 kD，在精巢组织中的表达量比在卵巢中高，该结
果暗示 EsSOX21b-like 可能在性腺发育过程中起重要调控作用。
关键词 ： 中华绒螯蟹 ；EsSOX21b-like 蛋白 ；原核表达 ；抗体制备
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.030
Prokaryotic Expression，Antibody Preparation of Gonad-specific
Protein EsSOX21b-like of the Chinese Mitten Crab Eriocheir sinensis
Yang Guocui Cui Zheng Qiu Gaofeng
（Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization Certificated by Ministry of Agriculture and Shanghai Ocean
University，Shanghai 201306）
Abstract: The Sox（SRY-related HMG-box）is a large family of genes which encode transcription factors with high-mobility-group
DNA binding domain related to the SRY（sex determining region Y）. In previous studies we isolated and identified EsSox21b-like transcripts
exclusively expressed only in gonads of the Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）, this study is to verify whether EsSOX21b-like protein is
also specifically expressed in the gonad. Gene EsSox21b-like was cloned to expression vector pGEX-2T, the recombinant prokaryotic expression
plasmid pGEX-2T-EsSox21b-like was constructed, then transferred into host Escherichia coli BL21, and induced by IPTG. SDS-PAGE analysis
revealed that the fusion protein was expressed as inclusion body with the molecular weight of 54 kD. The recombinant proteins were subsequently
purified by Ni+ affinity chromatography. Then the purified protein was used to immunize rabbits for preparation of the EsSOX21b-like antibody.
Western blotting detection showed the antibody specifically recognized the EsSOX21b-like protein in the gonad, with molecular weight of 28 kD,
whereas no expression was detected in other tissues. The expression level of the target protein was much higher in testis than that in ovary. This
result implied that the EsSOX21b-like protein could have a regulatory role in the gonad development.
Key words: Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）；EsSOX21b-like protein ；prokaryotic expression ；antibody preparation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6190
编码一系列转录因子，参与性别决定与分化、骨组
织发育、血细胞生成、神经系统发育、晶状体发育
等多种早期胚胎发育过程［1］。SRY 基因是哺乳动物
雄性性别决定基因，对睾丸的发育有着决定性的影
响，它首先在人类 Y 染色体上发现，是 Sox 基因家
族的第一个成员［2］。其产物含有一个 HMG 盒［3］，
能够与 DNA 特异性结合，调控其转录。之后研究
发 现 了 许 多 与 SRY 相 关 的 Sox 基 因，Sox3、Sox5、
Sox6、Sox8、Sox9、Sox17 等都是参与性别分化的重
要基因。Sox9 基因雄鼠胚胎精巢中表达，具有促使
精巢支持细胞分化的作用［4 ；5］。在小鼠中 Sox9 基因
的缺失导致 XY 向 XX 的性反转现象［6］。Sox3 是与
SRY 同源性最高的基因［7］，但是并不直接参与睾丸
的分化和发育，Graves［7］认为在雌性中，Sox3 表达，
抑制了 Sox9 的表达 ；在雄性中 SRY 抑制 Sox3，Sox9
得以表达，从而决定睾丸的形成。Sox8 也是哺乳动
物睾丸决定途径相关的基因，能够促进 Sox9 在睾丸
形成中的作用。但是，Sox8 基因缺陷的小鼠睾丸发
育正常［8］。另外，Sox5、Sox6 在小鼠的减数分裂后
的生殖细胞中表达，尤其是在精细胞阶段［9］；Sox17
则在减数分裂前的精母细胞中表达［10］。
水产动物中也发现存在 Sox 基因，参与性别决
定与分化过程。虹鳟中 Sox24 作为转录因子在卵子
发生过程起作用［11］。黄鳝 Sox17 在精巢、卵巢和两
性腺中表达，特别是在卵巢、两性腺和精巢片层及
生精细胞中含量更高，可以推测 Sox17 对黄鳝自然
性反转过程中的性腺发育有重要作用［12］。鲈鱼在
150 d 性别分化开始时 Sox17 在雌雄性腺中均表达，
在 250 d 能观察到明显的性别差异时，雌鱼 Sox17
表达量明显高于雄鱼，并且其 RNA 水平与芳香化
酶相关，可能参与卵巢发育［13］。另外鲈鱼中还发现
存在 Sox19 与卵巢分化相关［14］。但是在甲壳类动物
中 Sox 基因是否参与性别决定与分化过程目前尚不
清楚。
本研究组之前在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）
克 隆 得 到 只 在 性 腺 中 特 异 表 达 转 录 本 EsSox21b-
like［15］，并在 RNA 水平分析了 Sox 基因的组织表达，
结果显示 EsSox21b-like 基因在精巢、卵巢中均有表
达，推测 EsSox21b-like 可能参与性腺的发育。为验
证 EsSox21b-like 基因在蛋白水平的表达及作用，本
研究组构建了 EsSOX21b-like 蛋白原核表达质粒，并
在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，纯化重组蛋白，
制备 EsSOX21b-like 多克隆抗体，并对抗体进行免疫
学鉴定，旨为进一步研究中华绒螯蟹性别决定与分
化机制提供强有力的工具。
1 材料与方法
1.1 材料
中 华 绒 螯 蟹 购 自 当 地 水 产 市 场。 大 肠 杆 菌
（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3） 感 受 态 细
胞、原核表达载体 pGEX-2T 为本实验室保存，Trizol
购 自 Invitrogen。First strand cDNA synthesis kit，Ex-
Taq DNA 聚 合 酶 和 T4 DNA 连 接 酶 购 自 TaKaRa。
BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ购自 Promega。PCR 纯化产物试
剂盒、低分子蛋白 Marker、预染蛋白 Marker、SDS-
PAGE 各组分购自上海天根生化科技公司。His-select
Spin Columns 纯化试剂盒、His 标签抗体购自 Sigma。
辣根过氧化物标记的山羊抗鼠、山羊抗兔 IgG 购自
艾比玛特。DAB 显色剂购自武汉博士德生物工程有
限公司。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建 使用 Trizol Reagent 提
取中华绒螯蟹性腺总 RNA，经 DNase Ⅰ处理后，按
First strand cDNA synthesis kit 说明书进行反转录，获
得的 cDNA 作为模板，扩增 EsSox21b-like 基因。根
据本实验室已克隆到的中华绒螯蟹 EsSox-like 基因全
长 cDNA 序列，利用 Primer 5 软件设计特异引物（表
1），扩增 EsSox-like 编码区序列。同时，该对引物的
5 端分别加入 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切位点，另外，
在下游引物紧邻终止密码子的 3 端引入编码 6 个
组氨酸核酸序列。反应条件为 ：94℃预变性 3 min，
94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1.5 min，共 30 个循环 ；
最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物用柱纯化回收与
pGEX-2T 分别进行 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切（37℃，
2 h），酶切产物纯化，16℃连接过夜。连接产物转
化大肠杆菌 DH5α，菌落 PCR 筛选阳性克隆，扩大
培养阳性克隆提取质粒（天根质粒抽提试剂盒），经
BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切鉴定和测序（上海美吉生
物），确定插入片段序列正确性。
1.2.2 工程菌的诱导表达 重组质粒转化大肠杆菌
2015,31(6) 191杨国翠等：中华绒螯蟹性腺特异表达蛋白 EsSOX21b-like 的原核表达与抗体制备
BL21（DE3）。挑选阳性菌落接种于液体培养基中，
37℃，振荡培养过夜。次日按 1∶100 的比例在含
有 Amp+（终浓度为 60 μg/mL）的液体培养基中扩大
培养至 OD595 介于 0.4-0.6 之间，加 IPTG 诱导表达。
离心收集菌体（5 000 r/min，5 min 4℃），用 1×PBS
重悬菌体，冰浴下超声波破碎（超声时间 4 s，间歇
时间 4 s，保护温度 24℃，总时间 90 次）。12 000 r/min
4℃离心 10 min，沉淀用含 8 mol/L 尿素的 1×PBS 重
悬，分别取等量的上清和重悬液 SDS-PAGE（5% 浓
缩胶，12% 分离胶）电泳，考马斯亮蓝 R250 染色过夜，
充分脱色后观察并分析结果。
1.2.3 Western blotting 检测融合蛋白 重组蛋白经
SDS-PAGE 分析后，使用半干转移膜将重组蛋白转
移到硝酸纤维 NC 膜上。含 10% 小牛血清的 TTBS
室温封闭 1 h，1∶1 000 稀释的 His 标签单抗为一
抗 4℃ 孵 育 过 夜，TTBS 洗 涤 3 次，1∶3 000 稀 释
的 HRP 标记山羊抗兔的 IgG 为二抗，室温孵育 2 h，
TTBS 缓 冲 液 洗 涤 3 次， 去 除 非 特 异 性 结 合， 用
DAB 显色液（DAB 15 mg、甲醇 5 mL、30% 双氧水
15 μL）显色。
1.2.4 EsSOX21b-like 多克隆抗体的制备及检测 用
His-select Spin Columns 纯化试剂盒纯化的重组蛋白
经弗氏佐剂乳化后免疫 2 只成年健康的大白兔。初
次免疫后，每隔 2 周加强免疫 1 次，第 5 次免疫后
8 d 处死兔子。取全血分离血清，抗原亲和纯化血清。
1.2.5 组织蛋白的提取以及抗血清的检测 分别取
50 mg 精巢、卵巢、心脏、肝胰腺、肌肉、胸神经
节和鳃组织与 2 mL 离心管中，加入 1 mL 组织蛋白
抽提液（博士德），于冰上充分匀浆后 4℃ 12 000
r/min 离心 10 min，取上清。SDS-PAGE 电泳，转膜，
适度稀释的 EsSOX21b-like 多克隆抗体为一抗，HRP
标记的山羊抗兔 IgG 为二抗进行 Western 检测。
2 结果
2.1 原核表达载体的构建
以中华绒螯蟹性腺 cDNA 为模板，PCR 扩增，
琼脂糖凝胶电泳得到一条约 800 bp 的条带，与目
的片段大小基本一致。将其克隆至原核表达载体
pGEX-2T 中，得到重组质粒。BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双
酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳（图 1）显示在 800
bp 处有条带。同时测序结果也显示，克隆得到的序
列与 EsSox21b-like ORF 一致，并且在其终止密码子
前成功的引入了编码 6 个组氨酸的核酸密码子序列。
将重组质粒命名为 pGEX-2T-EsSox21b-like。
表 1 构建 EsSox21b-like 原核表达载体使用的 PCR 特异
引物
引物名称 序列（5-3）
EsSox-like F 5CGGGATCCATGAACCAGGTTCCGTCACC3
EsSox-likeR 5CGCGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGGAAA-
ATCACCAGAGCGGGTC3
注 ：BamH Ⅰ 和 EcoR Ⅰ酶切位点用下划线标出，下游引物终止密码子用
方框标出，6×His-tag 用波浪线标出
1 2
200
600
1000
1600
2000
4000
bp
M
M ：200 bp DNA Marker ；1 ：pGEX-2T-EsSox21b-like 重组质粒 ；
2 ：pGEX-2T-EsSox21b-like 重组质粒双酶切
图 1 重组质粒 pGEX-EsSox21b-like 双酶切图
2.2 重组蛋白的表达及检测
重 组 质 粒 pGEX-2T-EsSox21b-like 转 化 大 肠 杆
菌 BL21（DE3）。IPTG 诱导，超声破碎，离心分离
沉 淀 与 上 清，SDS-PAGE 电 泳 分 析。 与 未 经 IPTG
诱导的工程菌相比，诱导组的沉淀中有一条明显
加粗的条带（图 2，箭头），分子量约 54 kD，这与
EsSox21b-like 基因编码的蛋白分子量（28 kD）和
pGEX-2T 上携带的 GST 标签蛋白（图 2，箭头）分
子量（26.3 kD）总和相当。在分离的上清中则未检
出相应的条带。
为了证实重组蛋白的表达，使用 His 标签抗体
做为一抗进行 Western blotting 分析，免疫检测发现
在 54 kD 处有特异性条带（图 3）。说明经过诱导后
能成功的获得融合蛋白，且该融合蛋白主要以包涵
体的形式存在。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6192
2.3 EsSOX21b-like抗体的制备与免疫鉴定
纯化后的重组蛋白分 5 次注射免疫 2 只家兔，
制备 EsSO21b-like 多克隆抗体。第 5 次免疫后采血，
抗血清用包被有重组 EsSOX21b-like 蛋白的酶标板进
行间接 ELISA 反应，每孔用 100 μL 浓度为 1 μg/mL
的抗原包被，用酶标仪读取 450 nm 下的光吸收值，
吸光度（OD 值），结果（表 2）显示 2 只兔在第 5
次免疫后，其血清分别在 1∶8 000和 1 ∶16 000 的
稀释度下，OD 值大于 1.000，说明制备的多抗效价高。
使用制备的 EsSOX21b-like 多抗检测 EsSOX21b-
like 蛋白的组织分布情况。Western blotting 结果（图
4）显示中华绒螯蟹精巢、卵巢的蛋白提取物中能够
检测到特异性条带，且该特异性条带所对应的蛋白
分子量与软件预测的 EsSOX21b-like 蛋白分子量（28
kD）大小相等。而心脏、肝胰腺、肌肉、胸神经节
和鳃组织总蛋白中则不能检测到特异性条带。该结
果说明制备的 EsSOX21b-like 多克隆抗体能有效的与
目的蛋白结合，EsSOX21b-like 蛋白在性腺组织中特
异表达，并且在精巢组织中表达量高于卵巢。
1 2 3 4 5 6
26.0
33.0
45.0
66.2
94.0
kD
M
M ：蛋白分子量标准 ；1-2 ：pGEX-2T-EsSox21b-like 诱导裂解后上清和沉淀，
箭号示表达目的蛋白 ；3-4 ：pGEX-2T-EsSox21b-like 未诱导裂解后上清和沉
淀 ；5-6 ：pGEX-2T 空质粒诱导裂解后沉淀和上清，箭头示 pGEX-2T 空质粒
表达的小分子标签蛋白
图 2 pGEX-2T-EsSox21b-like 融合蛋白表达产物的 SDS-
PAGE 检测
54
kD
图 3 His 抗体检测 EsSOX21b-like 重组蛋白的 Western
blotting 分析
表 2 ELISA 法检测抗体效价
dilution 1∶1 000 1∶4 000 1∶8 000 1∶16 000 1∶32 000
Rabbit 1 serum 1.371 1.129 1.019 0.893 0.646
Rabbit 1 negative 0.082 0.076 0.074 0.053 0.051
Rabbit 2 serum 1.967 1.756 1.455 1.132 0.867
Rabbit 2 negative 0.042 0.057 0.061 0.049 0.043
Mu Th Gi T He L O
28
kD
Mu ：肌肉 ；Th ：胸神经节 ；Gi ：鳃 ；T ：精巢 ；He ：心脏 ；
L ：肝胰腺 ；O ：卵巢
图 4 EsSOX21b-like 抗体检测不同组织总蛋白
3 讨论
本研究通过 IPTG 诱导、超声波破碎工程菌，
在沉淀中检测到融合表达的目的蛋白，并且用 His-
select Spin Columns 纯化获得的融合蛋白能够有效地
免疫家兔获得效价高、特异性强的 EsSOX21b-like
蛋白的多克隆抗体。相反，在离心后的上清液中没
有检测到可溶性的融合蛋白，说明表达的蛋白以包
涵体形式存在。与具有活性的可溶性蛋白相比包涵
体蛋白具有相同的一级结构，不影响抗体制备，只
是由于肽链无法正确折叠形成二、三级结构而不具
有生物活性［16］。包涵体蛋白经过变性、洗涤、复
性、纯化等一系列处理过程最终可以转变为活性蛋
白［17］。之前许多研究表明，原核表达也可以获得有
活性的可溶蛋白［18-21］，其中 IPTG 的诱导至关重要，
可以通过减少 IPTG 的诱导量和诱导时间控制目的蛋
白表达量，避免包涵体的形成 ；温度对蛋白的可溶
性也有很大的影响，如范丙友［21］通过降低温度等
成功获得了可溶性的香豆酸 ：辅酶 A 连接酶。除此
2015,31(6) 193杨国翠等：中华绒螯蟹性腺特异表达蛋白 EsSOX21b-like 的原核表达与抗体制备
之外，以大肠杆菌为宿主细胞进行原核表达时，还
可以在培养基中加入一些能促进重组蛋白质可溶性
表达的生长添加剂，如高浓度的多醇类、蔗糖或非
代谢糖（阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应）、乙
醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子质量的巯基
或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响
二硫键的形成）和 NaC1 等来增加融合蛋白的溶解
度［22］。后续我们拟采用以上各种实验方法进行直
接诱导表达以其获得具有活性的目的蛋白，为研究
EsSOX21b-like 蛋白生物学功能奠定必不可少的物质
基础。
Sox21 基因是 SoxB 基因亚族中的重要一员，在
脊椎动物与无脊椎动物中均有发现。在小鼠，Sox21
在未成熟神经系统脑室区表达，而在成熟脑内其表
达则限制在脑室下区，进一步的研究证实 Sox21 在
小鼠神经系统发育过程能抑制神经元分化［23］。另外，
Sox21 在小鼠的耳蜗中也有表达，且 Sox21 缺陷型
小鼠表现出轻度听力障碍［24］。在斑马鱼，Sox21 存
在 Sox21a 与 Sox21b 两种亚型，Sox21a 在脑、皮肤、
肠及卵巢中表达，而 Sox21b 除了影响性腺的正常
发育外对晶状体的正常发育也会起到一定的调控作
用［25，26］。Sox21b 基因在蜂王卵巢管中的滋养细胞及
其卵子中也有较强表达，在蜜蜂卵巢发育及成熟过
程中发挥其功能［27］。蜜蜂在分类系统上与中华绒螯
蟹同属于节肢动物门，其亲缘关系更加紧密，故彼
此相同的基因在表达特征与功能上应该相近或相同。
之前我们的研究结果表明，中华绒螯蟹 EsSox21b-
like 基因的 mRNA 仅局限在精巢和卵巢表达，暗示
在精子的发生及卵细胞的发育过程中发挥作用。本
研究在蛋白水平进一步证明 EsSOX21b-like 在性腺
中特异表达，且在精巢组织中表达量明显高于卵巢，
推测该蛋白可能是精巢发育必不可少的因子。
4 结论
本研究以中华绒螯蟹性腺为模板，设计特异
性引物，扩增 EsSox21b-like 的开放阅读框，克隆至
pGEX-2T 表达载体，在大肠杆菌中表达 EsSOX21b-
like 重组蛋白。SDS-PAGE 结果显示，EsSOX21b-like
重组蛋白主要以包涵体形式存在。大量表达重组蛋
白，亲和层析纯化后免疫家兔，得到高效价的多克
隆抗体。Western blotting 检测中华绒螯蟹不同组织
EsSOX21b-like 蛋白表达情况，结果显示 EsSOX21b-
like 蛋白在性腺中特异表达，尤其在精巢中表达量
高，而在其他组织中不表达，推测 EsSOX21b-like 在
性腺发育中具有重要的调控作用。
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（责任编辑 李楠）