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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
1990 年，Sinclair 等［1］克隆获得人类 Y 染色体
上的性别决定基因 SRY（Sex-determining region of Y
chromosome，SRY）。随后其他研究者在哺乳类、鸟
类、爬行类、鱼类、节肢动物等物种［2-7］克隆获得
了许多与 SRY 基因同源的基因，被命名为 Sox 基因
收稿日期 ：2013-11-06
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31272655），国家科技支撑计划项目（2012BAD26B04），上海市科委基础重点科研项目（11JC1404600），
上海高校水产学一流学科建设项目（B5005120001）
作者简介 ：刘志强，男，硕士，研究方向 ：中华绒螯蟹生殖与发育 ；E-mail ：liu503212225@sohu.com
通讯作者 ：邱高峰，男，教授，博士生导师，研究方向 ：虾蟹分子遗传与繁殖 ；E-mail ：gfqiu@shou.edu.cn
中华绒螯蟹 EsSox21b-like 基因干扰载体的构建及
原核表达制备 dsRNA
刘志强  陈洁  邱高峰
（上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： Sox（SRY-related HMG-box）基因是一类重要的转录因子，在动物的性别分化与决定、器官的发生等方面具有重要
的调控作用。旨在利用 RNA 干扰技术证实该基因的功能，将 EsSox21b-like 基因 617 bp 的片段克隆至含有两个 T7 启动子的 L4440
载体上，构建了 EsSox21b-like-L4440 干扰载体，将该重组载体转化至 RNase Ⅲ缺陷型的 HT115 菌株中，经 IPTG 诱导菌株体内转录，
获得了 EsSox21b-like 正义和反义单链 RNA，经过变性、退火形成大量双链 RNA（EsSox21b-like-dsRNA），能满足以后应用 RNA 干
扰试验对于 EsSox21b-like 基因功能的研究。
关键词 ： 中华绒螯蟹 RNA 干扰 L4440 HT115 原核表达 dsRNA
Construction of Interference Vector of EsSox21b-like Gene from
Chinese Mitten Crab（Eriocheir sinensis）and Preparation of dsRNA
by Prokaryotic Expression
Liu Zhiqiang Chen Jie Qiu Gaofeng
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract:  Sox（SRY-related HMG-box）gene is a kind of important transcription factor, which functions in sex determination,
organogenesis, etc. The gonad-specific expression of this novel gene suggested that it might play an important role in the development of gonad.
To determine the exact role of EsSox21b-like gene using RNA interference, a EsSox21b-like-L4440 interference vector was successfully
constructed for production of large amount of dsRNA. The target sequence of EsSox21b-like gene was inserted into the L4440 vector containing
two T7 promoters. Then the recombinant plasmid was transformed into HT115 bacteria, a RNase Ⅲ deficient strain. A large amount of EsSox21b-
like sense and antisense RNAs was simultaneously transcripted in vivo when induced by IPTG. After denatured and annealed, EsSox21b-like
double strand RNAs（dsRNAs）were produced and the yield of EsSox21b-like-dsRNA was enough for future RNA interference experiment on
the role of EsSox21b-like gene.
Key words:  Eriocheir sinensis RNA interference L4440 HT115 Prokaryotic expression dsRNA
（SRY-related HMG-box gene）［8］。不同物种的 Sox 基
因编码的蛋白质均具有一个保守的 HMG 盒［9］，能
与特定 DNA 序列相结合，调控特定基因的转录。亦
已证明，Sox 基因作为一种转录调控因子，在动物
性别决定、神经系统的发育、软骨的发生、胸腺细
2014年第6期 135刘志强等 ：中华绒螯蟹 EsSox21b-like 基因干扰载体的构建及原核表达制备 dsRNA
胞的发育、肿瘤细胞的发生等方面具有重要的调控
作 用［10，11］。 之 前， 我 们 从 中 华 绒 螯 蟹（Eriocheir
sinensis）分离鉴定了一个只在性腺中特异性表达的
EsSox21b-like 基因［12］，推测该基因可能在中华绒螯
蟹性腺分化与发育过程中发挥作用。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术是一
种高效、特异性沉默同源 mRNA 的敲减工具，可阻
断靶基因表达［13］，是研究基因功能［14］的有效方法，
而获得能使目的 RNA 降解的 dsRNA 是实施 RNA 干
扰技术的前提［15］。目前合成 dsRNA 主要是通过商
业试剂盒体外转录合成或者利用原核体内转录合成
两种方式［16，17］。利用商业试剂盒合成 dsRNA 成本高、
合成量小，所以该方法合成的 dsRNA 多用于线虫、
果蝇等一些小的模式生物的研究。对于一些经济价
值高、个体大的物种来说，要导入大量的 dsRNA
才能起到一定的干扰效果，因此，商业试剂盒合成
dsRNA 不能满足这些物种科研或生产的需要。与利
用商业转录试剂盒相比，原核体内转录合成 dsRNA
的方式经济高效。目前，通过该方法获得的 dsRNA
已被成功运用于果蝇、线虫、昆虫等一些生物的基
因功能研究中［18-24］，而在水产物种中仅有对虾［25］
等少数物种的基因功能研究使用了原核体内转录获
得的 dsRNA。本研究将中华绒螯蟹 EsSox21b-like 基
因 617 bp 的片段插入至 L4440 载体的两个 T7 启动
子之间，构建 EsSox21b-like-L4440 干扰载体（图 1）。
将该重组载体转化至 RNase Ⅲ缺陷性的 HT115 菌
株中，经 IPTG 诱导，菌株体内转录 EsSox21b-like
基因正义链和反义链 RNA，经过变性、退火获得
EsSox21b-like-dsRNA，旨在为以后利用 RNA 干扰技
术研究 EsSox21b-like 基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
中华绒螯蟹购自上海临港新城果园农贸市场，
用于提取卵巢的 RNA ；载体 L4440 与菌株 HT115 为
美国线虫遗传中心馈赠。
1.2 方法
1.2.1 卵巢 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 根据
RNAiso Plus（TaKaRa，Japan）说明书提供的操作步
骤提取中华绒螯蟹卵巢 RNA。提取的 RNA 经 DNA
酶处理去除 DNA 的污染后，利用反转录试剂盒（上
海天根生物技术公司）合成 cDNA 第一链。
1.2.2 RNA 干扰片段的选定与引物设计 利用 si-
RNA 在线分析软件对中华绒螯蟹的 EsSox21b-like 基
因进行分析，并结合基因结构域和保守位点选取有
效的干扰片段。根据对选择的 617 bp 的靶序列片段
和 L4440 质粒的酶切位点进行分析设计引物。引物
序 列 ：EsSox21b-likeF ：5-tccccgcggTGCCACCAAGA-
AGGAGGAC-3 ；EsSox21b-likeR ：5-ggactagtGCAA-
GGACGACGCTGACT-3。利用设计的引物和反转录获
得的 cDNA 第一链为模板进行 PCR 反应，获得目的
片段。
1.2.3 重 组 体 的 构 建 PCR 获 得 的 目 的 片 段 和
L4440 载体用限制性内切酶 Spe I 和 Sac II（Promega）
进行双酶切。酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳和割胶
纯化后连接过夜。
1.2.4 阳性克隆的筛选 将重组载体 L4440+EsSox-
21b-like 转化大肠杆菌 HT115 感受态，然后涂布到
选择性固体培养基培养。通过菌落 PCR、双酶切筛
选阳性克隆，并将筛选的菌液送测序公司（美吉测序，
上海）测序。
1.2.5 dsRNA 的合成 将测序正确的含 L4440+Sox
重组质粒的 HT115 菌株，接种到 4 mL 含氨苄和四
环素的液体 LB 培养基上过夜扩大培养。分别取 300
Spe I 䞦࠷ս⛩
Sac II 䞦࠷ս⛩
Spe I 䞦࠷ս⛩
Sac II 䞦࠷ս⛩
SacSox21b-likeสഐ Sac II, Spe I ৼ䞦࠷
L4440䍘㋂
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L4440䍘㋂
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EsSox21b-likeสഐ⡷⇥
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EsSox21b-likeสഐ⡷⇥
L4440+EsSox21b-likeสഐ⡷⇥
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图 1 干扰载体构建流程
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期136
μL 扩大培养的菌株接种到 30 mL 的 2×YT 培养基上，
37℃震荡培养至 OD595=0.5 左右，加入 57.6 μL（50
mg/mL）的 IPTG 诱导，继续培养 5 h 左右。
利用 Trizol 法提取诱导后培养菌株的 RNA，提
取 的 RNA 经 琼 脂 糖 电 泳 检 测 其 完 整 性。 用 RQ1
RNase-Free DNase 处理，去除可能混有的 DNA，然
后 72℃水浴变性 10 min，自然冷却至室温，退火形
成 dsRNA。加 RNaseA 检验退火是否得到 dsRNA。
通过琼脂糖电泳和分光光度计对得到的 dsRNA 进行
检测和浓度测定。
2 结果
2.1 重组载体的构建
提 取 的 中 华 绒 螯 蟹 卵 巢 RNA 经 RQ1 RNase-
Free DNase 去除 DNA 的干扰。利用反转录试剂盒合
成 cDNA 的第一链，以 cDNA 的第一链为模板，F1
和 R1 为引物 PCR 克隆获得 EsSox21b-like 基因的部
分片段。如图 2-A 可知，获得的目的片段与预期的
片段大小（617 bp）吻合。利用限制性内切酶 Spe I
和 Sac II 对 PCR 产物和载体 L4440 进行双酶切，电
泳检测酶切效果如图 2-B 所示。
粒进行的 PCR 仅仅扩增质粒 L4440 两个 T7 启动子
之间的序列，产物大小约为 200 bp。经过对重组质
粒用 Spe I 和 Sac II 进行双酶切后获得了与目的片段
大小（617 bp）一样的酶切片段（图 3-B）。进一步
对选择性培养基上长出的菌落进行测序，结果和目
的序列也完全吻合，说明目的片段已成功地插入到
载体 L4440 上。
M1
700
bp
500
1 2 M2
4000
bp
3000
3 4 5 6
800
600
A B
M1 ：100 bp DNA ladder Marker ；1，2 ：PCR 获得的目的片段 ；M2 ：200 bp
DNA ladder Marker ；3 ：未经双酶切的 L4440 空质粒 ；4 ：经 Spe I 和 Sac II
双酶切的 L4440 质粒 ；5 ：PCR 获得的目的片段 ；6 ：经 Spe I 和 Sac II 双酶
切的目的片段
图 2 EsSox21b-like 基因 PCR 产物（A）及目的片段和
L4440 双酶切验证（B）
2.2 阳性菌落的筛选
如图 3-A 所示，用 T7 单引物（5-TAATACGAC-
TCACTATAGGG-3）对在选择性培养基上长出的菌
落进行筛选时，得到其菌落 PCR 产物，包括插入的
617 bp 的目的片段和质粒 L4440 两个 T7 启动子之间
的部分序列，其大小约为 800 bp ；而对 L4440 空质
M1
800
bp
500
1 2
200
A
M2
1500
bp bp
600
3 4
500
617
B
M1，M2 ：100 bp DNA ladder Marker ；1 ：菌落 PCR ；2 ：L4440 空质粒 PCR ；
3 ：重组载体 ；4 ：经 Spe I 和 Sac II 双酶切的重组载体
图 3 重组载体菌落 PCR（A）及双酶切（B）检测
2.3 原核表达制备EsSox21b-like-dsRNA
提 取 经 过 IPTG 诱 导 后 和 未 经 诱 导 的 菌 株 的
RNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测发现，与未经 IPTG
诱导的菌株 RNA 相比，经过 IPTG 诱导的菌株的
RNA 包括转录的 600 bp 的目的片段和质粒 L4440 两
个 T7 启动子之间的部分序列，大小约为 800 bp（图
4-A）。 经 过 RQ1 RNase- Free DNase 处 理、72℃ 水
浴变性、然后退火冷却至室温，最后经 RNase 处理
该条带仍清晰可见（图 4-B）。经分光光度计测定，
溶解于 100 μL 去离子水中的 dsRNA 浓度为 5 837
M1
800
bp
500
1 2
A
↓ǃ৽ѹ䬮RNA
M2
bp
800
3 4
500
dsRNA
B
M1，M2 ：100 bp DNA ladder Marker ；1 ：菌液经过 IPTG 诱导后提取的 RNA ；
2 ：菌液未经 IPTG 诱导提取的 RNA ；3 ：变性、退火前的 RNA ；4 ：变性、
退火后的 dsRNA
图 4 原核表达制备的 EsSox21b-like-dsRNA
2014年第6期 137刘志强等 ：中华绒螯蟹 EsSox21b-like 基因干扰载体的构建及原核表达制备 dsRNA
μg/mL。
3 讨论
dsRNA 的制备是实施 RNA 干扰试验的条件，
一种操作简单，低成本制备 dsRNA 的方法可以便于
RNAi 在相关研究中的应用。目前常用制备 dsRNA
的方法有 2 种，体外转录法和体内载体表达法。与
利用商业试剂盒体外转录相比，细菌体内载体表达
可以经济高效的制备 dsRNA。可是，构建干扰表达
载体通常需要 3 步克隆实现［26］，虽然在研究斑节对
虾 kazal 型蛋白激酶抑制剂基因功能时，梁艳等［25］
利用商业载体 pGMT 和 pGRIVE 通过 2 步克隆的方
式成功的构建了干扰表达载体，但多步克隆带来的
繁琐操作依然不可避免。L4440 具有两个 T7 启动
子［27］，只需一步克隆，将目的片段插入到两个启
动子之间就可成功的构建出干扰表达载体。并且，
L4440 具有两个相同的启动子，因此，在 IPTG 诱导
时能转录获得几乎等量的正义链和反义链的 RNA，
从而使得在变性退火时有足够的正义或反义链 RNA
与其互补链退火形成 dsRNA。
正 义 和 反 义 链 RNA 的 浓 度 对 变 性 退 火 制 备
dsRNA 时有非常重要的影响，当对低浓度的正义链
和反义链 RNA 进行处理时很难获得 dsRNA 或者获
得的量很低，当增加正义链和反义链 RNA 的浓度时
便能高效地获得 dsRNA。这可能是由于经过变性处
理的低浓度的正义链和反义链 RNA，在还未“寻找”
到与之互补的 RNA 链时便自身发生链内互补序列的
退火结合，高浓度的 RNA 在退火时与互补链 RNA
结合的概率要高于自身互补结合的概率。HT115 菌
株是一种 RNaseIII 缺陷型菌株，因此通过诱导表达
的 EsSox21b-like 基因片段的 RNA 不会被降解，能够
大量保存下来，这就在浓度上保证了变性后的 RNA
能够顺利地互补结合形成 dsRNA。另外，合理地选
择培养基也能够有效地提高正义链和反义链 RNA 的
浓度。试验开始时选用加氨苄青霉素的 2×YT 培养
基，诱导表达后，正义链和反义链 RNA 浓度很低。
改用不加氨苄青霉素的 2×YT 培养基后，经过诱导，
能够获得高浓度的正义链和反义链 RNA。这可能是
由于加入抗生素后，细菌要把更多的物质和能量用
于合成适应氨苄青霉素环境的物质，而影响了转录
合成目的基因正义链和反义链 RNA。
本 试 验 通 过 原 核 体 内 转 录 的 方 式 仅 需 要 培
养 30 mL 的菌株便能获得约 0.5 mg/次的 EsSox21b-
like-dsRNA，而商业转录试剂盒合成 dsRNA 时，最
高 产 量 为 0.03 mg/次（RiboMAXTM Large Scale RNA
Production Systems—SP6 and T7 使用说明书）。可见
利用本试验方法能高效获得 dsRNA，仅需花费少量
的资金和时间即能合成足量的 EsSox21b-like-dsRNA
用于研究 EsSox21b-like 基因的功能。
4 结论
将中华绒螯蟹 EsSox21b-like 基因 617 bp 的目的
片段克隆至 L4440 载体上，构建了能够在原核体内
转录出目的片段正义链和反义链 RNA 的干扰表达
载体，并且通过对获得的目的片段正义链和反义链
RNA 进行变性、退火处理，制备了可用于以后 RNA
干扰试验的 EsSox21b-like-dsRNA。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）