全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
P19 胚胎瘤细胞（P19 embryonal carcinoma cells，
P19ECCs）［1］ 来源于 C3H/He 雄性小鼠的畸胎瘤，具
有多向分化潜能及较强的再生能力。例如，在 10-6M
RA 诱导下，向神经细胞方向分化，并分化为多种类
型的神经元及神经胶质细胞［2］，在此过程中，神经
发生过程中相关基因的表达模式与正常小鼠神经发
生过程相似。同时，与胚胎干细胞相比 P19 细胞具
收稿日期 ： 2013-04-22
基金项目 ：北京市自然科学基金项目（5112027）
作者简介 ：惠焕动，女，硕士研究生，研究方向 ：蛋白质相互作用 ；E-mail ：huihuandong@163.com
通讯作者 ：刘少君，E-mail ：liusj863@126.com
P19 细胞过表达外源 Necdin 对其细胞增殖的影响
惠焕动1  刘勇2  刘少君2
（1. 中南大学，长沙 410083 ；2. 军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850）
摘 要 ： 构建 PcDNA3.1/necdin 真核表达载体并制备稳定过表达 Necdin 的 P19 细胞克隆，检测稳定过表达 Necdin 对 P19 细
胞增殖的影响。从正常培养 P19 细胞提取 RNA 反转录成 cDNA，以此作为 PCR 模板扩增得到 necdin 目的基因，插入 PcDNA3.1
载体的 EcoR Ⅰ和 Xho Ⅰ位点 ；脂质体法将构建的真核表达载体 PcDNA3.1/necdin 转染 P19 细胞，G418 筛选后挑取细胞单克隆，
Western 印迹鉴定细胞单克隆中 Necdin 的表达水平。CCK-8 法检测过表达 necdin 对 P19 细胞增殖的影响。成功构建 PcDNA3.1/
necdin 真核表达载体并获得稳定高表达 Necdin 的 P19 细胞克隆，检测发现 P19 细胞过表达 Necdin 后其细胞增殖未发生明显变化。
P19 细胞稳定过表达外源 Necdin 对其细胞增殖无明显影响。
关键词 ： Necdin 载体构建 细胞转染 P19 细胞 过表达 细胞增殖
Effect of Overexpressed Exogenous Necdin on the Cell Proliferation of
P19 Embryonal Carcinoma Cells
Hui Huandong1 Liu Yong2 Liu Shaojun2
（1.Central South University，Changsha 410083 ；2. Department of Neurobiology，Institute of Basic Medical Sciences，
Academy of Military Medical Science，Beijing 100850）
Abstract:  It was to construct eukaryotic express vector PcDNA3.1/necdin and obtain the monoclonal P19 cell highly expressing necdin,
and then detect the effect of overexpressed necdin on the cell proliferation of P19 cell. Total RNA was extracted from normal P19 cells. RT-PCR
was used to amplify the aimed segments necdin which was then digested with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ and inserted into a eukaryotic expression
plasmid PcDNA3.1 to construct PcDNA3.1/necdin. The constructed vector was transfected into P19 cells through lipofectamine2000-mediated
transfer method. The transfected cells were treated with G418 until monoclonal cells appeared. Expression level of Necdin in monoclonal P19
cells was assayed by Western blot. CCK-8 method was utilized to detect the effect of overexpressed necdin on the cell proliferation of P19 cell.
Results showed that eukaryotic express vector PcDNA3.1/necdin was successfully constructed and obtained monoclonal P19 cells stably and
highly-expressing necdin. Detection of cell proliferation found no obvious change in P19 cells highly expressing necdin. The study showed that
overexpressed exogenous necdin have no obvious effect on the cell proliferation of P19 cells.
Key words:  Necdin Vector construction Cell transfection P19 embryonal carcinoma cells Overexpression Cell proliferation
有生长速度快，营养条件要求不高，诱导神经分化
的效率高等优势。另外，P19 细胞分裂快，培养条
件简单，可以在体外迅速大量扩增，多次传代也不
丧失其分化能力或改变遗传特性。鉴于以上独特优
势，P19 细胞是目前研究神经发生理想的体外试验
模型并广泛用于研究［3］。
Necdin 属于黑色素瘤相关抗原家族Ⅱ类成员，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期166
最早是由 Maruyama 等［4］首先在 P19 胚胎瘤细胞中
分离到的新蛋白。Necdin 主要表达于神经发生过程
和几乎所有的有丝分裂后神经元中［5］，并低表达于
正常培养的 P19 细胞中。研究发现 Necdin 能够促
进神经元的分化，抑制细胞增殖，与 p75 相互作用
调控细胞凋亡，与神经系统疾病 PWS 发生密切相
关［5-7］等，在神经系统发育过程中发挥重要作用。
如 Necdin 异位表达于 NIH-3T3 细胞能够强烈抑制细
胞增殖［8］，异位表达于 N1E-115 细胞能够参与细胞
周期调控［9］，还能够抑制 Rb 缺失的 SAOS-2 骨肉瘤
细胞集落形成［6］等。而高表达 Necdin 对 P19 细胞
增殖是否有影响，目前还没有相关研究报道，为探
讨这一问题我们展开以下研究。
1 材料与方法
1.1 材料
P19 细胞株、大肠杆菌 DH-5α、PcDNA3.1 由本
实验室保存 ；EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ等常用限制性内切酶、
T4 连接酶购自 TaKaRa 公司 ；LipofectamineTM2000 购
自 Invitrogen ；DNA Marker DL15000 和 DL2000、 质
粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、Trizol RNA 提
取 试 剂 盒、RT-PCR 试 剂 及 KOD plus 试 剂 均 购 自
TIANGEN ；DMEM 培养基和胎牛血清（FBS）购自
Gibco ；G418 购自 Sigma 公司 ；其他试剂均为国产分
析纯 ；重组质粒序列测定由上海生工测序完成 ；奥
林巴斯倒置荧光显微镜（OLYMPUS，Japan），型号
IX70。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据基因库（GenBank）提供的
小 鼠 基 因 necdin（NM_001008558.1） 序 列， 应 用
Primer Premier 5 和 DNAMAN 软件设计基因引物，引
物 F1 ：5-CGACTCGAGATGTCGG AACAAAGTAAG-
GACC-3，R1：5-CAGGAATTCTTAGTCCTCAGAGAC
ACTGCTG-3，F1、R1 中分别引入 EcoR I（GAATTC）、
Xho I（CTCGAG）酶切位点。
1.2.2 PCR 扩增 necdin 基因 从正常培养 P19 细胞
提取 RNA，反转录成 cDNA，以此为模板扩增 nec-
din 基因。两端引物为 1.2 中设计的引物。PCR 条
件 ：94℃ 2 min，然后以 94℃ 20 s、55℃ 30 s、 68℃
1 min 进行 35 个循环，68℃ 7 min。PCR 产物行 1%
琼脂糖凝胶电泳，将目的条带凝胶切下用胶回收试
剂盒回收后保存待用。
1.2.3 PcDNA3.1/necdin 载 体 构 建 质 粒 PcDNA3.1
和 1.3 中 扩 增 的 necdin 同 时 用 内 切 酶 EcoR Ⅰ、
Xho Ⅰ双酶切，电泳验证大小，琼脂糖凝胶回收试
剂盒将酶切电泳产物回收后，用 T4 Ligase 连接，构
建 重 组 质 粒 PcDNA3.1/necdin， 转 化 DH5α 感 受 态
细菌后，挑单克隆扩大培养，提取质粒，EcoR Ⅰ、
Xho Ⅰ双酶切鉴定。
1.2.4 P19 细胞培养及 G418 筛选 P19 细胞最佳浓
度的确定 P19 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的
DMEM 培养基中，于 37℃、5% CO2 环境培养。
正常培养的 P19 细胞，传代接种到 24 孔板，接
近 30% 的汇合度，分别加入终浓度 0、200、400、
600、800、1 000 μg/mL 的 G418，连续观察 4-7 d 后，
选取致使正常 P19 细胞完全死亡的最低 G418 浓度
作为后续筛选细胞克隆的最佳浓度。
1.2.5 稳定转染 PcDNA3.1/necdin 的 P19 细胞克隆
的制备
1.2.5.1 LipofectamineTM2000 转 染 及 G418 筛 选 经
过 24 h 培 养，P19 细 胞 汇 合 度 达 到 70% 至 90%
时，按 LipofectamineTM2000 转染说明书将重组质粒
PcDNA3.1/necdin 和 空 质 粒 PcDNA3.1（ 作 为 对 照 ）
同时转染至 P19 细胞。6 h 后细胞换全液，48 h 后加
入 G418 筛选（G418 浓度经 1.6 确定）。1 周后 G418
浓度减半，继续筛选至细胞单克隆出现，筛选期间
每 3 d 换一次细胞液。
1.2.5.2 Western 印迹鉴定稳定过表达 Necdin 的 P19
细 胞 克 隆 经 过 G418 筛 选 得 到 的 细 胞 克 隆 扩 大
培养，提取蛋白用 Western blot 方法鉴定稳定转染
PcDNA3.1/necdin 的 P19 细胞克隆。
1.2.5.3 CCK-8 法 检 测 过 表 达 外 源 Necdin 对 P19
细胞增殖的影响 选择两个稳定过表达 Necdin 的
P19 细胞克隆作为试验组，两个稳定转染 PcDNA3.1
空载的 P19 细胞克隆及正常 P19 细胞作为对照组，
Western blot 方法验证 5 个细胞克隆 Necdin 的表达量。
选取 0、1、2、3、4 d 5 个时间点测定不同细胞
克隆在 CCK-8 作用下的吸光度数值并绘制细胞增殖
曲线，根据增殖曲线间趋势反映出不同细胞克隆之
间细胞增殖的差异。
2013年第10期 167惠焕动等 ：P19 细胞过表达外源 Necdin 对其细胞增殖的影响
5 个细胞克隆同时培养，保持细胞状态良好 ；
细胞分别稀释至 5×103 个 /mL，接种至 96 孔板，每
孔 100 μL 细胞稀释液，每个克隆细胞接种 5 孔 ；细
胞贴壁后，选取 0 d 时间点一组细胞换全液，每孔
加 100 μL 细胞培养液、10 μL CCK-8 溶液，作为本
底的孔中不含细胞，加入等量的培养液和 CCK-8 溶
液；反应 3 h 后每孔转移 90 μL 上清至另一 96 孔板中，
用酶标仪分别测定对应上清液在 450 nm 波长处的吸
光度值 ；同理依次测定时间点 1、2、3、4 d 的吸光
度值 ；试验重复 3 次。对测定 0、1、2、3、4 d 5 个
时间点得到的每组数据进行统计处理并作图，分析
结果。
2 结果
2.1 necdin基因的克隆及鉴定
以 P19 细 胞 提 取 的 总 RNA 为 模 板 反 转 录 成
cDNA， 再 以 此 cDNA 为 模 板， 加 入 上 下 游 引 物，
PCR 扩增得到特异目的片段，1% 琼脂糖凝胶电泳
分析表明扩增片段长 978 bp（图 1）。
正 常 培 养 的 P19 细 胞 经 过 不 同 终 浓 度 200、
400、600、800、1 000 μg/mL 的 G418 筛选，连续观
察 1 周发现 ：G418 终浓度为 200、400、600 μg/mL
的细胞不同程度地部分死亡，培养至 3 d 后细胞基
本长满（图 4- A、B、C）；G418 终浓度为 800 μg/mL
的细胞开始死亡明显，继续培养细胞增殖不明显，
培养至 6 d 时细胞全部死亡（图 4-D）；G418 终浓度
为 1 000 μg/mL 的细胞开始死亡明显，培养 3 d 后全
部死亡（图 4 -E）。试验结果确定 G418 筛选 P19 细
胞的最佳浓度为 800 μg/mL。
2.4 PcDNA3.1/necdin转染P19细胞，G418筛选及
Western blot鉴定
LipofectamineTM2000 介导 PcDNA3.1/necdin 稳定
转染 P19 细胞，经 G418 筛选两周后细胞单克隆出
现（图 5），挑取单克隆扩大培养，待进一步鉴定。
针 对 G418 筛 选 过 的 细 胞 克 隆， 提 取 蛋 白 做
Western blot 检测 Necdin 的表达量，同时提取稳定转
染空质粒 PcDNA3.1 和正常 P19 细胞蛋白作为对照，
经过此法鉴定，得到 3 个稳定过表达 Necdin 的 P19
细胞克隆（图 6）。
15000
bp
M 1
10000
7500
5000
2500
1000 ⴞⲴᶑᑖ978 bp
M ：DL15000 DNA marker ；1 ：PCR 扩增的目的条带（978 bp）
图 1 necdin 基因编码区的 PCR 扩增产物
2.2 PcDNA3.1/necdin真核表达载体构建
为 了 转 染 P19 细 胞， 将 necdin 基 因 构 建 到
PcDNA3.1 真核表达载体中，转化大肠杆菌 DH5α，
挑选阳性克隆，提取质粒并用 EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶
切鉴定正确后（图 2），再经过上海生工测序保证其
序列正确。
2.3 P19细胞培养及确定G418筛选P19细胞的最佳
浓度
正常培养的 P19 细胞贴壁生长，细胞呈不规则
长椭圆形，胞体周围可见明显光晕，细胞生长状态
良好（图 3）。
15000
bp M 1
10000
7500
5000
2500
1000 necdin
PcDNA3.1
M ：DL15000 DNA marker ；1 ：PcDNA3.1/necdin 的 EcoRⅠ、
Xho Ⅰ双酶切鉴定
图 2 PcDNA3.1/necdin 载体双酶切鉴定
图 3 正常培养的 P19 细胞（×200）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期168
2.5 过表达外源Necdin对P19细胞增殖的影响
Western blot 验证试验组和对照组 5 个不同细胞
克隆 Necdin 的表达量有显著差别（图 7-A）。将测得
的 5 个细胞克隆在 0、1、2、3、4 d 时间点对应的
吸光度值都进行扣本底处理后统计分析并作增殖曲
线图（图 7-B）。依据图 7-B 可知，试验组稳定过表
达 Necdin 的 P19 细胞的增殖曲线趋势相比于对照组
比较一致，即 P19 细胞过表达外源 Necdin 后其细胞
增殖未发生明显变化，结果说明过表达外源 Necdin
对 P19 细胞增殖无明显影响。
3 讨论
Necdin 是 MAGE-II 类 家 族 成 员 中 Necdin 亚 类
成员之一，具有该家族保守的 MAGE 同源框（MAGE
homology domain，MHD）。通过该单一的 MHD 结构
域，Necdin 能够与多种蛋白相互作用发挥相应的生
理功能［10，11］。已有研究表明 Necdin 能够抑制细胞
增殖。例如，Necdin 异位表达于 NIH-3T3 细胞能够
强烈抑制细胞增殖［8］，异位表达于 N1E-115 细胞
能够参与细胞周期调控［9］，还能够抑制 Rb 缺失的
A200 μg/mL B400 μg/mL
D800 μg/mL
1 d 3 d
1 d 3 d 1 d6 d 3 d
1 d 3 d 1 d 3 d
E1 000 μg/mL
C600 μg/mL
图 4 G418 筛选 P19 细胞最佳浓度的确定（×200）
图 5 G418 筛选出单克隆（×200）
necdin
P1
9+
ne
cd
in1
P1
9+
ne
cd
in2
P1
9+
ne
cd
in3
Pc
DN
A3
.1
P1
9
β-tubulin
图 6 Western blot 鉴定过表达 Necdin 的细胞克隆
necdin
P1
9+
ne
cd
in
1
P1
9+
ne
cd
in
2
Pc
DN
A3
.1
1
Pc
DN
A3
.1
2
P1
9
β-tubulin
2.5
1.5
0.5A
bs
or
ba
nc
e45
0n
m
-6
30
nm

1.0
2.0
0.0
0 1 2 3 4
3.0 P19+necdin 1
P19+necdin 2
PcDNA3.1 1
PcDNA3.1 2
P19
ᰦ䰤d
A
B
图 7 P19 细胞过表达外源 Necdin 对其细胞增殖的影响
2013年第10期 169惠焕动等 ：P19 细胞过表达外源 Necdin 对其细胞增殖的影响
SAOS-2 骨肉瘤细胞集落形成［6］等。与以往研究不
同的是我们发现过表达外源 Necdin 对 P19 细胞增殖
没有明显影响，我们推测这可能和 P19 细胞的本身
特性相关。与 NIH-3T3、SAOS-2 等细胞相比，P19
胚胎瘤细胞具有多元分化潜能和较强的再生能力，
并且分裂生长较快对培养条件要求低，经过多次传
代仍能保持原来的分化能力和遗传特性等特点 ；并
且 P19 细胞自身低表达内源 Necdin。另外，以往研
究 Necdin 的生理功能大多是在神经元或神经系统
中［12］。我们证实 Necdin 在 P19 细胞中过表达后对
其细胞增殖没有明显影响，这为研究 Necdin 在 P19
细胞中的生理功能提供有效前提，对于 Necdin 在
P19 细胞中生理功能及具体机制尚需进一步探讨。
4 结论
通过构建 PcDNA3.1/necdin 真核表达载体并制
备稳定过表达 Necdin 的 P19 细胞克隆，检测到稳定
过表达 Necdin 对 P19 细胞增殖没有明显影响。这为
进一步研究 Necdin 在 P19 细胞中及体外模拟神经发
生过程中的生理功能打下一定基础。
参 考 文 献
［1］ Tcherpakov M, Bronfman FC, Conticello SG, et al. The p75
Neurotrophin receptor interacts with multiple MAGE proteins［J］.
J Biol Chem, 2002, 277（51）：49101-49104.
［2］ Wu M, Zhang Y, Wu NH, Shen YF. Histone marks and chromatin
remodelers on the regulation of neurogenin1 gene in RA induced
neuronal differentiation of P19 cells［J］. J Cell Biochem, 2009,
107（2）：264-271.
［3］ van der Heyden MAG, van Kempen MJA, Tsuji Y, et al. P19 embry-
onal carcinoma cells ：a suitable model system for cardiac electroph-
ysiological differentiation at the molecular and functional level［J］.
Car Res, 2003, 58 ：410-422.
［4］ Maruyama K, Usami M, Aizawa T, et al. A novel brain-specific
mRNA encoding nuclear protein expressed in neurally differentiated
embryonal carcinoma cells［J］. Biochem Res Commun, 1991, 178
（1）：291-296.　 　
［5］ Taniura H, Matsumoto K, Yoshikawa K. Physical and functional
interactions of neuronal growth suppressor necdin with p53［J］. J
Cell Biochem, 1999, 274（23）：16242-16248.
［6］ Taniura H, Taniguchi N, Hara M, et al. Necdin, a postmitotic neuron-
specific growth suppressor interacts with viral transforming proteins
and cellular transcription factor E2F1［J］. J Bio Chem, 1998, 273
（2）：720-728.
［7］ Salehi AH, Roux PP, Kubu CJ, et al. NRAGE, A novel MAGE
protein, interacts with the p75 neurotrophin receptor and facilitates
nerve growth factor-dependent apoptosis ［J］. J Neuron, 2000, 27
（2）：279-288.
［8］ Hayashi Y, Matsuyama K, Takagi K, et al. Arrest of cell growth by
necdin, a nuclear prothin expressed in postmitotic neurons［J］. J
Biochem Biophys Res Comun, 1995, 213（1）：317-324.
［9］ Kobayashi M, Taniura H, Yoshikawa K. Ectopic expression of necdin
induces differentiation of mouse neuroblastoma cells［J］. J Bio
Chem, 2002, 277（44）：42128-42135.
［10］ Yoshikawa K. Cell cycle regulators in neural stem cells and
postmitotic neurons［J］. J Neurosci Res, 2000, 37（1）：1-14.
［11］ Kuwajima T, Hasegawa K, Yoshikawa K. Necdin promotes
tangential migration of neocortical interneurons from basal
forebrain［J］. J Neurosci, 2010, 30（10）：3709 -3714.
［12］ Takazaki R, Nishimura I, Yoshikawa K. Necdin is required for
terminal differentiation and survival of primary dorsal root ganglion
neurons［J］. J Exp Cell Res, 2002, 277（2）：220-232.
（责任编辑 李楠）