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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
藻际环境（Phycospere）是指由藻类新陈代谢过
程中分泌的胞外产物形成的特殊的自藻类细胞向外
到一定距离的区域［1］，由于细菌对藻类胞外产物有
趋化性，不同藻类产生的胞外产物不同可能导致藻
际环境中所生长的细菌种类的不同［2，3］。因此，在
收稿日期 ：2014-05-21
基金项目 ：广西壮族自治区教育厅级课题 (2013LX180)，广西高等学校特色专业及课程一体化建设项目（药学 GXTSZY286）
作者简介 ：冯学珍，女，硕士，讲师，研究方向 ：海洋生物活性物质的研究与开发 ；E-mail ：fengxuezhenbest@163.com
通讯作者 ：伍善广，男，博士，副教授，研究方向 ：天然产物的分离纯化及药物新剂型 ；E-mail ：510242227@qq.com
应用 PCR-DGGE 技术研究石莼、网地藻藻际
微生物多样性
冯学珍  伍善广  陆苑
（广西科技大学，柳州 545006）
摘 要 ： 应用变性凝胶梯度电泳（PCR-DGGE）技术对石莼、网地藻藻际微生物多样性进行研究，并对其进行相似性、未加
权聚类分析（UPGMA）及微生物多样性（Shannon）指数分析。结果表明，PCR-DGGE 图谱显示，石莼、网地藻藻际微生物 DGGE
图谱有着明显的差异性，具体表现在条带数及密度值的不同。Quantity one 图谱分析表明 ：石莼藻际微生物 16S rRNA 基因的 V3
区共分离得到 25 条 DNA 片段，网地藻为 16 条 DNA 片段。 DGGE 相似性及未加权聚类分析表明 ：网地藻藻际微生物间的相似性
为 77.78%，石莼藻际微生物细菌群落间的相似性为 49.25%。Shannon 指数分析表明，石莼藻际微生物多样性指数显著高于网地藻
（P<0.05）。石莼藻际微生物细菌群落较网地藻丰富。
关键词 ： 变形凝胶梯度电泳（PCR-DGGE） 石莼 网地藻 藻际微生物 微生物多样性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.012
Preliminary Application of PCR-DGGE to Analyzing Microbial
Diversity of Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma
Feng Xuezhen Wu Shanguang Lu Yuan
（Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006）
Abstract: To study the microbial diversity of Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma. As a new DNA fingerprinting technique, denaturing
gradient gel electrophoresis（DGGE）can be used to analyze the microbial diversity in different environmental samples. Ulva lactuca L. and
Dictyota dichotoma will be studied with respect to microbial diversity by applying cultivation-independent molecular methods DGGE. The results
showed, the profile of DGGE showed that Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma had different bands. The structural diversity of the microbial
community was examined by the Shannon index of general diversity H. Quantity one analysis showed that, V3 region of 16S rRNA gene was
isolated from 25 DNA fragments of Ulva lactuca L. and 16 of Dictyota dichotoma. DGGE similarity and UPGMA analysis showed that ：the
similarity of Ulva lactuca L. was higher than the Dictyota dichotoma（P<0.05）.. Shannon indexes of two kinds of algae all showed Ulva lactuca
L. were significantly higher than the Dictyota dichotoma（P<0.05）. The algae microbial diversity of Ulva lactuca L. was richer than Dictyota
dichotoma.
Key words: PCR-DGGE Ulva lactuca L. Dictyota dichotoma Algae microorganisms Microbial diversity
藻际环境里形成了具有一定结构和功能的、并与藻
类存在相互作用的藻际微生物细菌群落［4］。因此，
海洋微藻在生长过程中向周围环境分泌多种胞外产
物，形成细菌自由生长的藻际环境［5］，藻际细菌对
石莼（Ulva lactuca L.）、网地藻等藻类的生长有一定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期74
的调控作用。
研究藻际微生物不仅对藻类的生长有重要意义，
对藻类药物的开发也具有非常大的应用前景。海藻是
生长于海洋的低等植物，不仅营养价值高且具有多
种生物活性，在食品、药品等领域都得以广泛应用，
成为众多学者研究的重点［6］。例如，海藻多糖类化合
物，因其独特的生物活性和较低的毒性，已成为当今
新药的研究方向之一［7］。本研究拟采用 PCR-DGGE
技术对广西海域的石莼、网地藻藻际微生物细菌群
落多样性进行分析，以期为石莼、网地藻的生长及
藻类多糖化合物的研究提供数据支持与理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
石莼于 2011 年 8 月采自广西北部湾海域（21°
40 30″ N，109° 11 35″ E），经大连海洋大学
邢坤副教授鉴定为绿藻门石莼属黑石礁石莼 ；网地
藻于 2012 年 05 月采自广西北部湾海域（20° 54
10″ N，109° 05 20″ E），经中国科学院南海海
洋研究所雷新明博士鉴定为鹿角网地藻（Dictyota
cervicornis）的新鲜藻体。采集样品一部分用于海藻
多糖的研究，一部分置于 -70℃用于分子指标的测定
（DNA 的提取、聚合酶链反应、变性凝胶梯度电泳）。
1.2 方法
1.2.1 藻际微生物 DNA 的提取 将已鉴定的石莼、
网地藻样品进行藻际微生物基因组 DNA 的提取，以
便后续分析。从 0.1 g 样品中进行藻际微生物 DNA
的提取，采用植物基因组 DNA 提取试剂盒（Plant
Genomic DNA Kit，TIANGEN）。为保证基因组 DNA
的质量，取少量 DNA 样品一部分用于浓度和纯度的
测定（Nanodrop，PeqLab，Germany），一部分进行 1%
含溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳（100 V，40 min），在
紫外凝胶成像系统下拍照检测。剩余 DNA 样品保存
于 -20℃备用。
1.2.2 基因组 DNA 的聚合酶链反应 将提取得到
的藻际微生物 DNA 作为聚合酶链反应（PCR）的模
板，使用 ABI 的 PCR system 9700 型基因扩增仪，采
用对大多数细菌的 16S rRNA 基因 V3 区具有特异性
的引物对 F984GC 和 R1378（Muyzer，1993）［8］，序
列 分 别 为 ：F984GC ：5-CGCCCGGGGCGCGCCCCG
GGCGGGGCGGGGGCAAACGCGAAGAACCTTAC-3）
R1378 ：5-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3，
扩增产物片段长约 400 bp。（下划线部分为“GC 夹”）
50 μL 的反应体系组成如下：100 ng 的 DNA 模板，
5 μL 的 10×buffer（含 MgCl2），200 μmol/L 的 dNTPs，
0.5 μ mol/L 的上下游引物，2.5 U 的 Taq 酶，加 ddH2O
补足至 50 μL。
PCR 反应采用普通 PCR，即预变性 94℃ 5 min，
中间采用 35 个循环为 94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃
90 s，最后在 72℃下延伸 5 min。PCR 扩增产物用 1%
琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 变性凝胶梯度电泳（PCR-DGGE） 采用 Bio-
rad 公司的 DCodeTM 的基因突变检测系统对 PCR 产
物进行电泳分离。变性较的制备采用 Bio-rad 公司
的 DCode 试剂盒。具体操作如下 ：使用梯度胶制备
装置，制备变性剂浓度从 30% 到 70%（100% 的变
性剂为 7 mol/L 尿素和 40% 去离子甲酰胺的混合物）
的 10% 聚丙烯酰胺凝胶，其中变性剂的浓度从胶的
上方向下方依次递增。在 1×TAE 中，60 V 预电泳
1 h，100 V 电泳 15 h 后，取出，银染后在凝胶紫外
自动成像系统中拍照（SYNGENE Inc，USA）。银染
的具体步骤如下 ：电泳完毕后，用 10% 乙醇、0.5%
冰醋酸浸泡 10-15 min 进行固定 ；加银染液，摇床
震荡染色 15 min ；用去离子水漂洗两次后，加 3%
NaOH、0.5% 甲醛显色 10 min，待条带显现后立即
拍照。
1.2.4 数据分析 利用 Quantity one 软件（条带识
别容忍度 1%）对 PCR-DGGE 图谱进行处理，基于
条带的有无以获得各泳道（样品）的相似性，进行
数学未成对加权聚类分析（UPGMA），以及 Shannon
指数的计算。其中，Shannon 指数计算公式为 ：H =
-（ni/N）log（ni/N），ni 为峰面积，N 为所有峰的总
面积［9，10］。
利用 ANOVA 分析比较样品的微生物多样性。
所有数据均在 Excel 2007 软件中整理，利用 SPSS 2.0
软件完成。
2 结果
2.1 总DNA的提取量
总 DNA 提 取 量 24.66-91.67 μg/g 干 样， 见 表
2014年第12期 75冯学珍等：应用 PCR-DGGE 技术研究石莼、网地藻藻际微生物多样性
1，其中石莼显著高于网地藻。测定所提总 DNA 的
A260 nm/A280 nm 比值为 1.8-1.9，A260 nm/A230 nm
比值为 1.8-2.0，总 DNA 片段大小约为 20 kb（图 1），
说明所提取的总 DNA 产量和纯度均较高，可用于进
一步的分子生物学分析。
表 1 藻际微生物总 DNA 提取量
样品名称 采样号 μg/g A260/280 A260/230
石莼 S1 81.43a 1.89 1.94
S2 86.54a 1.85 1.98
S3 91.67a 1.83 1.98
网地藻
W1 29.90b 1.81 1.82
W2 24.66b 1.89 1.84
W3 26.68b 1.82 1.85
不同字母代表处理之间具有显著性差异（P<0.05），下同
示。从表 2，图 3 可以看出利用 PCR-DGGE 技术对
石莼藻际微生物 16S rRNA 基因的 V3 区片段进行分
离，共得到 25 条 DNA 片段，网地藻藻际微生物共
分离得到 16 条 DNA 片段，分离得到的 DNA 片段数
石莼显著高于网地藻（P<0.05）。
23130
bp
M W
DZ
-1
W
DZ
-2
W
DZ
-3
SC
-1
SC
-2
SC
-3
9416
6557
4361
2322
2027
M ：λDNA-Hind Ⅲ分子标记
图 1 总 DNA 电泳图
2.2 石莼、网地藻藻际微生物的PCR-DGGE图谱
从图 2 可以看出，DGGE 泳道中的条带存在差
异，石莼藻际微生物 DGGE 电泳条带数目远高于网
地藻藻际微生物，且条带的灰度也较深，其中石莼
与网地藻藻际微生物的差异条带较多，说明石莼、
网地藻藻际微生物在群落结构组成有明显差异。根
据 DGGE 对不同 DNA 片段分离原理可知，石莼、网
地藻的 PCR 产物中含有多种数目不等的不同 DNA
片段，属于藻际微生物 16S rRNA 基因 V3 的片段，
如果对这些片段加以切胶、纯化、克隆测序，即可
知 DGGE 中被分离出的 DNA 片段所代表的具体种属
关系，从而确定石莼、网地藻藻际微生物所含有的
细菌种类。
2.3 石莼、网地藻藻际微生物DGGE条带差异分析
利用 Quantity one 软件对 DGGE 图谱进行分析，
输出条带差异图如图 3 所示，条带数列表如表 2 所
S1 S2 S3 W1 W2 W3
S1，S2，S3 ：石莼 ；W1，W2，W3 ：网地藻
图 2 石莼、网地藻藻际微生物 DGGE 分离图谱
S1 S2 S3 W1 W2 W3
表 2 石莼、网地藻藻际微生物 DGGE 条带数
样品名称 采样号 泳道 条带数
石莼
S1 1 25a
S2 2 25a
S3 3 25a
网地藻
W1 4 16b
W2 5 16b
W3 6 16b
2.4 石莼、网地藻藻际微生物的相似性及未加权
聚类分析（UPGMA）
从图 4 的石莼、网地藻藻际微生物相似性及
图 3 石莼、网地藻藻际微生物 DGGE 条带差异图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期76
UPGMA 图分析结果可以看出 ：网地藻藻际微生物间
的相似性为 77.78%，石莼藻际微生物细菌群落间的
相似性为 49.25%。说明网地藻藻际微生物细菌群落
多样性低于石莼藻际微生物细菌群落多样性。
W2
W3
W1
1009590858075706560555045
S1
S2
S3
图 4 石莼、网地藻藻际微生物的相似性及 UPGMA 图
2.5 石莼、网地藻藻际微生物多样性（Shannon）
指数分析
根据 DGGE 图谱中条带的数量和灰度计算石莼、
网地藻的藻际微生物多样性 Shannon 指数结果见表
3。其中石莼藻际微生物的 Shannon 指数为 0.973-
0.989，网地藻藻际微生物的 Shannon 指数为 0.416-
0.452。利用 ANOVA 分析比较石莼、网地藻藻际微生
物多样性发现，石莼藻际微生物多样性比网地藻较
为丰富，多样性指数显著高于网地藻（P<0.05）。
表 3 石莼、网地藻样品 DGGE 条带的 Shannon 指数
样品名称 采样号 Shannon 指数
石莼
S1 0.975a
S2 0.989a
S3 0.973a
网地藻
W1 0.452b
W2 0.433b
W3 0.416b
3 讨论
本文石莼、网地藻均采集于广西北部海湾，应
用 PCR-DGGE 技术对石莼、网地藻藻际微生物多
样性进行了研究，其分离出数目不等、位置各异的
16S rRNA 基因的 V3 区片段，每一个条带代表群落
中的一个可操作分类单元［11］，条带数越多说明多样
性越丰富，结果说明同一海域不同经纬度下的藻际
微生物存在差异，具体表现为石莼藻际微生物细菌
群落多样性较网地藻丰富，分析原因可能是由于不
同经纬度下海域的温度、盐度等环境因素有关，而
石莼、网地藻等藻类本身的性质也会对藻际微生物
的细菌群落结构产生差异。
前期对石莼、网地藻的多糖提取率进行了测定，
其中石莼多糖提取率显著高于网地藻，且单糖组成
存在差异［12，13］。结合 PCR-DGGE 分析结果可以看
出，藻际微生物细菌群落多样性与藻类多糖息息相
关，分析原因可能是由于藻类胞外物多糖的分泌能
够为藻际微生物的生长提供碳源，从而使得石莼细
菌群落多样性高于网地藻 ；同时藻际微生物的丰富
又为藻类的生长与培育具有一定的调控作用。有研
究显示 ：细菌利用藻类产生的有机物质，而其经过
细菌代谢后有可以形成较为简单的无机物或者有机
物，这些物质又可以为藻类的生长提供营养物质和
生长因子，从而调节藻类的生长［14］，因此藻际微生
物细菌群落多样性与藻类多糖间相互作用相互影响，
研究藻际微生物的丰富度对藻类多糖的提取提供一
定的科学依据和数据支撑。
4 结论
本研究依据 PCR-DGGE 技术初步研究表明比较
了石莼、网地藻间藻际微生物细菌群落结构的差异：
石莼细菌群落多样性显著高于网地藻，但最终要确
定具体某一种属微生物对藻类及胞外产物起重要作
用，还需进一步的研究。
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（责任编辑 狄艳红）