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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
盐碱地多数情况下较为平坦便于灌溉，同时又
是世界性的低产土壤，因此长期以来都受到人们广
泛的关注［1］。东北地区素以肥沃的黑土地著称，是
收稿日期 ： 2014-02-23
基金项目 ：国家高技术研究发展计划资助项目（2011aa10a203），转基因生物新品种培育（国家科技重大专项）（2014ZX0800913B-002），国
家基础科学人才培养基金资助项目（J1210069），东北农业大学博士启动基金项目（2010RCB54）
作者简介 ：杜传英，女，硕士，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：duchuanying@126.com
通讯作者 ：高继国，教授，博士生导师，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：gaojiguo1961@hotmail.com
东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计及初步鉴定
杜传英  李海涛  刘荣梅  谢滨姣  张金波  高继国
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 采用温度筛选与表面定向培养相结合的方法对东北地区土壤中可培养耐盐芽胞杆菌进行分离和筛选，得到 137 株
芽胞杆菌，其中耐盐芽胞杆菌 74 株，占总芽胞杆菌数量的 54%，最适盐浓度均为 1%，耐盐能力在 4%-14% 之间。通过扩增耐
盐菌株的 16S rRNA 基因序列，对其进行分子鉴定和分类，获得东北地区土壤中可培养的耐盐芽胞杆菌的多样性信息。通过同源
性比对和耐盐性差异，确定 36 株差异耐盐芽胞杆菌，分属于芽胞杆菌属中的 7 个种。其中多数菌株为苏云金芽胞杆菌（Bacillus
thuringiensis）（14 株，占总数 38.9%，最高耐盐性在 4%-9%NaCl 之间）。其次依次为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）（7 株，19.4%，
4%-8%NaCl），枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）（7 株，19.4%，8%-11%NaCl），炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）（4 株，11.1%，
5%-7%NaCl），弯曲芽胞杆菌（Bacillus flexus）（2 株，5.6%，9%-14%NaCl），球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus）（1 株，2.8%，5%NaCl）
和阿氏芽胞杆菌（Bacillus aryabhattai）（1 株，2.8%，6%NaCl）。弯曲芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的耐盐能力较好。从中选取 3 株代
表菌株，明确了其培养特性、形态特征及生理生化特性，并对其分别进行了系统发育分析。
关键词 ： 耐盐 芽胞杆菌 分离 初步鉴定 16S rRNA
Isolation and Primary Identification of Salt-tolerant Bacillus in
Northeast of China
Du Chuanying Li Haitao Liu Rongmei Xie Binjiao Zhang Jinbo Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，HarBin 150030）
Abstract: To analyze the biodiversity of salt-tolerant Bacillus in the northeast of China, the temperature screening and gradient plate
methods were used. 137 Bacillus strains were obtained, in which has 74 salt-tolerant Bacillus strains, 54% of total Bacillus strains. The optimum
salt concentrations of these salt-tolerant Bacillus strains were all 1% and the range were 4%-14%. 16S rRNA sequences were amplified
and analyzed for the determination of phylogenetic relationships. The 36 salt-tolerant Bacillus strains were different from each other in their
16S rRNA sequences or the salt tolerance, classified into 7 species of Bacillus genera. Among them, Bacillus thuringiensis was majority（14
strains, 38.9% of all, highest salt tolerance were 4%-9%NaCl）, second were Bacillus cereus（7, 19.4%, 4%-8%）and Bacillus subtilis（7,
19.4%, 8%-11%）, then Bacillus anthracis（4, 11.1%, 5%-7%）, Bacillus flexus（2, 5.6%, 9%-14%）, Bacillus sphaericus（1, 2.8%,
5%）and Bacillus aryabhattai（1, 2.8%, 6%）. Bacillus flexus and Bacillus subtilis were shown better salt tolerance. Cultural and morphology
characteristics, biochemical indexes and phylogenetic analysis of 3 typical strains were given. Provide an effective data support for the discovery
of salt-tolerant Bacillus.
Key words: Salt-tolerant Bacillus Isolation Primary identification 16S rRNA
我国重要的农、林业和畜牧业生产基地。但随着气
候的变化和土壤的不合理利用，东北地区盐碱土面
积达到了 384 万 hm2，占该地区总面积的 3.1%，其
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期180
中耕种盐碱地面积占该地区总耕地面积的 6.8%，已
成为我国盐碱土四大分布区之一［2］，严重制约着该
地区的农林畜牧业和经济发展。
目前我国对于盐碱地的改良措施主要以物理、
水利、生物和化学四大体系为核心［3］。 其中生物改
良主要应用高效耐盐微生物与植物的协同作用［4］，
在恢复盐碱地的同时还可以保护生态平衡，在改善
盐渍土质方面发挥着重要的作用。由于多数植物和
微生物肥料不具有抵抗高盐的能力，而细菌与植物
在耐盐方面又有较大的相似性，也有些植物可以与
耐盐菌共生［5］。因此，构建高效耐盐细菌资源库以
及发掘耐盐功能基因应运而生。
芽胞杆菌为革兰氏阳性菌，菌体杆状，直或近直，
（0.3-2.2）μm×（1.2-7.0）μm，多数运动，鞭毛典
型侧生，形成抗热内生孢子［6］。2004 年，El-Komy
等［7］发现多粘芽胞杆菌（Bacillus polymexa）E.M1231
菌株能增加盐胁迫下玉米鲜重和干物质产量。2006
年，尹汉文［8］发现在一定浓度氯化钠胁迫下，枯草
芽胞杆菌可以在一定程度内提高黄瓜植株的耐盐性。
对于模式菌株枯草芽胞杆菌耐盐性的研究也一直备
受关注［9-11］。芽胞杆菌由于产生内生孢子，可以有
效的抵抗外界环境的压力，维持自身生长不受影响，
是抗逆性最强的生命体。近年来在工、农、医等各
个科学领域都有广泛的应用，研究总体呈加速上升
的趋势［12］，因此统计发掘耐盐芽胞杆菌，旨在为构
建高效耐盐转基因植物提供重要数据支持以及基因
资源储备。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器与试剂 恒温培养箱购自上海一恒
科技有限公司 ；PCR 仪购自百瑞德进出口贸易有限
公司 ；凝胶成像分析仪购自赛智创业科技有限公司 ；
PCR 相关试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。
T4 DNA ligase、DNA Fragment Purification Kit 和 DNA
Marker 均购自 TaKaRa 公司。生理生化鉴定试剂盒
购于海博生物有限公司。
1.1.2 培养基 LB 液体培养基 ：trytone 1%，yeast
extract 0.5%，NaCl 1%，pH 调为 7.0。LB 固体培养
基 ：LB 液体培养基中加入 1.3% 琼脂，121℃灭菌
20 mim 后进行试验。定向耐盐筛选培养基 ：LB 培养
基中加入梯度浓度的 NaCl。
1.2 方法
1.2.1 耐盐芽胞杆菌的筛选与统计
1.2.1.1 土样采集与芽胞杆菌的分离 广泛采集东
北各地区土壤样品，先将表土层铲去，取距表层
5-10 cm 的土壤作为样本，装入无菌封口袋中，标
明采集日期、地点、周围植被等，每个采样地点至
少取 10 处（表 1）。
表 1 供试土壤样品
土壤采集地点 样品编号 样品数量 采集时间
黑龙江省安达市 A- 50 2009 年 10 月
黑龙江省牡丹江西村 M-、MS- 50 2009 年 10 月
吉林省吉林市龙潭山 L- 50 2010 年 10 月
吉林省吉林市松花湖 SH- 50 2010 年 10 月
黑龙江省五常市拉林 LS-、LB- 50 2010 年 10 月
辽宁省鞍山市千山 QZL- 50 2011 年 10 月
辽宁省鞍山市祖越寺 Q- 50 2011 年 10 月
黑龙江省带岭 DL- 100 2012 年 7 月
黑龙江省哈尔滨市松峰山 S-、SY- 50 2012 年 10 月
1.2.1.2 土壤样品中芽胞杆菌的分离及纯化 取 1-2
g 土样放入装有 15 mL 灭菌水和适量玻璃珠的 50 mL
灭菌的大离心管中，在旋涡振荡器上振荡约 1 min，
将土壤颗粒打碎，然后 80℃水浴 20 min，充分将非
芽胞菌杀死。待稍静置后，稀释 500 倍后吸取 100
μL 菌悬液于 1/2 LB 板上，涂布均匀，30℃培养 3 d。
挑取菌落涂片，用石炭酸复红染色，100 倍油镜下
观察。检出菌株划线于 LB 培养基上培养，4℃保存。
1.2.1.3 菌株生长温度测试 将分离得到的纯培养
芽胞杆菌接种于 LB 液体培养基中，分别置于 16℃、
22℃、30℃、37℃条件下，220 r/min 震荡培养 48 h，
取样稀释 10 倍，测量 600 nm 下 OD 值，绘制曲线。
1.2.1.4 菌株耐盐性测试 将分离得到的纯培养芽
胞杆菌分别接种于含有 0%-15%NaCl 的 LB 培养基
平板上，30℃恒温培养 48 h，观察生长情况，统计
不同菌株的最高耐盐度。
1.2.1.5 基因组 DNA 提取 菌株在固体 LB 培养基
上划线培养 24 h 后收集到 1.5 mL EP 管中，约 100
mg，加入 200 μL TE，200 μL 2% SDS，充分混匀，
然后加入 200 μL Tris 饱和酚，200 μL 氯仿，混匀后，
2014年第10期 181杜传英等：东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计及初步鉴定
12 000 r/min 离心 10 min。取上清，加入 1.5 倍体积
的异丙醇，50 μL 的 5 mol/L NaCl，轻轻振荡混匀，
12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀用无水乙醇
洗涤 3 次，室温晾干。用适量的 ddH2O 溶解沉淀，
短期 -20℃保存，长期 -70℃保存备用。
1.2.1.6 基 于 16S rRNA 基 因 序 列 的 系 统 发 育 分
析 对菌株基因组的 16S rRNA 序列进行 PCR 扩增，
采用的通用引物［13］为 16S rRNA-F ：5-AGAGTTTG-
ATCCTGGCTCAG-3 ；16S rRNA-R1 ：5-ACGGCTAC-
CTTGTTACGACT-3 ；16S rRNA-R2 ：5- AAGGAG-
GTGATCCAGCCGCA-3。反应条件为 ：94℃ 8 min ；
94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，共 30 个循环 ；
72℃ 10 min。扩增产物经 DNA 纯化试剂盒纯化后
连接 pMD19-T 载体，转化大肠杆菌 JM109，蓝白斑
筛选阳性克隆，PCR 验证后，提质粒送交测序。引
物合成和序列测定均由金唯智生物科技有限公司完
成。所得序列应用 NCBI Blast 在线比对，找出各序
列在 NCBI 数据库中最亲缘种的模式菌株序列，采
用 Clustal X 和 MEGA5.0 软件进行多序列比对，然后
用 Neighbor-Joining 方法选择 Bootstrap 为 1 000 个重
复构建系统发育学进化树。新菌株 16S rRNA 序列提
交 GeneBank 数据库，获取序列号。
1.2.2 优势菌株的初步鉴定
1.2.2.1 最高盐浓度下菌株的生长情况 将优势菌
株接种于 LB 液体培养基中，30℃，200 r/min 培养
12 h，离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体后制成菌
悬液，取 1 mL 菌悬液以 1∶100 的比例接种于该菌
株最高耐盐浓度的液体培养基中，30℃，200 r/min
摇床培养，每隔 1 h 测其菌液 600 nm 下的 OD 值，
并绘制生长曲线。
1.2.2.2 菌株形态特征观察 菌株接种于 LB 固体培
养基中，30℃培养 2 d，挑取菌体，石炭酸复红染
色，在 10×100 倍的光学显微镜下观察芽胞形成后，
刮取培养菌用无菌水洗 2-3 遍，12 000 r/min 离心 1
min 收集菌体，将沉淀悬浮于 1 mL 无菌水中，取适
量胞晶混合液滴于玻璃片上，待干燥后，经锇酸固定，
而后经酒精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金
（2 nm），进一步的扫描电镜观察。电镜（HITACHI
S-3400N）分析在东北农业大学大型仪器开放平台电
镜室完成。
1.2.2.3 生理生化特性鉴定 参照生理生化鉴定试
剂盒操作说明书。
2 结果
2.1 耐盐芽胞杆菌筛选与统计
采用温度筛选法从东北地区采集的 500 份土样
中筛选得到 137 株芽胞杆菌，本研究中东北地区芽
胞杆菌出土率约为 27.4%。进一步采用表面定向培
养的方法，调整基本 LB 培养基中 NaCl 浓度，分别
配成 0%-20%NaCl 的培养基，进行耐盐芽胞杆菌筛
选，得到可以在含有 4%-14%NaCl 的培养基中生长
的耐盐芽胞杆菌 74 株，占总芽胞杆菌数量的 54%，
说明半数以上的芽胞杆菌对于外界高盐环境具有一
定的耐受能力。所有芽胞杆菌在 NaCl 含量为 1% 时，
菌落形态饱满，生长旺盛，在高盐环境下菌落形态
明显变小、生长缓慢或不能生长，在不含 NaCl 环境
下生长速度明显下降，菌落形态小，光学显微镜下
观察营养体少，有大量芽胞产生，故本试验中分离
出的所有芽胞杆菌最适生长的 NaCl 浓度均为 1%，
为耐盐菌没有嗜盐菌。图 1 为 137 株芽胞杆菌在基
本 LB 培养基和高盐培养基中可生长的菌株数量，
本试验中大部分芽胞杆菌的耐盐性在 8% 以下，得
到两株耐盐性 10% 以上的芽胞杆菌。
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1
㧼ᮠṚ
4 5 6 7 8 9 10 11 14
NaClਜ਼䟿%
图 1 东北地区耐盐芽胞杆菌的统计
2.2 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析
提取 74 株耐盐芽胞杆菌的基因组，用通用引物
扩增 16S rRNA 基因序列，测序结果应用 DNAMAN
软件进行序列分析比对，结合菌株的耐盐性差异，
得到 36 株差异耐盐芽胞杆菌用于后续分析菌株多样
性。将得到的 16S rRNA 基因序列与在线 NCBI 数据
库中的序列比对，选择相似度最高的模式菌株应用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期182
上述方法构建 Neighbor Joining Tree（图 2）。由于苏
云金芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌的 16S rRNA 序列的
同源性非常高，鉴于苏云金芽胞杆菌在芽胞期分泌
伴孢晶体，结合光学显微镜下观察的结果，区分苏
云金芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌。结果显示，该 36 株
耐盐芽胞杆菌分属于芽胞杆菌属中的 7 个种 ：苏云
金芽胞杆菌 14 株（占总数 38.9%）、蜡样芽胞杆菌 7
株（19.4%）、枯草芽胞杆菌 7 株（19.4%）、炭疽芽
胞杆菌 4 株（11.1%）、弯曲芽胞杆菌 2 株（5.6%）、
球 形 芽 胞 杆 菌 1 株（2.8%）， 阿 氏 芽 胞 杆 菌 1 株
（2.8%）。该 36 株代表菌株与最近缘种的模式菌株的
16S rRNA 基因序列相似性在 99.7%-100% 之间，其
中有 22 株菌株相似性在 99.7%-99.9% 之间，17 株
菌株的 16S rRNA 基因序列已提交 GenBank 获得登
录号分别为 ：KJ022700、KJ496370- KJ496385。
2.3 各种芽胞杆菌耐盐性统计
耐盐性最好的菌株为 LBR-4（Bacillus flexus）最
高耐盐度为 14% NaCl 和 S5-1（Bacillus subtilis）最
高耐盐度为 11%。但在高盐胁迫下这两株菌株的菌
落形态都较正常培养基中小，再转接到正常培养基
中会恢复到正常生长状态，说明高盐胁迫对菌株的
正常生长有一定的影响。总体菌株耐盐性统计结果
显示，耐盐性较好的菌株为弯曲芽胞杆菌（最高耐
盐度 9%-14%NaCl）和枯草芽胞杆菌（8%-11%）。
其它种芽胞杆菌耐盐性差别不大，多数菌株的耐盐
性在 7% 以下（苏云金芽胞杆菌，4%-9% ；蜡样芽
胞杆菌，4%-8% ；枯草芽胞杆菌，8%-11% ；炭疽
芽胞杆菌，5%-7% ；球形芽胞杆菌，5% ；阿氏芽胞
杆菌，6%）。图 3 显示了各芽胞杆菌在不同盐含量
的培养基中可生长菌的数量。
2.4 代表菌株形态特征
选取 3 株代表菌株分别为耐盐性超过 10% 的弯
曲芽胞杆菌 LBR-4、枯草芽胞杆菌 S5-1 以及最高耐
盐 9% 的苏云金芽胞杆菌 DL1-5 进行初步鉴定分析。
代表菌株的菌体形态如图 4，总体上菌体均为杆状，
石炭酸复红染色后显微镜下观察呈红色，芽胞为椭
球形，染色后呈空心粉色。苏云金芽胞杆菌 DL5-1
菌株可以在芽胞期分泌出球形伴孢晶体，染色后呈
均一的红色。弯曲芽胞杆菌 LBR-4 的营养体相对较
长，而枯草芽胞杆菌 S5-1 的芽胞相对较圆。
2.5 代表菌株的培养特性及生理生化指标
将 3 株菌株分别扩增繁殖后，按一定比例分别
接种于 LB 培养基和相应最高耐盐度的培养基中进
行摇床培养，每隔 1 h 取样测量 600 nm 处 OD 值，
绘制如图 5 的菌株生长曲线。菌株在 LB 培养基中 2.5
h 左右开始进入对数生长期，而在相应最高盐胁迫
下有将近 10-12 h 的调整期。说明芽胞杆菌有很强
的适应能力，菌株最开始并不能适应高盐环境，但
是经过一段时间的调整后仍能生长。菌株在 LB 培
养基中从对数期到稳定期经过近 14 h，与高盐胁迫
下经历的时间基本相同，但在高盐胁迫下进入稳定
期后的 OD 值有 2-2.5 倍的差异。
代表菌株 LBR-4、S5-1 及 DL1-5 最适生长盐浓
度均为 1%，最高耐盐度分别为 14%、11% 和 9%，
最适生长温度为 30℃（图6）。V-P 反应均为阳性。
菌株 LBR-4 可以利用葡萄糖、半乳糖和蔗糖作为唯
一碳源生长，不能利用纤维二糖、甘露糖、七叶苷、
水杨苷。可以利用 L-精氨酸，不能利用尿素酶。菌
株 S5-1 可以利用葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、七叶苷
和水杨苷作为唯一碳源生长，不能利用半乳糖和甘
露糖。不能利用 L-精氨酸，可以利用尿素酶。菌株
DL1-5 可以利用葡萄糖、蔗糖、纤维二糖和七叶苷
作为唯一碳源生长，不能利用半乳糖、甘露糖、水
杨苷。不能利用 L-精氨酸和尿素酶（表 2）。
2.6 代表菌株的系统发育分析
将同为弯曲芽胞杆菌的 LBR-4 和 MS14-1 菌株
16S rRNA 基因序列与已鉴定的模式菌株 16S rRNA
基因序列比较后，结果（图 7）显示这两株菌株均
与模式菌株 Bacillus flexus IFO 15715 聚在一起，形
成一个单独的分支。通过序列两两比较，LBR-4 菌
株与模式菌株 Bacillus flexus IFO 15715 的相似性为
99.87%，分别在第 167 和 173 个碱基处有 2 个碱基
的差异。MS14-1 菌株与模式菌株 Bacillus flexus IFO
15715 的相似性为 99.93%，在第 173 个碱基处有 1
个碱基差异，LBR-4 菌株与 MS14-1 菌株相似性为
99.93%。
将同为枯草芽胞杆菌的 7 株菌株 16S rRNA 基因
序列与已鉴定的模式菌株比较后，结果（图 8）显
2014年第10期 183杜传英等：东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计及初步鉴定
Bacillus thuringiensis serovar pakistanistr. T13001
Bacillus cereus ATCC 14579
DL8-3
LCK10
DL5
S131
QZL7
QZL6
DL9-2
A41-6
S120
L27-4
SY192
S202
S4-6
S228-7
Bacillus anthracis ATCC 14578
S3-3
DL2-3
DL3-4
MX2
DL2-6
DL1-5
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki CP004069
S144
S181-5
S169-5
S178-42
DL10
Bacillus thuringiensis serovar chinensis CT-43 CP001907
Bacillus thuringiensis ATCC 10792 T
Bacillus thuringiensis serovarthurin giensisstr. T01001 EU429668
DL5-1
S18-4
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429
S5-1
DL47
S15-2
WFH81
Q66
DL4-10
Bacillus aryabhattai B8W22
Bacillus megaterium IAM 13418 T
Bacillus flexus NCIMB 9366 T
MS14-1
LBR-4
Bacillus sphaericus JG-B58
S17100
98
99
64
98
100
100
59
64
80
100
56
0.005
Bacillus
thuringiensis (4/36)
& Bacillus cereus
(underline)(6/36)
Bacillus anthracis(4/36)
Bacillus
thuringiensis(10/36)
& Bacillus cereus
(underline)(1/36)
Bacillus subtilis(7/36)
Bacillus aryabhattai(1/36)
Bacillus flexus(2/36)
Bacillus sphaericus(1/36)
Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610
图 2 基于 16S rRNA 基因序列构建的东北地区耐盐芽胞杆菌系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期184
示这 7 株菌株均与模式菌株 Bacillus subtilis 的 3 个不
同亚种聚在一起，形成一个单独分支。其中 S5-1 菌
株和 S18-4 与模式菌株 Bacillus subtilis subsp. subtilis
NCIB 3610 的亲缘关系最近，其他 5 株菌与模式菌
株 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 的
亲缘关系较近。通过序列两两比较，S5-1 菌株与
模式菌株 Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 的
相 似 性 为 99.80%， 分 别 在 第 222、456 和 1019 个
碱 基 处 有 3 个 碱 基 差 异。S18-4 菌 株 与 模 式 菌 株
Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 的相似性也
为 99.80%，分别在第 276、476 和 1061 个碱基处有
3 个碱基差异。S5-1 菌株与 S18-4 菌株的相似性为
99.60%，有 6 个碱基的差异。
通 过 16S rRNA 基 因 序 列 的 两 两 比 对， 将 与
0
2
4
6
8
10
12
14
16
11%14%
8%10%
4%7%㧼ᮠṚ 㣿Ӂ䠁㣭㜎ᵶ㧼㵑ṧ㣭㜎ᵶ㧼ᷟ 㥹㣭㜎ᵶ㧼⛝⯭㣭㜎ᵶ㧼ᕟᴢ㣭㜎ᵶ㧼⨳ᖒ㣭㜎ᵶ㧼䱯∿㣭㜎ᵶ㧼
图 3 各种芽胞杆菌耐盐性统计
C
S
S
S
A
B
C
A ：LBR-4 ；B ：S5-1 ；C ：DL1-5 ；s ：spores ；c ：crystals
图 4 3 株代表菌株的革兰氏染色和扫描电镜图片
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
t/h
O
D
60
0
nm
14%
LB
A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
t/h
O
D
60
0
nm
11%
LB
B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
t/h
O
D
60
0
nm
9%
LB
C
A ：LBR-4 ；B ：S5-1 ；C ：DL1-5
图 5 三株代表菌株在正常 LB 培养基和最高耐盐度
培养基中的生长曲线
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
16 22 30 37
T/ćOD 6
00
n
m
LBR-4
S5-1
DL1-5
图 6 三株代表菌株不同温度下的生长曲线
2014年第10期 185杜传英等：东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计及初步鉴定
DL1-5 菌株同源性较高的 4 株 Bt 菌株与 Bt 各亚种模
式菌株的 16S rRNA 基因序列比较后，结果（图 9）
显示，这 5 株 Bt 菌株与 kurstaki、chinensis、berliner
和 huazhongensis 亚种的 Bt 模式菌株聚在一起，形
成一个单独的分支。序列两两比对结果显示 DL1-5
菌株与模式菌株 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki
CP004069 的相似性为 99.81%，分别在第 554、630
和 720 处 有 3 个 碱 基 的 差 异。 菌 株 S3-3 和 菌 株
DL2-6 与该模式菌株相似性为 100%，与 DL1-5 相似
性为 99.81%。菌株 MX2 和菌株 DL3-4 与该模式菌
株相似性为 99.94%，在第 53 个碱基处有 1 个碱基
的差异，与 DL1-5 菌株的相似性为 99.74%。
表 2 三株代表菌株生化指标
指标 LBR-4 S5-1 DL1-5
耐受盐浓度范围（%，W/V） 0-14 0-11 0-9
最适生长盐浓度（%，W/V） 1 1 1
最适生长温度（℃） 30 30 30
V-P 反应 + + +
葡萄糖 + + +
半乳糖 + - -
蔗糖 + + +
纤维二糖 - + +
甘露糖 - - -
七叶苷 - + +
水杨苷 - + -
L-精氨酸双水解酶 + - -
尿素酶 - + -
99
78
98
100
99
99
97
99
55
59
Bacillus bataviensis LMG 21833
Bacillus drentensis LMG 21831
Bacillus pocheonensis Gsoil420 T
Bacillus circulans ATCC 4513 T
Bacillus nealsonii DSM 15077 T
Bacillus kyonggiensis NB22 T
Bacillus gottheilii WCC 4585 T
Bacillus firmus NCIMB 9366 T
Bacillus oceanisediminis H2 T
Bacillus kochii WCC 4582 T
Bacillus purgationiresistens DS22 T
Bacillus shackletonii LMG 18435 T
Bacillus asahii MA001 T
Bacillus koreensis BR030 T
Bacillus aryabhattai B8W22 T
Bacillus megaterium IAM 13418 T
Bacillus flexus IFO 15715 T
MS14-1
LBR-4
Bacillus herbersteinensis D-1-5a T
Bacillus cohnii DSM 6307 T
Bacillus cereus ATCC 14579 T
Bacillus thuringiensis ATCC 10792 T
Bacillus toyonensis BCT-7112 T75
100
0.005
图 7 邻接法构建菌株 LBR-4 基于 16S rRNA 基因序列的系统发育树
3 讨论
本研究在东北各地区采集分离的 137 株芽胞杆
菌筛选出 74 株耐盐性高于 4% 的芽胞杆菌，说明大
部分芽胞杆菌具有较好的适应高盐环境的能力。另
外在国内，大量从不同地区分离得到的耐盐、嗜盐
菌的报道中都有芽胞杆菌属的细菌分布。例如，新
疆达坂盐湖［14］、云南省一平浪盐矿古老岩盐［15］和
昆明盐矿古老岩盐［16］地区均以芽胞杆菌属为最优
势属。因此研究统计芽胞杆菌耐盐性，可以为今后
发掘高效耐盐的细菌提供有力的数据依据。
本研究基于 16S rRNA 基因序列构建了分离得到
的 36 株不同耐盐芽胞杆菌和 3 株代表菌株的系统发
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期186
育树。但是在分析过程中，苏云金芽胞杆菌和蜡样
芽胞杆菌的 16S rRNA 基因序列具有高度的保守性，
并不能单凭 16S rRNA 基因序列来区分这两个种的菌
株，本研究应用了苏云金芽胞杆菌可以在芽胞期分
泌伴孢晶体来区分，下一步工作可以采用 de la Haba
等［17］提出的多为点序列分析方法（MLSA）继续进
97
93
100
99
100
56
88
88
53
0.005
Bacillus altitudinis 41KF2b T
Bacillus stratosphericus 41KF2a T
Bacillus aerophilus 28K T
Bacillus safensis FO-036b T
Bacillus pumilus ATCC 7061 T
Bacillus licheniformis ATCC 14580 T
Bacillus aerius 24K T
Bacillus sonorensis NRRL B-23154 T
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049 T
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 T
Bacillus subtilissubsp. subtilis NCIB 3610 T
S18-4
S5-1
DL5-1
Q66
S15-2
DL47
WFH81
Bacillus atrophaeus JCM 9070 T
图 8 邻接法构建菌株 S5-1 基于 16S rRNA 基因序列的系统发育树
68
53
Bacillus thuringiensisserovarsottostr. T04001 EU429667
Bacillus thuringiensisserovarthuringiensisstr. T01001 EU429668
Bacillus thuringiensisserovarisraelensis EU429672
Bacillus thuringiensisserovarpulsiensis BGSC 4CC1
Bacillus thuringiensisserovarpondicheriensis BGSC 4BA1
Bacillus thuringiensisserovarandalousiensis BGSC 4AW1
Bacillus thuringiensisserovarmonterrey AB617504
Bacillus thuringiensisstr. Al Hakam CP000485
Bacillus thuringiensisserovarfinitimus YBT-020 CP002508
Bacillus thuringiensisserovarkonkukianstr. 97-27 AE017355
Bacillus thuringiensisserovartochigiensis BGSC 4Y1
Bacillus thuringiensisserovar pakistanistr. T13001 contig02245
Bacillus cereus ATCC 14579
Bacillus thuringiensisserovarhuazhongensis BGSC 4BD1
Bacillus thuringiensisserovarberliner ACNF01000156
Bacillus thuringiensis ATCC 10792 T
Bacillus toyonensis BCT-7112 T
Bacillus thuringiensisserovar chinensis CT-43 CP001907
DL2-6
S3-3
DL3-4
MX2
Bacillus thuringiensisserovar kurstaki CP004069
DL1-5DL1-5
0.0005
图 9 邻接法构建菌株 DL1-5 基于 16S rRNA 基因序列的系统发育树
2014年第10期 187杜传英等：东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计及初步鉴定
行深入的分类研究。
通过对 3 株代表菌株在正常情况下和最高耐受
盐浓度下生长曲线的测定中，看出这 3 株芽胞杆菌
在刚进入高盐环境中需要一段很长的适应时间，3
株菌株调整期时间基本一致，在进入对数期到达稳
定期的时间和正常环境下的菌株也基本相同。但是
高盐胁迫下的对数生长期的生长曲线斜率明显小于
正常情况下的曲线斜率，同时在达到稳定期后 3 株
菌株的 OD600 nm 值均比正常情况下的 OD600 nm 值要小
很多。推测有可能高盐胁迫影响了菌株正常繁殖分
裂的速率。但是本研究并未涉及耐盐机理，为了寻
找耐盐芽胞杆菌适应高盐环境的原因，我们正在继
续研究在高盐胁迫下的耐盐芽胞杆菌的蛋白表达差
异，以确定其是否通过蛋白调节来改变自身适应性。
通过比较 3 株代表菌株的 16S rRNA 基因序列
发现耐盐性较好的这 3 株菌株在 16S rRNA 基因序
列上均有不同程度的碱基替换，可能这 3 株菌在进
化过程中有了一些改变，使之能够更好地适应逆境。
同 时 Bt 菌 株 MX2 与 DL3-4 和 DL2-6 与 S3-3 在 16S
rRNA 基因序列上完全一致，但是却表现出不同的耐
盐性，甚至相差近 1 倍，说明同一亚种的芽胞杆菌
之间也有着不同的适应逆境能力。
4 结论
本研究对东北各地区土壤样品中的芽胞杆菌进
行了耐盐性的统计与分析，得到该地区芽胞杆菌总
体耐盐性的数据。初步测定了分属于芽胞杆菌属不
同种的 3 株耐盐性较好的代表菌株的形态学特征、
生理生化特征、盐胁迫下生长情况及 16S rRNA 基因
序列系统发育进化关系。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）