全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
甜蛋白是一类甜度极高的蛋白，目前共发现 7
种 ：索 马 甜（Thaumatin）、 莫 热 宁（Monellin）、 巴
西 甜（Brazzein）、 马 槟 榔 蛋 白（Mabinlin）、 奇 果
蛋白（Miraculin）、仙茅蛋白（Curculin）和培它丁
（Pentadin）。它们具有甜度高、热量低、安全、无毒
等优点。其中 Thaumatin 已被批准进行商业化生产，
但是其热稳定性差［1］。巴西甜（Brazzein）是 Ming
和 Hellekant［2］从西非植物 Pentadiplandra brazzeana
Baillion 果实中分离得到的，它有一种由 53 个氨基
酸组成异构体（仅仅缺乏第一个氨基酸，称为 des-
pGlu1-Brazzein），其甜度是 Brazzein 的两倍，是蔗糖
甜度的 1 000 倍。是目前为止所发现的 7 种甜蛋白
中甜度最高、分子量最小、水溶性最好的蛋白，并
收稿日期 : 2012-05-11
作者简介 : 徐婷婷 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 基因工程 ; E-mail: sdxutingting@sian.com
通讯作者 : 李春丽 , 女 , 副教授 , 研究方向 : 分子生物学 ; E-mail: hnclli@163.com
植物甜蛋白 des-pGlu1-Brazzein 基因在乙醇氧化酶缺陷
型甲醇酵母中的表达及其活性分析
徐婷婷  陈锐博  暴元元  赵卫东  郑振宇  李春丽
（河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）
摘 要 ： 采用 Bgl Ⅱ酶切重组表达载体 pPIC9K-Bra，纯化后电击转化甲醇酵母菌 GS115，构建乙醇氧化酶缺陷型表达菌株
GS115-pPIC9K-Bra，筛选鉴定后，以 0.5% 的甲醇进行诱导，表达的目的蛋白约占上清总蛋白的 95%，纯度较高，并具有一定的甜度。
成功构建了乙醇氧化酶缺陷型的甲醇酵母表达菌株，为深入研究其应用奠定了基础。
关键词 ： 甜蛋白 甲醇酵母 克隆表达 活性检测
Expression of Plant des-pGlu1-Brazzein Gene in Alcohol Oxidase-
defective Strain of Pichia pastoris and Analysis of Its Biological Activity
Xu Tingting Chen Ruibo Bao Yuanyuan Zhao Weidong Zheng Zhenyu Li Chunli
（Department of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）
Abstract:  Digested by Bgl Ⅱ, the linear recombinant expression vector pPIC9K-Bra was transformed into Pichia pastoris GS115 by
electric shock to produce alcohol oxidase -defective expression strain GS115-pPIC9K-Bra. The strain was identified by PCR and induced by 0.5%
methanol. The results indicated that the secreted target protein accounted for 95% of total protein in supernatant fluid and showed biological
activity. The alcohol oxidase -defective expression strain GS115-pPIC9K-Bra was successfully constructed which was foundation for further
study.
Key words:  des-pGlu1-Brazzein Pichia pastoris GS115 Expression Biological activity
且耐热性好、对 pH 稳定，具有广阔的开发应用前
景［3， 4］。
然而其产于西非，资源有限，难以规模化生产，
人工合成价格昂贵，限制了它的应用。利用基因工
程的方法生产是一有效途径，有不少甜蛋白已经在
原核和真核细胞中表达［5-14］。本研究在已经构建好
的载体 pPIC9K-Bra 基础上［10］，采用目前广泛使用
的甲醇酵母（Pichia pastoris）作为宿主菌［15，16］，构
建 des-pGlu1-Brazzein 高效分泌表达的乙醇氧化酶缺
陷型工程菌株，对其进行诱导表达和活性分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基 YEPD 培养基 ：酵母提取物 1%，蛋
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期140
白 胨 2%， 葡 萄 糖 2% ；MD 培 养 基 ：1.34% YNB，
0.000 04% 生物素，2% 葡萄糖，1.5% 琼脂 ；MM 培
养基 ：1.34% YNB，0.000 04% 生物素，0.5% 甲醇，
1.5% 琼脂 ；BMGY 培养基 ：1% 酵母提取物 2% 蛋
白 胨，1.34% YNB，0.000 04% 生 物 素，1% 甘 油，
0.1 mol/L 磷酸钾缓冲液 pH6.0 ；BMMY 培养基 ：将
BMGY 中的 1% 甘油用 0.5% 的甲醇替代。
1.1.2 酶和试剂 限制性内切酶 Bgl Ⅱ，EX Taq 酶
购自大连宝生物工程有限公司。去糖基化酶（Endo-
glycosidase H）购自 New England Biolabs 公司。DNA
纯化试剂盒购自赛百胜公司。其它试剂均为国产分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 酵母感受态细胞的制备 参照 Invitrogen 公司
的说明制备酵母感受态细胞［17，18］，并有所改进。
将酵母接种于 5 mL YEPD 培养基中 30℃培养过夜，
而后按照 0.1% 的接种量接种到于 100 mL YEPD 培
养基中，培养过夜至 OD600=1.3-1.6，1 500×g 低温
离心 5 min，等体积的冰冷无菌水悬浮，再次用 50
mL 冰冷的无菌水悬浮，而后用 4 mL 1 mol/L 冰冷的
山梨醇悬浮，最后用 0.2 mL 1 mol/L 冰冷的山梨醇悬
浮菌体。
1.2.2 重组质粒电击转化甲醇酵母 参照文献［19］，
将重组表达载体 pPIC9K-Bra 和对照空载质粒 pPIC9K
分别用限制性内切酶 Bgl Ⅱ酶切，纯化后取 10 μL
分别转化 80 μL 的酵母感受态细胞 GS115，电击后
立即加入冰冷的 1 mol/L 山梨醇，取 200-600 μL 涂
布于 MD 培养基上，2-6 d 后观察转化子的生长。由
于线性化的质粒与酵母细胞的基因组发生重组，外
源的 des-pGlu1-Brazzein 基因置换了染色体上有功能
的乙醇氧化酶基因（AOX1）［15，16］，从而使酵母在
甲醇培养基上生长时，只能微弱转录 AOX2 基因，
利用甲醇的能力很弱，使甲醇酵母由 Mut+ 转变为
Muts。同时使受体细胞由 His转变为 His+，使其能够
在选择培养基 MD 上生长。
1.2.3 整合转化子的筛选和鉴定 挑取在 MD 培养
基上生长的菌落，在 96 孔板中培养，连续转接 3 次，
使每一个克隆的细胞密度都相同，然后分别点种 10
μL 于 MM、MD 培养基及其含逐步增高 G418（0.25、
0.5、0.75、1、1.5、2、3 和 4 mg/mL） 的 YEPD 培
养基上，于 30℃培养 2-3 d，筛选具有高 G418 抗性
且生长良好的菌株［20］。将筛选的转座子进行菌落
PCR，以 5 和 3AOX1（乙醇氧化酶 1）引物（5 端
引 物 ：5-GACTGGTTCCAATTGACA AGC-3 ；3 端
引 物 ：5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3） 进 行
PCR 检测，扩增的条件是 ：94℃ 1 min，54℃ 1 min，
72℃ 1 min，共 30 个循环 ；最后 72℃ 10 min。
1.2.4 工程菌株的诱导表达和糖基化分析 参照
文献［21］，分别挑取对照菌株和工程菌株的单菌
落，接种于于 100 mL 的 BMGY 培养基上，30℃培
养 OD600 至 2-6（约 16-18 h），离心收集菌体，用
20 mL 的 BMMY 培养基悬浮培养，每日补加甲醇至
终浓度为 0.5%，诱导 6 d，取样品上清液进行 SDS-
PAGE 凝胶电泳分析，检测表达结果。
将表达的蛋白透析后按照 New England Biolabs
公司的产品说明书进行去糖基化处理，而后进行
SDS-PAGE 分析。
1.2.5 des-PGlu1-Brazzein 的活性检测 参照崔洪志
等［22］的方法，将获得的上清中的 des-pGlu1-Brazzein
用透析袋透析过夜后，用聚乙二醇 8000 进行浓缩，
BCA 法测定蛋白浓度，而后调整其浓度为 0.02% 的
母液（即 1 mL 水中含 0.02 mg 的纯化蛋白），进一步
获得稀释成 2，4，6，8，10 倍等不同的稀释倍数的
待测溶液。用 2% 的蔗糖作为对照，通过多人品尝
的方法确定与之相当的甜度的 des-pGLU1-Brazzein 的
稀释倍数。确定纯化后的 des-pGlu1-Brazzein 的甜度。
2 结果
2.1 GS115-pPIC9K-Bra酵母工程菌株的筛选
转化后的菌液涂布于 MD 平板上进行初步筛选，
共筛选得到约 40 株整合子。
2.2 GS115-pPIC9K-Bra酵母工程菌的鉴定
筛选到的工程菌株在 MD 培养基上可以生长，
而在 MM 培养基上不能生长，证明所获得的工程菌
株为 Muts，筛选到的菌株在 G418 为 0.25 mg/mL 和
0.5 mg/mL 均可以生长，在 1 mg/mL 时有 10 多株生
长良好，而在 2 mg/mL 时无菌落生长。而对照菌株
GS115 在 G418 为 0.25 mg/mL 浓度时就无菌落生长。
以筛选到高 G418 抗性的重组子菌落为模板，
2012年第12期 141
徐婷婷等 ：植物甜蛋白 des-pGlu1-Brazzein 基因在乙醇氧化酶缺陷型甲醇酵母中的
表达及其活性分析
以 AOX1 5 和 AOX1 3 为引物进行 PCR，结果如图
1 所示。图 1-A 可见 ：阴性对照和 GS115 菌株均未
扩增出任何片段，GS115-pPIC9K 扩增出一条约 500
bp 的片段，此为 AOX1 基因的片段（494 bp）；而
工程菌株的菌落扩增出一条为约 700 bp 的目的片
段，此为 AOX1 基因片段（494 bp）加上 des-pGlu1-
Brazzein 基因（179 bp）的结果。菌落 PCR 均未扩
增出 2 200 bp 的 AOX1 基因，进一步证明所得的工
程菌株为 Muts 菌株。共得到了多个整合子（图 1-B）。
2000
bp
1A 2 3 4 5 6
1MB 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1600
1000
750
250
100
500
2000
bp
1600
1000
750
250
100
500
A: 1.DNA Marker； 2 . control； 3. GS115 的菌落；4. GS115-pPIC9K 菌落 ；5, 6.
GS115-pPIC9K-Bra 菌落 ；B: M. DNA Marker ；2-10. GS115-pPIC9K-Bra 的
菌落
图 1 重组酵母的菌落 PCR 鉴定
2.3 GS115-pPIC9K-Bra的诱导表达和糖基化分析
取诱导表达工程菌上清液进行 SDS-PAGE 电泳
验证结果如图 2 所示。图 2 显示 GS115-pPIC9K-Bra
比对照 GS115-pPIC9K 多表达了一条约 13 kD 的目的
蛋白，表达量约占上清总蛋白的 95% 以上，纯度较
高，如箭头所示。由于表达的 des-pGlu1-Brazzein 的
分子量比预计分子量大，采用 Endoglycosidase H 进
行去糖基化处理，其分子量明显减少，约为 7.4 kD，
比预期的分子量 6.5 kD 相差不大，结果如图 3 所示，
目的蛋白如箭头所示。而在 31 kD 下方出现的蛋白
条带为去糖基化酶（29 kD）。
2.4 des-pGlu-Brazzein的纯化和活性分析
由于得到的目的蛋白纯度较高，用透析袋透析
1 2 3 4 kD
94
67
43
30
20.1
14.4
1, 2. GS115-pPIC9K-Bra 诱导表达的上清液 ； 3.GS115-pPIC9K
诱导表达的上清液 ； 4. Protein Marker
图 2 表达产物的 SDS-PAGE 分析
200
kD 1 2 3 4
116.3
97.4
66.3
55.4
36.5
31
21.5
14.4
6
3.5
2.5
1.Protein Marker；2-4.去糖基化酶处理后的 des-pGlu1-Brazzein
图 3 糖基化酶处理目的蛋白
后，测定蛋白浓度，而后通过品尝的方法检测 des-
PGLu1-Brazzein 的活性，结果表明表达的甜蛋白有
一定的甜度。
3 讨论
des-PGlu1-Brazzein 是到目前为止所发现甜度最
高的蛋白，利用基因工程的方法生产该蛋白具有重
要意义。已有研究者在原核生物中表达并生产巴西
甜蛋白［5-9］，我们也曾经优化了 des-pGlul-Brazzein
的编码序列，使其在大肠杆菌中得到了高效表达［5］。
但是存在的主要问题是表达的蛋白多以包涵体形式
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期142
存在，还需要进一步的复性才具有活性。采用真核
表达系统如酵母表达的蛋白多是分泌表达，易于纯
化，并且不需要复性。我们曾构建了野生型甲醇酵
母工程菌株（Mut+），并表达了该蛋白，但是其杂蛋
白较多，目的蛋白只有上清总蛋白的 51.6%［10］。有
研究表明，乙醇氧化酶缺陷型甲醇酵母（Muts）表达
的目的蛋白含量更高［15，16］，因此本研究以 Bgl Ⅱ酶
切 pPIC9K-Bra，电击转化酵母，构建 Muts 工程菌株，
结果显示表达的甜蛋白分泌到上清中，占上清蛋白
的 95% 左右，纯度较高，比野生型工程菌株更有利
于大规模生产。这与王长远等［11］构建的 SMD1168
甲醇酵母表达的结果是一致的，但是有些 Muts 工程
菌株在上清液中表达的目的蛋白纯度较低，杂蛋白
很多［12，13］，具体原因还有待于进一步的研究。
外 源 蛋 白 在 甲 醇 酵 母 表 达 时 常 常 被 糖 基
化［15， 16］，本研究表达的 des-pGlu1-Brazzein 带有糖
基，使表达蛋白的分子量比预期大，这与我们以前
的研究结果和史勇等［10，14］的结果一致。有些结果
则显示表达蛋白的分子量与预期一致［11-13］，没有被
糖基化。酵母菌株对蛋白糖基化修饰是否有什么选
择或者条件还有待于进一步深入研究。
所表达的目的蛋白纯化后经多人品尝，具有一
定的甜度，约为蔗糖甜度的 200 倍，比报道的甜度
低，可能与品尝的测定的方式具有较大的主观性有
关，导致测定结果可能有较大的误差。此外，还可
能与其糖基化有关，这还需要进一步的分析。
4 结论
本研究成功地构建了巴西甜蛋白的乙醇氧化
酶缺陷性酵母工程菌株，甲醇诱导后巴西甜蛋白
成功表达，约占上清总蛋白的 95%，并具有一定
甜度。
参 考 文 献
［1］ Faus I. Recent developments in the characterization and biotechnolo-
gical production of sweet-tasting proteins. Appl Microbiol Biotechnol,
2000, 53（2）：145-151.
［2］ Ming D, Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable
sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B. FEBS Lett, 1994,
355（1）：106-108.
［3］ Assadi-porter FM, Aceti DJ, Cheng H, et al. Efficient production of
recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of
plant origin. Arch Biochem Biophy, 2000, 376（2）：252-258.
［4］ Assadi-porter FM, Aceti DJ, Markley JL. Sweetness of determinant
sites of brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein. Arch
Biochem Biophy, 2000, 376（2）：259-265.
［5］ 李春丽 , 何国庆 , 阮晖 , 等 . des-pGlu1-Bra 基因的人工合成及
其在大肠杆菌中的重组表达 . 农业生物技术学报 , 2005, 13（1）：
38-41.
［6］ 刘松财 , 张永亮 , 任晓慧 , 等 . 甜味蛋白（brazzein）基因的人
工合成及其在大肠杆菌中的重组表达 . 中国兽医学报 , 2006, 26
（5）：538-540.
［7］ 张咏春 , 郝思捷 , 邹寅 , 等 . 甜味蛋白 Brazzein 在 Escherichia
coli 和 Bacillus subtilis 中的表达研究 . 复旦学报 ：自然科学版 ,
2009, 48（1）：135-142.
［8］ Assadi-porter FM, Patry M, Markley JL. Efficient and rapid protein
expression and purification of small high disulfide containing sweet
protein brazzein in E. coli. Protein Expr Purif, 2008, 58（2）：263-
268.
［9］ Berlec A, Strukelj B. Large increase in brazzein expression achieved
by changing the plasmid/strain combination of the NICE system in
Lactococcus lactis. Lett Appl Microbiol, 2009, 48（6）：750-755.
［10］ 李春丽 , 韩露 , 郑振宇 , 等 . 植物甜蛋白 des-pGlu1-Brazzein 的
密码子优化及其在毕氏酵母中的表达 . 生物工程学报 , 2011,
27（8）：1158-1163.
［11］ 王长远 , 张丽萍 , 刘松财 , 等 . 甜味蛋白 Brazzein 在毕赤氏酵
母中表达的初步研究 . 中国食品学报 , 2009, 9（5）：43-48.
［12］ 马永平 , 钟贞 , 宋方洲 , 等 . 甜味蛋白 Brazzein 基因的合成
及在毕赤酵母中的表达 . 西南农业大学学报 ：自然科学版 ,
2004, 24（1）：71-74.
［13］ 赵红玲 , 陈劲春 . 利用毕赤酵母表达植物甜蛋白（brazzein）
的初步研究 . 北京化工大学学报 , 2005, 32（2）：14-17.
［14］ 史勇 , 张明军 , 张英 , 等 . 甜味蛋白 Brazzein 基因酵母表达系
统的建立 . 吉林农业大学学报 , 2010, 32（1）：43-46.
［15］ Romanos M. Advances in the use of Pichia pastoris for high-level
gene expression. Curr Opin Biotech, 1995, 6（5）：527-533.
［16］ Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev, 2000,
24（1）：45-66.
［17］ Pichia expression kit. For expression of recombinant protein in
2012年第12期 143
徐婷婷等 ：植物甜蛋白 des-pGlu1-Brazzein 基因在乙醇氧化酶缺陷型甲醇酵母中的
表达及其活性分析
Pichia pastroris. Invitrogen Corportation.
［18］ Trujillo LE, Arrieta JG, Dafhnis F, et al. Fructo-oligosaccharides pr-
oduction by Gluconacetobacter diazotrophicus levansucrase expres-
sion in the methylotrophic yeast Pichia pastroris. Enzyme and Mic-
robial Technology, 2001, 28 ：139-144.
［19］ Ide N, Kaneko R, Wada R, et al. Cloning of the thaumatin Ⅰ cDNA
and characterization of recombinant thaumatinⅠsecreted by Pichia
pastoris. Biotechnol Prog, 2007, 23 ：1023-1030.
［20］ Scorer CA, Clare JJ, McCombie WR, et al. Rapid selection using
G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-
level foreign gene expression. Biotechnology, 1994, 12（2）：181-
184.
［21］ 聂东宋 , 李敏 , 徐辉明 , 等 . 重组虎纹捕鸟蛛毒素 -1 在巴氏毕
氏酵母中的表达和纯化 . 生物工程学报 , 2002, 18（2）：172-
177.
［22］ 崔洪志 , 李敏 , 徐琼芳 , 等 . 植物 monellin 甜蛋白基因的细菌
化改造合成及其在大肠杆菌中的表达 . 中国农业科学 , 1999,
32（1）：58-62.
（责任编辑 李楠）