全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 3) : 246~ 250
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 11- 01; 修回日期: 2001- 03- 27
基金项目: 北京市重点实验室基金资助项目 (951890200)
甜蛋白基因 MBLII对莴苣的遗传转化
刘敬梅1, 2 陈大明2 陈 杭2
( 1浙江大学园艺系, 杭州 310029; 2 北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100089)
摘 要: 以4 日龄莴苣 ( Lactua sativa L . ) 无菌苗子叶为外植体, 通过根癌农杆菌介导,
成功地进行了马槟榔甜蛋白基因 MBLII对莴苣的遗传转化。抗生素浓度和子叶外植体与农杆
菌的共培养时间是影响转化的重要因素。附加卡那霉素 ( Kan) 50 mg/ L 的诱芽培养基 MS I
( MS+ NAA 0. 1 mg/ L+ 6BA 0. 1 mg/ L+ 羧卞青霉素 500 mg/ L) 最适于侵染后子叶外植体的诱
芽培养。在外植体与农杆菌共培养 0~ 7 d的范围内, 以共培养 3 d 最佳 (生芽率 58. 3% , 白
化率 29% )。1~ 2 cm 再生芽移入诱根培养基MS II ( MS+ NAA 0. 05 mg/ L+ Kan 50 mg/ L+ 羧苄
青霉素300 mg/ L) 中, 诱根率可达100%。获得的抗性植株经组织化学及 PCR特异扩增鉴定和
统计, 7. 6%阳性。Southern blot结果证明 MBL II基因已整合到莴苣基因组中。
关键词: 甜蛋白; 莴苣; 遗传转化
中图分类号: S 636. 2; Q 785 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 03024605
关于莴苣的组织培养和遗传转化已有成功的报道1~ 3 。Curtis等将硝酸还原酶基因导
入4个莴苣主要栽培种, 降低了莴苣叶片的硝酸盐含量, 改善了莴苣的品质, 提高了食用
价值和经济价值。莴苣的口味直接影响其受喜爱的程度。Samuel Sun等4 从中国云南省马
槟榔 ( Capperis masaikai ) 的种子中克隆了甜蛋白基因 MBL II, 该蛋白的甜度是相同质量蔗
糖的 400倍, 而且甜味持久。作者采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法, 将 MBL II基因导
入莴苣中, 为利用基因工程改良莴苣风味品质进行了探索。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
将莴苣品种 !北山三号∀ 种子用 5% NaClO灭菌 15 min 后, 无菌水冲洗 4~ 5次, 置
于1/ 2MS培养基上, 黑暗下 28 # 萌发。4 d后切取子叶, 进行遗传转化。
1. 2 质粒和菌株
图 1 质粒 pLX10 ( 1. 6 kb嵌合基因 MBLII位于质粒 pBI121上)
Fig. 1 pLX10 ( 1. 6 kb chimeric MBLII gene in pBI121)
根癌农杆菌菌株 LBA4404, 含双元载体, 其中质粒 pLX10含有 MBL II、NPT II 和 GUS
基因 (见图1)。该基因由美国夏威夷大学植物分子生理学系教授 Samuel Sun提供。
1. 3 共培养及抗性芽筛选
莴苣子叶外植体去尖端和基端, 浸入 28 # 液体 YEB 培养基中培养 2 d的根癌农杆菌
菌液中, 1 h后取出, 用无菌滤纸吸干菌液, 28 # 培养基上暗培养 0、1、3、5、7 d 后,
转移到含卡那霉素 ( Kan) 0 (对照)、25、50、100、200、250 mg/ L 的筛选培养基MSI 上
筛选转化芽。20 d左右, 在外植体切口边缘的白色愈伤组织上长出 1~ 2 cm 芽。将芽切下
放入MS II 培养基 ( MS+ NAA 0. 05 mg/L+ Kan 50 mg/ L+ 羧苄青霉素 300 mg/ L) 中诱根。
生根后将小植株先移入含 Hogland和 Snyde营养液的蛭石中炼苗 10~ 15 d, 再移入土壤,
置于温室自然光照下生长。
1. 4 GUS 检测
GUS 活性采用 Jefferson 等5 的方法检测。选取 Kan 抗性芽叶片, 浸入 GUS 染色液
(100 mmol/ L磷酸缓冲液, 0. 1% Triton X100, 1. 0 mmol/ L EDTA, 0. 5 mmol/ L K3Fe( CN) 6,
0. 05 mmol/ L K4( CN) 6, 1 mmol/ L XGluc) 中, 37 # 保温3~ 5 h, 吸弃染色液, 加入70%酒
精脱色, 待绿色褪尽, 整张叶片或叶脉处呈现深兰色者为阳性。
1. 5 PCR扩增
1. 5. 1 引物设计 根据 MBL II序列设计一对特异引物 P1、P2, 序列如下:
P1: 5∀ ACCTTGGCTCTCTTCGTTCT 3∀ ;
P2: 5∀ GCTCCGATGTTGGGTATGTT 3∀。
1. 5. 2 DNA快速提取及PCR 从 GUS 染色阳性植株上取半片小幼叶, 放入 1. 5 mL 离心
管中, 加入100 L 0. 5 mol/ L NaOH 溶液, 匀浆, 立即 13 000 g离心1 min, 取5 L 上清液
至一个含 45 L 100 mmol/ L TrisHCl ( pH 8. 0) 的新离心管中, 混匀, 取 2 L 用于 20 L
体系PCR反应。PCR反应在 PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9600上进行, 反应条件为
94 # 30 s, 55 # 30 s, 72 # 1 min, 进行 30个循环。PCR扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电
泳检测。
1. 6 Southernblot 分析
参照陈大明等6 报道的方法, 提取转基因莴苣植株总 DNA, 取 20 g DNA用限制性内
切酶 EcoRI酶切, 0. 7%琼脂糖凝胶电泳 12~ 16 h, DNA充分分离后, 转移到尼龙膜上7 。
采用 Boehriger公司地高辛标记试剂盒, 操作步骤按厂商说明书进行。将甜蛋白基因 400 bp
PCR产物进行标记, 并用含 7% SDS和 50%去离子甲酰胺杂交液进行预杂交和杂交。杂交
膜经 2 ∃ SSC、0. 1% SDS室温洗涤两次, 0. 1 ∃ SSC、0. 1% SDS 68 # 洗涤两次后再经抗原
抗体显色反应, 然后进行 X光片曝光处理。
2 结果与讨论
2. 1 Kan抗性植株的获得及影响因子
2. 1. 1 抗 Kan植株的再生 莴苣对照子叶外植体在无 Kan的 MS I 培养基中再生率可达
100% , 当Kan浓度达到 50 mg/ L时难以再生出正常芽。经根癌农杆菌侵染的部分外植体
在含Kan培养基中首先膨大, 然后在切口处形成白色愈伤组织, 10 d左右在愈伤组织中间
2473期 刘敬梅等: 甜蛋白基因 MBLII对莴苣的遗传转化
可见绿色小芽, 但比对照出芽稍迟, 而且每块外植体上的芽数也少于对照 (对照一般 7~
8个芽/外植体, 经侵染处理的则为 4~ 5个芽/外植体)。与农杆菌共培养后的外植体在
Kan 25~ 250 mg/ L 的浓度梯度中, 芽再生率随 Kan 浓度升高而降低, 达到 250 mg/ L 后,
芽再生困难 (图 2)。待抗性芽长至 1~ 2 cm后, 移入筛选生根培养基, 均能 100%生根。
再生植株在蛭石中炼苗 10~ 15 d后, 移入
土壤成活率达到 100%。
2. 1. 2 共培养时间对 Kan 抗性芽分化的
影响 莴苣子叶外植体经根癌农杆菌侵染
后在无Kan培养基中共培养是成功转化的
重要因素。不经过共培养阶段的子叶外植
体, 在筛选培养基上能够在伤口处产生愈
伤组织, 但很难再生出芽。这可能是由于
共培养时间过短, TDNA转移不充分造成
的。而共培养 7 d 或更长, 则根癌农杆菌
过度繁殖, 外植体受伤严重, 芽再生率迅
速降低。图 3结果表明, 外植体在共培养
0~ 5 d范围内, 虽然随共培养时间的增加,
抗性芽分化频率提高, 但再生芽中假阳性
芽也大幅度升高。这些芽在筛选生根培养
基上逐渐白化死去, 为无效芽。这与 Sueo
等3 的报道相一致。因此莴苣的转化以共
培养 3 d最佳 (生芽率为 58. 3%, 白化率
29% )。试验中还发现, 暗培养对转化率有
很大影响。光照下共培养的再生率仅为
2. 1%, 而在黑暗下进行共培养的外植体的
出芽率达到 58. 3%。
2. 2 转基因莴苣的鉴定
2. 2. 1 GUS 基因在莴苣叶片中的表达
GUS 检测结果表明, 不同抗性芽叶片 GUS
基因表达部位和表达程度各不相同。一般
情况下, GUS 基因在叶片的叶脉处表达较
强, 叶脉呈蓝色; 有些叶片 GUS 基因表达
特别强, 则全部呈深蓝色; 有的叶片 GUS
基因表达很弱, 只有零星蓝色斑点 (图
4)。统计 GUS 染色结果, Kan 抗性芽中
7. 6%为 GUS 阳性芽。大量非转化芽的存
在, 可能是由于在遗传转化过程中, 子叶
外植体与农杆菌共培养的同时, 形成了许
图 2 Kan浓度对莴苣抗性芽分化的影响
Fig. 2 Effects of Kan concentration on shoot
differentiation frequency
图 3 不同共培养时间对芽再生的影响
Fig. 3 Effect of duration of coculture
on shoot regeneration
图 4 抗 Kan再生芽叶片的 GUS染色分析
1. 整张叶片蓝色; 2, 3. 叶脉蓝色为主; 4. 零星蓝斑。
Fig. 4 GUS histochemical assay of leaves of
kanamycin resistant shoots.
1. Whole leaf in blue; 2, 3. Mainly vein in blue;
4. Sporadic blue spots.
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多非转化芽原基。这些芽原基在移入筛选培养基后, 能够利用子叶中储藏的养分, 发育成
假阳性再生芽。
2. 2. 2 莴苣总 DNA 的 PCR特异扩增检测 利用甜蛋白基因序列内部的一对特异引物,
对 GUS 阳性植株进行PCR特异扩增, 发现 GUS 染色阳性植株均可扩增出特异的 400 bp条
带 (图5)。
2. 2. 3 转基因莴苣植株的 Southern blot 从图 6结果可以看出, 转基因莴苣总 DNA 与
MBL II 400 bp探针均有一条杂交带, 而且两植株的杂交带大小不同, 表明 MBL II基因已单
拷贝整合到莴苣基因组 DNA中, 而且整合的位置不同。甜蛋白基因在莴苣中的表达水平,
仍需做进一步的蛋白检测。
图 5 转基因莴苣植株的 PCR特异扩增检测
1. DL2000分子量标准; 2. pLX10质粒 (含 MBL II
基因) ; 3. 未经转化植株; 4~ 8. 转基因植株
Fig. 5 PCR screening of transformed lettuce
1. DL2000 DNA marker 2. pLX10 plasmid with MBL II gene
3. Nontransformed plant 4- 8. Transformed plant
图 6 转基因莴苣植株的 Southernblot 分析
1. 阳性对照 (含 MBL II 基因的质粒 pLX10 0. 8 kb酶
切片段) ; 2. 未转基因植株; 3, 4. 转基因植株
Fig. 6 Southernblot analysis of transformed lettuce
1. Positve control (0. 8 kb fragment with MBL II gene) ;
2. Nont ransformed plant ; 3, 4. Transformed plants.
参考文献:
1 Richard M, Ellen M , Susan S, et al. Transformation of lettuce ( Lactuca sativ ) a mediated by Agrobact erium tumyfaci ens. Plant
Cell Reports, 1987, 6: 439~ 442
2 Curtis L S , Power J B, De Loat A M M, et al . Expression of a chimeric nitrate reductase gene in transgenic lettuce nitratee in
leaves. Plant Cell Reports, 1999, 18: 889~ 896
3 Sueo E, Hirotaka I, Masahiro O, et al . Induced expression of a chimeric gene construct in t ransgenic lettuce plants using tobacco
pathogenesisrelated protien gene promoter region. Plant Cell Reports, 1990, 9: 6~ 9
4 Samuel S, Liwen X, Zhong H, et al . Recombinant sweet prot ien Mabinl in. PCT Patent 1997, WO 97/ 00945
5 Jefferson R A, KavanaghT A, Bevan M W. GUS fusion: glucuronidase as a sensit ive and versat ile gene fusion marker in higher
plants. EMBO. J. , 1987, 6: 3901~ 3907
6 陈大明, 张上隆, 金勇丰. 一种木本果树基因组 DNA 提取方法研究. 浙江大学学报, 1997, 23 (6) : 621~ 624
7 萨姆布鲁克, 弗里奇, 曼斯阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 金冬雁等译. 北京: 科学出版社, 1992. 475~ 483
2493期 刘敬梅等: 甜蛋白基因 MBLII对莴苣的遗传转化
Genetic Transformation and Plant Regeneration of Lettuce with Sweet
Protein Gene MBLII
Liu Jingmei1, 2, Chen Daming2, and Chen Hang2
( 1Department of Horticulture, Zhejiang University , Hangzhou 310029; 2Beijing Vegetable Research Center , Beij ing
100089)
Abstract: The sweet protein gene MBL II was introduced into lettuce by coculturing excised
cotyledon explants with Agrobacterium tumefaciens . The Agrobacterium strain LBA4404 contained the
binary vector pLX10, which carried sweet protein gene MBL II, select ive gene NPT II and reporter
gene GUS . The best transformation efficiency was obtained when explants were cocultured with
Agrobacterium for 3 days and cultured on the selective medium containing 50 mg/ L kanamycine
(shoots regeneration rate 58. 3%, albino rate 29% ) . Roots were induced in all adventitious shoots
on MSII (MS+ NAA 0. 05 mg/ L+ Kan 50 mg/ L+ carbencillin 300 mg/L ) . The transgenic nature
of regenerants were demonstrated by plant growth on medium containing kanamycine, GUS histochemi
cal assay and PCR amplification. 7. 6% of all Kanamycine resistant shoots was GUS positive.
Southern blot results confirmed that the MBL II gene had been incorporated into the genome of lettuce.
Key words: Sweet protein; Lettuce; Transformation
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