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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):61-67
阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的阿
维菌素是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素，在
医药、农业和畜牧业生产中具有良好的应用价值和
广阔的市场前景［1］。国内外学者对阿维链霉菌的高
产机制进行了广泛研究［2］，这些研究主要集中在基
因水平和蛋白质水平，而对阿维菌素产量低、副产
物浓度过高等不利表型关注不多［3-5］。对于外界环
境胁迫，细胞具有非常精妙和极其复杂的调控和适
应机制，不仅涉及到“上游”基因组、转录组和蛋
白质组等水平的变化，还包括“下游”对于外界扰
动更加敏感的代谢物、代谢路径和代谢网络等层面
的变化［6］。
代谢物组学（Metabolomics/Metabonomics）是对
生物体内所有相对分子质量在 1 000 以内的代谢物
进行定性和定量分析［7］，它是继基因组学和蛋白学
之后发展起来的组学学科。其着重于全局分析和理
收稿日期 ：2014-09-24
基金项目 ：国家“973”项目（2013CB734004），国家“863”项目（2012AA021302），国家自然科学基金项目（31370075，31471725）
作者简介 ：郭刚，男，硕士研究生，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：guogangx@163.com
通讯作者 ：高强，男，教授，研究方向 ：代谢控制发酵 ；E-mail ：gaoqiang@tust.edu.cn
基于 GC-MS 的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立
郭刚  唐丹  田萍萍  石秀峰  曹鹏  高强
（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）
摘 要 ： 基于 GC-MS 分析平台，建立了阿维链霉菌代谢物组样品制备过程中的菌体分离、细胞清洗、细胞淬灭及代谢物
提取条件，并对阿维菌素高产菌株和野生菌株胞内代谢物组进行了初步分析。采用“冷冻离心 - 细胞清洗（3 次）- 液氮淬灭（5
min）- 珠磨破壁（3 个循环，每个循环 48 s）- 提取（氯仿∶乙醇∶水 = 2∶2∶1）”的方法，可以定性和定量检测阿维链霉菌胞内
包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类等 59 种差异化合物。建立的方法能够有效地用于阿维链霉菌胞内代谢物的分析。
关键词 ： 阿维链霉菌 ；代谢物组 ；破壁 ；提取 ；GC-MS
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.010
Optimized Sample Preparation for Metabolome Studies on Streptomyces
avermitilis by GC-MS
Guo Gang Tang Dan Tian Pingping Shi Xiufeng Cao Peng Gao Qiang
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science &
Technology，Tianjin 300457）
Abstract: We established a method for preparing metabolome sample of Streptomyces avermitilis, including cell separation, washing,
quenching, disruption and extraction conditions based on GC-MS analysis system, and applied it in the analysis of the metabolome of industrial
strain 9-39 and wild type strain. The optimal conditions for sample preparation were as follows: separating cells by centrifugation, washing
3 times, quenching 5 minutes with liquid nitrogen, cell disruption with bead mill（3 cycles and 48 seconds per each cycle）, and extraction
of metabolites（chloroform∶ethanol∶water = 2∶2∶1）. By using this optimized protocol, 59 differential compounds were identified and
quantified, including amino acids, organic acids, fatty acids and saccharides. Our established method can be used to effectively analyze the
Streptomyces avermitilis metabolites.
Key words: Streptomyces avermitilis ；metabolomics ；cell disruption ；extraction ；GC-MS
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.562
解代谢网络与动态调节以及代谢通路控制［8，9］。代
谢物组学在定量分析系统生物学中扮演着重要的角
色。在这一领域已经建立了气质（GC-MS）、液质
（LC-MS）和核磁（NMR）等检测手段［10］。
微生物代谢物组学需要高效可靠的样品前处理，
这样才能够确保胞内代谢物分析的准确性［9，11］。然
而，最近许多科研工作者未进行条件优化，直接使
用文献报道的样本前处理方法。为了确保样品准确
反映生物体的特定状态，研究合理有效的胞内代谢
物提取方法显得尤为重要。常用的方法是在细胞悬
液中加冷甲醇或其他有机溶剂，瞬间停止细胞的代
谢［12］。但这个方法的缺点是，在淬灭过程中有机溶
剂裂解细胞导致大量胞内代谢物丢失［13］。另一种方
法是将菌体从培养基中分离出来之前或之后用液氮
进行淬灭［9，13，14］。代谢物提取过程中，提取方法和
提取溶剂对提取物的种类和含量有较大的影响。本
试验着重研究了细胞分离过程中的细胞清洗次数、
破壁方法（液氮研磨和珠磨法）、破壁次数和提取溶
剂对代谢物提取的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 阿维链霉菌野生型（WT）和高产菌株
（9-39）均由中国科学院微生物研究所提供。培养基
和培养方法见文献［15］。
1.1.2 主要试剂 甲氧基铵盐酸盐（色谱纯）与吡
啶（色谱纯），天津元立化工有限公司 ；N-甲基 -N-
（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（色谱纯），Alfa Aesar 化
学有限公司。
1.1.3 仪 器 与 设 备 Precellys 24 珠 磨 器， 法 国
Bertin 公司 ；LC/MS 气相色谱 - 质谱联用仪，配有
7683 自动进样器与 6980 气相色谱仪（GC，Agilent
Technologies，Palo Alto，CA，USA）。
1.2 方法
1.2.1 菌体制备及淬灭 取 20 mL 阿维链霉菌发酵
液 8 000 r/min 离心 5 min，上清液 -80℃冻存，用于
后续分析。在离心后的细胞沉淀中加入 4℃预冷的
0.6% NaCl 水 溶 液， 震 荡，6 000 r/min、4 ℃ 离 心 5
min，取 1 mL 上清液 -80℃冻存，用于后续分析，弃
上层缓冲液保留下层细胞沉淀，反复 3 次，以去除
细胞表面的培养基成分［16］。将清洗后的细胞置于液
氮中，淬灭 5 min，-80℃保存备用。
1.2.2 细胞破碎和胞内小分子提取
1.2.2.1 液氮研磨细胞破碎 将淬灭后的细胞液氮
研磨 20 min，至细粉状，称取 50 mg 于 1.5 mL 离心
管中用于小分子代谢物的提取，每个取样点取 5 个
平行［17］。
1.2.2.2 珠磨法细胞破碎 将含有 50 mg 淬灭后细
胞的离心管中加入 1.5 g 玻璃微晶，再加入 1 mL 预
冷的提取液，混匀后珠磨处理 1-3 个循环（每个循
环 48 s），液氮冻融，每次冻 2 min，重复 4 次，4℃、
10 000 r/min 离心 5 min，保留上清于新的离心管中。
1.2.2.3 胞内小分子提取 液氮研磨后的样品加入
1 mL 预冷的提取溶剂（60% 冷乙醇溶液 ；4∶6 的
1 mmol/L 富马酸水溶液 ：甲醇 ；2∶2∶1（V/V）的
氯仿∶乙醇∶水 ；60% 沸乙醇［12，18］；60% 冷甲醇
溶液），涡旋 1 min 至匀，液氮冻融，每次冻 2 min，
重复 4 次［19］。热乙醇法提取 ：60% 乙醇置于沸水浴
10 min，取 1 mL 加入含有 50 mg 菌体的 EP 管中沸
水浴 5 min。细胞提取液 10 000 r/min 离心 5 min，保
留上清于新的离心管中。
1.2.3 样品的衍生化 将上述提取液冷冻干燥后，
加 50 μL 甲氧基铵盐酸盐 / 吡啶溶液（20 mg/mL），
充分溶解样品，置于 40℃水浴中，反应 80 min ；（2）
加 80 μL N-甲基 -N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，混
合均匀，置于 40℃水浴中，反应 80 min ；（3）将衍
生后的样品 10 000 r/min 离心 5 min ；取上清液 100
μL 加入进样瓶中，并编号，于室温放置 2 h，准备
进行 GC-MS 检测。
1.2.4 GC/MS 检 测 GC 条 件［17］：Agilent HP5 30
m×0.25 mm×0.25 μm 毛 细 管 柱 ；进 样 口 温 度 ：
280℃，升温程序 ：初始温度 70℃保持 2 min，以
5℃ /min 程序升温至 290℃保持 5 min ；载气 ：高纯
氦气，恒压模式 91 kPa，流速 1 mL/min ；进样量 1
μL ；柱后分流比 10∶1。
MS 条 件［17］：接 口 温 度 ：280 ℃ ；电 离 方 式 ：
EI ；电离方式 ：电子轰击电离（EI+）；离子源温度 ：
250℃ ；电子轰击能量 ：70 eV ；电子电流 ：40 μA ；
扫描质量范围 ：50-800 m/z。
1.2.5 数据处理 将 GC/MS 数据导入 MSD 增强型
2015,31(5) 63郭刚等：基于 GC-MS 的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立
化学工作站，提取离子峰并用 NIST08 数据库进行比
对进行定性，通过将所有的离子峰与内标物质的峰
面积相比使数据归一化，再对数据进行中心化后导
入 SIMCA 软件进行 PCA 分析［7，20］。
2 结果
2.1 菌体清洗
代谢物组研究过程中样品的制备是非常重要的，
胞内代谢物组的研究过程中必须清洗菌体去除培养
基成分。但细胞清洗过程中也存在胞内物质泄漏。
因此选择合适的清洗剂和恰当的清洗次数非常重要。
为了确定最恰当的清洗次数，GC-MS 测定发酵液上
清和 4 步清洗后的上清液。结果发现 3 步清洗可以
将胞外代谢物和培养基成分完全去除（图 1）。
别体现在 17 种物质的提取效率上，对比这 17 种物
质相对峰值（图 3）可知，珠磨法提取的物质相对
量远大于液氮研磨法。
代谢物组研究过程中胞内物质的提取过程严重
影响代谢分析的结果，为了研究珠磨法破壁效率，
GC/MS 测定珠磨 1-3 个循环的胞内提取物并进行
PCA 分析，将引起差异的主要物质进行比较，结果
（图 4）发现随着珠磨次数的增加，提取的胞内物质
的量增加，但到 3 个循环时有部分物质的提取量下
降，因此确定珠磨两个循环为最优。
2.3 胞内代谢提取
代谢物组数据分析过程中，需要定性和定量尽
可能多的物质来全面的描述代谢途径、代谢调节及
描述机制。阿维链霉菌胞内代谢产物 GC/MS 可检测
到的多达 300 多种，而这些物质在同一溶剂中的溶
解度不同。合适的萃提溶剂要求在提取过程中不能
对代谢物进行物理或者化学修饰，而且要尽可能多
的提取代谢物。因此进行试验和比较不同的提取剂
对阿维链霉菌的胞内代谢产物的提取是非常必要的。
试验中比较的 5 种溶剂，见表 1。
表 1 提取液成分
编号 溶剂组成
A 60% 冷乙醇溶液
B 1 mmol/L 富马酸水溶液 ：甲醇 =4∶6
C 氯仿∶乙醇∶水 = 2∶2∶1
D 60%沸乙醇
E 60% 冷甲醇
通过以上各种提取溶剂对阿维链霉菌代谢物的
比较（图 5）可以明显看出提取液 C 除了有 3 个相
对峰值（乳酸、脯氨酸、亮氨酸）低于 60% 冷甲醇
提取，其他峰值均明显高于对照，因此 2∶2∶1（V/V）
的氯仿∶乙醇∶水更适合作为阿维链霉菌胞内代谢
物组的提取溶剂。
2.4 阿维链霉菌代谢物组分析
在建立了链霉菌代谢物组学研究方法后，为解
析阿维链霉菌高产阿维菌素的机制，本研究对阿维
链霉菌野生型（WT）和高产型（9-39）代谢物组进
行了分析。
通过得分图（图 6-A）可以看出 WT 和 9-39 胞
Propanoic acid
Propanediol
Lactic acid
Oxalic acid
Malonic acid
Citramalic acid
Glutaric acid
Inositol
Mannitol
Sucrose
Maltose
100␵⍇᭸⦷% 9080706050
40
30
20
10
0
M W1 W2␵⍇↕僔 W3 W4
图 1 菌体清洗效率
2.2 细胞破碎
阿维链霉菌属于革兰氏阳性菌，使用有机溶剂
无法将其细胞壁有效破碎，因此在提取胞内物质之
前需要通过必要的机械方法来破坏细胞壁。液氮研
磨法和珠磨法是常用的细胞膜破碎方法，这两种方
法可以在不引入其他物质的前提下达到破碎的目的。
本研究分别利用这两种破壁方法提取胞内物质，
GC-MS 检测胞内成分，数据经过归一化和标准化导
入 SIMCA 进行 PCA 分析（图 2）。从得分图（图 2-A）
中可以看出液氮研磨法和珠磨法提取的胞内物质存
在明显的差别，液氮研磨法在得分图中比较分散，
说明液氮研磨法组内误差较大，这主要是由于人工
研磨样品不均一所致。从得分图（图 2-B）对应的
载荷图中可以看出，液氮研磨法和珠磨法主要的差
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.564
内代谢物存在明显的代谢差异。从载荷图（图 6-B）
可知，阿维链霉菌培养到第 10 天，9-39 与 WT 胞
内物质的主要差异来自糖类和部分氨基酸，9-39 胞
内半乳糖、葡萄糖和纤维二糖水平高于 WT，这与
蛋白组学研究结果相一致［21］。此外，蛋白组学研究
发现阿维链霉菌高产菌株的糖代谢相关酶表达量高
于野生菌株。本研究中高产菌株氨基酸类中的亮氨
酸、丙氨酸、丝氨酸与赖氨酸代谢水平较高，这也
L-Proline
L-Isoleucine
Uknown
L-Valine
Succinic Acid
L-Asparagine
L-Alanine
L-Lysine
Lactic acid
Glycine Inositol
L-Serine
Ghltamine
D-Turanose
Hexadecanoic acid
Oxalic acid
0.0
-8
-10 0
0
10
ground in liquid niterogen
ground bead cell disrnption
-7
-5
-6
-4
-3
-2
-1
-1 0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
-0.0
-0.0
-0.0-0
.0
-0.0
-0.0
-0.0
-0.0
-0.0
-0.0
-0.0
-0.0
-0.0
0 1 2 3
2
B
A
图 2 液氮研磨法与珠磨法细胞破碎提取物 PCA 分析得分图（A）和载荷图（B）
10
9
8
ground in liquid nitrogen
glass bead cell disruption
7
6
5
4
3
2
1
0
Ma
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图 3 液氮研磨法和珠磨法细胞壁破碎效率的比较
400
300
200
250
350
100
I-V
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150
%
0
C
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1Cycle
2Cycle
3Cycle
图 4 珠磨循环对胞内物质提取效率的影响
2015,31(5) 65郭刚等：基于 GC-MS 的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立
与蛋白组学相关结果一致［21］。
3 讨论
阿维链霉菌作为阿维菌素的生产菌株，其代谢
工程与合成生物学改造对进一步提高阿维菌素产量
具有重要意义。在改造过程中，代谢物组学作为一
种系统的研究手段，在目的产物相关代谢物的发现
中具有无与伦比的优势。近年来，在微生物代谢物
组学研究方面取得了巨大的进步，但尚无阿维链霉
菌代谢组学研究方法的文献报道，而现存的代谢物
组学研究方法中没有一种可以适用于所有微生物。
这就要求人们在制备准确反映细胞生理状态的代谢
物时，不能采用与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等相同
的方法。所以本研究主要对阿维链霉菌代谢物样品
制备步骤进行了系统优化。
细胞清洗能够去除培养基和胞外代谢物对胞内
代谢物组的影响。由于胞外代谢物和培养基成分复
杂，清洗不完整会严重影响胞内代谢物组的测定，
而清洗过度会导致细胞壁受损严重，胞内代谢物大
量渗漏，致使获得的代谢物数目显著减少。通过研
究发现，细胞清洗 3 次能够在不导致细胞破裂的情
况下完全去除培养基和胞外物质。液氮反复冻融是
提取胞内代谢物的主要方法，但对于具有较厚细胞
壁的革兰氏阳性细菌及真菌，反复冻融法通常不能
充分提取其胞内代谢物。为了解决这一问题，本实
验室研究液氮研磨和珠磨法这两种破碎细胞壁的方
法发现，珠磨法比液氮研磨法能够有效地破碎细胞
壁。此外，研究还发现珠磨两个循环可以充分提取
胞内物质。代谢物组数据分析过程中，需要定性和
定量尽可能多的物质来全面的描述代谢途径、代谢
调节及描述机制。由于代谢物在不同的提取溶剂
中的提取效率不同，本研究比较了 5 种提取溶剂的
提取效率，结果发现用甲醇∶氯仿∶水 = 2∶2∶1
（V/V）的比例提取的胞内的代谢物质最全面，而且
提取含量最高。通过对各样品制备环节进行比较优
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0.5
1.5
2.5
3.5
A 4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0.5
1.5
2.5
3.5
B
4.0
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1.0
0.0
0.5
1.5
2.5
3.5
C 4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0.5
1.5
2.5
3.5
D
图 5 不同提取溶剂对提取效果的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.566
化，最终得到了最适合阿维链霉菌代谢物分析样品
的制备方法。
4 结论
利用本试验室建立的阿维链霉菌代谢物组学样
品制备方法，对阿维菌素高产菌株（9-39）和野生
菌株（WT）代谢物相对强度进行了分析，高产菌株
的糖代谢和部分氨基酸代谢旺盛，这与蛋白组学研
究的结果相吻合。因此本试验室建立的代谢物提取
分析方法适用于阿维链霉菌代谢物组研究。
参 考 文 献
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Suerose
Mannose
Vnline Glocose
Leucins
Phosphats
Alanine
Lysine
Scrins
Gheopynanose
Galactose
Gbotamine
Succinie Acid Cellobiose
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
-0.0-
0.
0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
0 1 2
2
B
-5
-10 0
0
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-4
-3
-2
-1
-1 0
1
2
3
4
5
A
图 6 阿维链霉菌胞内代谢物 PCA 分析得分图（A）和载荷图（B）
2015,31(5) 67郭刚等：基于 GC-MS 的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立
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（责任编辑 狄艳红）