全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
从虎皮鹦鹉粪便中分离产细菌素
菌株及其细菌素特性分析
陈新练 陈仪本
( 1中国科学院南海海洋研究所,广州 510301; 2广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室
广东省微生物应用新技术公共实验室,广州 510070; 3中国科学院研究生院,北京 100049)
摘 要: 从虎皮鹦鹉 (M elop sittacus undula tus )的粪便中分离得到一株产广谱细菌素的菌株, 其细菌素产物对革兰氏阳性
和阴性细菌均有较强抑制作用。经形态学、生理生化反应和 16S rDNA分子方法鉴定, 该菌株初步鉴定为干酪乳杆菌。用硫
酸铵分级沉淀得到的细菌素粗提物,作温度、pH 值、蛋白酶的敏感性测定, 结果显示该细菌素经 100 处理 10 m in抑菌活性不
变, 当 pH 40时, 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别达到 9906% 和 86 14% , 并且对多种蛋白酶表现出敏感性。与
N isin标准品的抑菌效价对比, 得到粗提物的效价为 20487 IU /mL。
关键词: 细菌素 虎皮鹦鹉 干酪乳杆菌 抑菌试验 抑菌效价
Characteristics of Bacteriocin and Bacteriocinproducing Bacteria
Isolated fromMelopsittacus undulates! Excrem ent
Chen X inlian Chen Y iben
(
1
South China Sea Institute of O ceanology, Guangzhou 510301;
2
Guangdong ProvincialK ey Laboratory of M icrobialCulture
Collection and App lication, Guangdong ProvincialK ey Laboratory of Applied M icrobiology, Guangdong Institute
of M icrobiology, Guangzhou 510070;
3
Graduate University of ChineseA cademy of Sciences, Beijing 100049)
Abstrac:t A stra in o f bacter ia wh ich can produces a bro adspectrum bacterioc in w as iso lated from the exc rement of theM elop sitta
cus undu lates. Its product could inh ibit not only g rampositive bacter ia but a lso gramnega tive bacte ria efficiently. De tecting its appea r
ance, physio log ical and biochem ical character istics and ana ly zing 16S rDNA gene sequence homo logy, the stra in of bacteria w as identi
fied as Lactobacillus casei. The sensitiv ity o f rough bacter ioc in to tem pera ture, pH and pro tease w as studied pre lim inar ily. The resu lts
show ed that inh ibitive rate o f the rough bacter ioc in toE scher ichia co li and S taphy lococcus aureu sw as 99 06% and 8614% , respective
ly, when the pH is 40. Incubating fo r 10 m in a t 100 , its activ ity was still not affec ted. The bacter ioc in show ed sensitiv ity to severa l
proteases. Compar ing w ith the N isin standa rd product! s po tency, the potency o f the rough bacterioc in w as 204 87 IU /mL.
Key words: Bacter ioc in M elop sittacus undulates Lactobacillus casei Antibacter ia l exper im ent Inh ib itive po tency
收稿日期: 20100201
基金项目:科技部农业科技成果转化资金项目 ( 2008GB2E000233) ,广东省科技计划项目 ( 2008A010500005 )
作者简介:陈新练,男,硕士研究生,研究方向:微生物污染与防治; Em ai:l chenx in lian@ 126. com
通讯作者:陈仪本,男,硕士,研究员,研究方向:霉腐微生物防治以及食品保鲜与深加工; Em ai:l cyiben@ 21 cn. com
细菌素 ( bacterioc in)是某些细菌在代谢过程中
通过核糖体产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或
蛋白质复合物,一般只对亲缘关系较近的细菌有毒
害作用, 产生菌对其产生的细菌素具自身免疫
性 [ 1]。细菌素本身具有无毒、无抗药性、无残留等
特性。
目前研究最多的产细菌素菌株是乳酸菌, 其分
离生境有乳制品、发酵食品 [ 2, 3 ]以及动物胃肠道等。
其中,有从猪、牛、鸡等动物胃肠道中分离到产细菌
素乳酸菌已有不少先例 [ 4] , 但从鹦鹉类胃肠道内分
离到产细菌素的菌株还未见报道。虎皮鹦鹉在分类
上属于鸟纲 ( Aves)、鹦形目 ( Psittaciformes)、鹦鹉科
( Psittac idae)、纽澳鹦鹉族,主要以水果、坚果、草类
植物的种子、植被、花朵、植物嫩芽、昆虫以及其幼虫
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
等为食。本研究是对从虎皮鹦鹉的新鲜粪便中分离
到的一株产细菌素菌株初步的鉴定及其所产生的细
菌素进行几项基本特性的研究。
1 材料和方法
11 样品的采集和处理
虎皮鹦鹉新鲜粪便样品采自广州市白云山天然
鸟笼。
12 菌种
大肠杆菌 (E scherichia coli ) , 金黄色葡萄球菌
(S taphy loccocus aureus), 表皮葡萄球菌 ( S. ep iderm i
d is) ,沙门伤寒氏菌 ( Salmonella typhi ) , 铜绿假单胞
菌 (P seudomonas aerug inosa ) , 枯草芽孢杆菌 (Bacil
lus subtilis) ,藤黄微球菌 (M icrococcus luteu s),黄曲霉
(Asperg illus f lavus ) , 黑曲霉 ( A. niger ) , 土曲霉 ( A.
terreus) ,绿色木霉 (T richoderma viride ) ,桔青霉 (P en
icillium citrinum ),绳状青霉 (P. funiculosum ),腊叶芽
枝菌 (C ladosporium herbarum )球毛壳霉 ( Chaetom ium
g lobasum ) ,酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae ) ,以上
供试菌种均为广东省微生物研究所菌种保藏中心
提供。
13 试验试剂
蛋白酶 k,胰蛋白酶,木瓜蛋白酶, 脂肪酶等酶
制剂。 (国药集团化学试剂有限公司 ); 001 mo l /L
HC ,l N isin标准品 ( 106 IU /g ) ( S igma公司 ) ; 其余培
养基配剂及试剂均由分析纯。
14 产细菌素菌株的筛选和鉴定
141 产细菌素菌株初筛和复筛 按田宇等的滤
纸片法 [ 5] , 利用 2% CaCO3的 MRS琼脂培养基进行
初步筛选。选择初筛过程中有明显抑菌圈的菌株,
通过管碟法 [ 6] , 及参照胡淑敏等 [ 7]的方法, 用相对
应的酶处理,进行有机酸、过氧化氢、脂肪类及淀粉
多糖类抑菌物质的排除试验。
142 菌株的分子生物学及生理生化鉴定 按
∀精编分子生物学试验指南 #[ 8]提取菌株的总 DNA。
采用细菌 16S rDNA通用引物扩增菌株的 16S rDNA
序列。扩增结果由上海英骏生物技术有限公司进行
全长测序。得到的测序序列通过 NCB I ( http: //
www. ncb.i n lm. n ih. gov / )基因库进行序列比对。依
照 16S rDNA序列比对结果以及 ∀伯杰氏细菌鉴定
手册# (第八版 )对所筛菌株作生理生化鉴定 [ 9]。
15 细菌素基本特性的研究
151 细菌素的粗提 用硫酸铵分级沉淀法 [ 10]
对菌体培养液进行粗提。 15 000 r /m in高速冷冻离
心, 并按 100 mL发酵上清用 4 mL 001 mo l /L
HC l缓冲液的比例把沉淀重新溶解, - 20 保存
备用。
152 粗提细菌素抗菌谱的检测 用管碟法对材
料中 7种细菌和 9种真菌做抑菌试验, 001 mo l/L
HC l作为对照。
153 细菌素温度、蛋白酶、pH敏感性试验 把
粗提物分别于 20 、40 、60 、80 和 100 水浴
加热以及 121 高压作用 10 m in。用未经温度处理
的粗提物做对照用管碟法做抑菌试验;把细菌素粗
提物 pH调至 7, 然后用终浓度为 1mg /mL的胰蛋白
酶、蛋白酶 k、木瓜蛋白酶于 37 处理粗提物 1 h,再
调回发酵 pH38,用管碟法做抑菌试验。把粗提物
pH调成 40、45∃∃ 65、70共 8个梯度, 再把两
种指示菌分别加到各梯度的 pH中, 使指示菌终浓
度为 106CFU /mL, 置于室温下作用 12 h, 同时把新
配制的 MRS液体培养基 pH 调成与粗提物相对应
的 8个梯度作为对照试验。离心去掉作用液, 用生
理盐水重悬后涂平板,计算菌落数。
154 用透射电镜观察细菌素粗提物处理后大肠
杆菌菌体细胞变化 用 1 mL 151方法所得到的
粗提物 (对照组用没有细菌发酵培养的 MRS液体培
养基粗提物处理 )作用于培养过夜的大肠杆菌, 于
室温下作用 12 h, 然后进行电镜观察。菌体终浓度
为 106CUF /mL。
155 N iSin标准物标准曲线的制作和粗提物效价
的测定 参照W olf[ 11]等及 Cabo等 [ 12]的方法进行。
精确称取 10 mg N isin标准品 ( 106 IU /g)溶于 001
mol /L HC l溶液中, 配成 103 IU /mL, 然后稀释成
10、5、25、1 IU /mL 4种效价的标准液。做出抑菌
圈直径与效价对数的标准曲线, 依据同批试验中
粗提物的抑菌圈直径, 得到细菌素粗提物的相对
效价。
2 结果
21 产细菌素菌株的筛选鉴定
211 筛选 从虎皮鹦鹉新鲜粪便中分离得到
173株菌, 通过酸对照试验确定了对照 pH 为 40。
186
2010年第 9期 陈新练等: 从虎皮鹦鹉粪便中分离产细菌素菌株及其细菌素特性分析
复筛后选出其中一株抑菌效果最好的菌株编号为
XL114进行以下试验。试验结果 (表 1)表明, 通过
钙溶圈筛选后的菌株有 8035%表现出酸抑制作
用, 由其他物质所产生的抑制作用占 1445%, 而产
细菌的候选菌株仅占 231%。
表 1 细菌素筛选结果
样品 初筛菌株 产酸菌株 排除酸作用后菌株
排除过氧
化氢菌株
排除淀粉类、脂类
物质作用后菌株 产细菌素候选菌株
虎皮鹦鹉粪便 173 139 25 5 4 4
212 XL114菌株 16S rDNA PCR产物电泳检测 从
图 1可以看出,成功扩增到了一条 1 500 bp左右的
16S rDNA特征性条带。
213 产细菌素菌株 16S rDNA PCR产物测序 通
过 NCB I基因库进行序列比对 (图 2 ), 同源性达到
99% - 100%的前 10株菌株均为干酪乳杆菌和副干
酪乳杆菌。
214 生理生化试验 生理生化试验结果如表 2
所示。依据 16S rDNA PCR产物测序结果的比对结
果,同时结合 ∀伯杰氏细菌鉴定手册 # (第 8版 )所做
的生理生化试验将 XL114菌株初步鉴定为干酪乳
杆菌。
M. M arker; 1. PCR产物样品
图 1 XL114菌株 16S rDNA PCR产物电泳检测
1 gaacgagt tc tcgttgatga tcggtgcttg caccgagat t caacatggaa cgagtggcgg 781 atgaatgcta ggtgt tggag ggtttccgcc ct tcagtgcc gcagctaacg cat taagcat
61 acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc t taagtgggg gataacattt ggaaacagat 841 tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca
121 gctaataccg catagatcca agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat 901 agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat
181 cgctt ttgga tggacccgcg gcgtattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg 961 ct tttgatca cctgagagat caggt ttccc cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg
241 atgatacgta gccgaactga gaggttgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa 1021 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta
301 ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac 1081 tgactagttg ccagcattta gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg
361 gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg 1141 aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca
421 gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc 1201 atggatggta caacgagt tg cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa agccattctc
481 cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga 1261 agt tcggact gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat
541 gcgcaggcgg ttttt taagt ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg 1321 cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga
601 gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg 1381 gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac cctt ttaggg agcgagccgt ctaaggtggg
661 cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg 1441 acaaatgat
721 aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg
图 2 XL114菌株 16S rDNA序列
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
表 2 部分生化试验结果
试验名称 试验结果
菌体和菌落观察 菌体呈长杆状,有连成细丝趋势,菌落 呈乳白色,小而边缘光滑
芽孢检测 无芽孢
革兰氏染色 24h G+ , 48 hG-
接触酶 阴性
氧化酶 阴性
葡萄糖发酵 发酵不产气
葡萄糖酸钠发酵 发酵产气
淀粉试验 不发酵
糖原试验 不发酵
半固体穿刺培养 只沿穿刺线生长,边缘清晰
温度试验 阴性
温度试验为 72 水浴加热维持 40m in后菌株不生长 (无活菌 )
22 细菌素特性的初步研究
221 细菌素粗提及盐析曲线 盐析沉淀后, 通过
管碟法抑菌试验确定第 4、5、6、7次有抑菌作用,而
且第 5次抑菌活性最强, 抑制大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌 (指示菌浓度为 107 CFU /mL)的抑菌圈直径
分别达到 1927mm和 1822mm。因而本试验所用
的细菌素粗提物样本均按照 2% - 32%饱和硫酸铵
浓度进行盐析沉淀获取 (图 3)。
图 3 细菌素粗提过程的盐析曲线
222 抑菌效果的研究 从抑菌谱结果 (表 3,图
4)来看,该细菌素只对细菌表现出抑菌活性, 而对
真菌无抑菌作用, 表现出了典型的细菌素抑菌谱特
性。另外,此细菌素粗提物对枯草芽孢杆菌表现出
很强的抑菌活性,这对化妆品、食品等生产中的防霉
防腐方面具有潜在的良好应用前景, 本试验室正在
进一步的研究中。
粗提物处理指示菌后的透射电子显微镜观察结
果如图 5所示。由图 5可以看出, 处理后的菌体主
要有 3大变化:纤毛、鞭毛脱落; 菌体外部出现破裂
现象;菌体表面似有沉积物。更详细的研究有待进
一步深入。
N isin标准物标准曲线及粗提物效价测定结果
如图 6所示。由图 6可以看出, 在所选择的效价范
围内, N isin效价对数与抑菌圈直径具有良好的线性
关系,适用于细菌素效价的测定。依据以上所得出
的公式及粗提物抑菌直径 ( 1859mm),算出的粗提
物相对效价为 20487 IU /mL。
表 3 粗提物对部分微生物的抑菌效果
指示菌 抑菌圈直径 ( mm )
大肠杆菌 1885
金黄色葡萄球菌 1730
表皮葡萄球菌 1484
伤寒沙门氏菌 1662
绿脓杆菌 1738
枯草芽孢杆菌 1870
藤黄微球菌 1786
黄曲霉 -
绿色木霉 -
黑曲霉 -
桔青霉 -
绳状青霉 -
球毛壳霉 -
腊叶芽枝菌 -
土曲霉 -
白假丝酵母 -
试验菌菌液含菌量为 107 CFU /mL; % - &表示无抑菌圈直径小
于 5 mm
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2010年第 9期 陈新练等: 从虎皮鹦鹉粪便中分离产细菌素菌株及其细菌素特性分析
A、B、C.分别为第 5、6、7次盐析沉淀; D.对照
图 4 粗提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用
A.对照菌体; B, C, D.均为处理后菌体
图 5 细菌素粗提物处理大肠杆菌后的透射电镜照片
图 6 N isin标准物效价标准曲线图
223 粗提物特性 细菌素温度敏感性检测结果
如图 7所示。粗提物 pH敏感性试验结果如图 8所
示。粗提物蛋白酶敏感性结果如表 4所示。从图 7
中可以看出, 细菌素粗提物在温度为 20 - 100 范
围内处理 10 m in后抑菌活性变化不大,经过 121
处理 10 m in后, 活性下降较大但仍然保持较强活
性。说明此细菌素具有较强的耐热特性,可望在应
用中承受产品加工等过程中的常规加热处理。从图
8中可以看出, 细菌素粗提在酸性条件下对两种指
示菌具有较强的抑菌作用, 抑菌 pH 范围分别为
40- 60和 40- 65, pH为 4- 5之间均有一个急
剧下降的区域, 说明 pH大于 5后粗提物抑菌活性
急剧下降。粗提物在对照 pH为 4时, 对两种指示
菌的抑菌率分别达到 9906%和 8614%。表 4则
表明经过 3种不同的蛋白酶处理后, 粗提物的活性
几乎完全丧失。说明粗提物对此 3种蛋白酶表现出
高度敏感性,间接表明抑菌物质极可能是蛋白质类
物质。
图 7 细菌素粗提物温度敏感性
图 8 细菌素粗提物 pH敏感性
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
表 4 细菌素蛋白酶敏感性试验
指示菌 E. coli S. aureu s
抑菌圈 (不含牛津杯内径 mm )
粗提物 1082 902
蛋白酶 k 057 032
木瓜蛋白酶 117 086
胰蛋白酶 096 003
3 讨论和结论
本研究从虎皮鹦鹉新鲜粪便中分离得到一株产
广谱细菌素的干酪乳杆菌, 并对其所产生的细菌素
进行了初步分离,确定此细菌素分离的最佳硫酸铵
饱和度为 32% - 42%。对温度、pH、蛋白酶敏感性
的研究结果表明粗提物在 pH为 4时对大肠杆菌和
金黄色葡萄球菌的抑菌率分别达到 9906% 和
8614%, 100 高温处理 10 m in抑菌效果不变, 对
多种蛋白酶敏感。而电镜观察则显示处理菌体纤毛
鞭毛脱落以及菌体破裂等现象,证明细菌素粗提物
确实起到作用。以 N isin作标准曲线, 得出粗提细
菌素的抑菌效价为 20487 IU /mL。
目前细菌素产生菌株的分离生境主要集中在传
统的乳制品、蔬菜发酵食品等常见生境。本研究通
过从各种鸟禽类动物胃肠道中进行了分离尝试,最
终从虎皮鹦鹉胃肠道中分离得到一株抗性较强的广
谱细菌素产生菌株, 为细菌素产生菌株的分离生境
提供了参考方向。
本研究获得的细菌素粗提物在 100 高温作用
10 m in抗性不变, 而且 121 高温作用 10m in, 仍然
具有较强的抗性,同时对蛋白酶敏感,可以被动物体
内的酶所降解,显示出其耐热性及安全性高的特点,
这些结果都显示其开发成有效安全的生物防腐剂的
可能。同时,由于一般蛋白质类物质对高温比较敏
感, 此细菌素表现出对高温的抗性,提示其有可能为
短肽类物质。
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