全 文 ：2003年 1月 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) Jan. 2003第 34卷第 1期 Acta Scientiarum Naturalium Univ ersi tati s NeiM ongol Vol. 34 No. 1
　　文章编号: 1000- 1638( 2003) 01-0058-04
转座子 Tn5对葡萄根癌病生防菌 M I15的诱变
董江丽 ,张鹤龄 ,朱景奇
(内蒙古大学生命科学学院 ,内蒙古 呼和浩特 010021)
摘要: 以含自杀性质粒 pMO75: : Tn5的铜绿假单胞菌 PAO1826和含自杀性质粒
pSUP2021: : Tn5的大肠杆菌 S17-1为供体菌 ,以葡萄根癌病生防菌 MI15为受体菌 ,进行接合
杂交 .当供体菌和受体菌菌体数量比例为 1∶ 1和 1∶ 5时可以产生转移接合子 ,而当菌体数量
比例为 5∶ 1时不能产生转移接合子 .共筛选了 117株转移接合子 ,获得了 3株不产细菌素的
M I15突变株 ,用光敏生物素标记的 Tn5DNA探针与突变株染色体 DN A进行斑点杂交 , 3株
突变株均呈阳性反应 ,证明 Tn5转座子已插入到 M I15菌株的染色体上引起插入突变并抑制
了细菌素的产生 .
关键词: 葡萄根癌病 ;细菌素 ;转座子
中图分类号: Q939. 92　　文献标识码: A
　　葡萄根癌病是由根癌土壤杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens )侵染引起的一种重要植物病害 ,常造
成树势严重衰弱 ,品质降低 ,大幅度减产减收 ,甚至全园毁灭 ,其有效防治具有重要经济意义〔1〕 .
1972年 ,澳大利亚学者 Allen Ker r报道了他从桃树园土壤中分离的一个产细菌素菌株 K84,对
于植物根癌病的生物防治效果十分显著 .但是 K84菌株只对含胭脂碱型 Ti质粒的生物Ⅰ 型和生物
Ⅱ型根癌土壤杆菌有抑制作用 ,而对主要由含章鱼碱型 Ti质粒的生物Ⅲ型根癌土壤杆菌引起的葡萄
根癌病无防治作用〔 2〕 .国内外曾分离出一些能产生细菌素的抑制生物Ⅲ型根癌土壤杆菌的菌株〔3～ 5〕 ,
但是田间生物防治葡萄根癌病效果不理想 . 1990年 ,谢雪梅等从葡萄园土壤中分离到一株生物Ⅰ 型
放射土壤杆菌 ( Agrobacterium radiobacter ) M I15,该菌株能抑制 90%以上不同类型的葡萄根癌病菌
株的生长和致癌作用 ,经室内外防治试验表明 ,它是葡萄根癌病最理想的生物防治菌株〔6〕 .
关于放射土壤杆菌防治根癌病的机理 ,国外对 K84菌株进行了深入研究〔 7, 8〕 . K84菌株能产生细
菌素 A84,其成分为腺嘌呤脱氧阿拉伯糖苷氨基磷酸盐 ,属核苷酸类似物的一种小分子 ,由质粒
pAgK84( 47. 7kb )编码 , K84通过影响土壤杆菌的高能运输系统的正常运行、干扰细胞的主动吸收、
干扰 AT P酶的作用、抑制 DNA的合成等来达到防治根癌病的目的 .但是致病菌对 A84的敏感性是
决定 K84菌株生物防治的先决条件 ,现已证明 ,致病菌控制对 A84敏感性的基因在 Ti质粒上 ,并且
只有胭脂碱型 Ti质粒对 A84敏感 .
M I15菌株的抑菌作用与根癌土壤杆菌的寄主、杆菌的生物型、质粒类型有关 ,即来自葡萄的大
部分生物Ⅲ、Ⅰ 、Ⅱ型的菌株 ,其质粒类型为章鱼碱、胭脂碱型 ,均能被 M I15抑制 ,而来自其它寄主的
生物Ⅰ 、Ⅱ型 ,质粒类型为胭脂碱的大部分菌株 ,不能被 M I15抑制 . M I15菌株经 37℃高温连续传代
去除质粒 ,结果仍能产生细菌素 ,推断编码细菌素的基因可能在染色体上 . M I15菌株产生的细菌素
对蛋白酶不敏感 ,在 260nm和 280nm均无紫外吸收峰 ,其理化性质与 A84不同 .深入研究 M I15菌株
产生的细菌素的抑菌机理、基因定位对于防治植物根癌病具有重要意义 .
收稿日期: 2002-03-06
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39760005)
作者简介: 董江丽 ( 1971～ ) ,女 ,内蒙古包头人 ,讲师 ,中国农业大学 2002级博士研究生 .
1　材料和方法
1. 1　供试菌株
葡萄根癌病生防菌株 M I15,致病菌株 M I3-2,由内蒙古农业科学院园艺研究所谢雪梅提供 ,由本
实验室保存 .
供体菌株铜绿假单胞菌 ( Pseudomonas aeruginosa ) PAO1826 /pMO75: : Tn5和 E. coli S17- 1 /
pSU P2021: : Tn5由中国农业科学院植物保护研究所何礼远教授惠赠 ,由本实验室保存 .质粒 pMO75
携带羧苄青霉素抗性基因 ,质粒 pSU P2021携带氨苄青霉素抗性基因 ,转座子 Tn5携带卡那霉素抗
性基因 .
1. 2　培养基
MW培养基 ,用于培养生防菌 M I15、致病菌 M I3-2及测定 M I15抑菌活性 .其成分为: 1000 ml
培养基中含有甘露醇 10g、 NaNO3 5g、 KH2 PO4 0. 3g、 NaCl0. 2g、 Mg SO4· 7H2O 0. 1g、生物素 100μg、
Fe-EDTA( 0. 01M )溶液 2 ml( pH7. 0) .固体 MW培养基需加入琼脂 15g , 0. 1%结晶紫溶液 2 ml.
LB培养基 ,用于培养供体菌 ,按常规方法配制 .
1. 3　方法
1. 3. 1　筛选利福平抗性 ( Rifr )卡那霉素敏感 ( Kans )的 M I15菌株
用圆滤纸片法在 MW平皿上筛选自发产生的 RifrM I15菌株 ,进一步在 MW平皿 ( Kan50μg /
m l)上鉴定其是否具有 Kan抗性 ,选取 Rifr Kans的 M I15菌株测定抑菌活性 .用接种环挑取一环葡萄
根癌病致病菌株 M I3-2,经蒸馏水稀释 100倍后 ,取 100μl涂布在 MW固体平皿上 .平皿上放置 2～ 4
个牛津小杯 , Ri fr Kans的 M I15菌株经 MW培养液 28℃水浴振荡培养 32 h后 , 8000 r /min离心 5
min,取上清液 0. 3 ml加入牛津小杯 , 28℃培养 48 h,选取抑菌圈直径大于 30 mm的菌株作为受体
菌株 .
1. 3. 2　筛选利福平敏感 ( Rifs )的供体菌株
在 LB固体平皿上选取 Kanr Rifs的含 Tn5转座子的 E. col i和铜绿假单胞菌菌株作为供体菌株 .
1. 3. 3　 Tn5转座子诱变
供体菌株 E. col i和铜绿假单胞菌用 LB培养液 ( Kan50μg /m l) 37℃分别培养 12 h和 24 h,受体
菌 M I15用 MW培养液 ( Rif50μg /m l ) 28℃培养 30 h.取对数生长期的供体菌和受体菌按 1∶ 1、
1∶ 5、 5∶ 1分别混合于微量离心管中 .取混合液 0. 2 m l涂布在不含抗生素的 MW平皿上 , 28℃培养
15 h. MW平皿上长出一层菌膜 ,用接种环刮取适量菌体转移到生理盐水中 , 10倍稀释后按每皿 0. 2
m l涂布在 MW选择平板 ( Kan30μg /m l, Rif30μg /ml)上 , 28℃培养 36 h.选取单菌落测定抑菌活性 .
1. 3. 4　筛选不产细菌素的 M I15突变菌株
获得的转移接合子单菌落 ,按每皿 4个菌株点接在 MW平皿上 , 28℃培养 36 h,用喉头喷雾器
均匀喷洒经 100倍稀释的致病菌 M I3-2菌液 ,静置 1 h后 , 28℃倒置培养 48 h,测定抑菌圈大小 ,不
产生抑菌圈的转移接合子初步鉴定为 M I15细菌素插入突变株 .
1. 3. 5　 DN A-DNA分子杂交鉴定插入突变株
以光敏生物素标记的 Tn5DN A探针与 M I15插入突变株的染色体 DNA进行斑点杂交 ,可以进
一步证实 Tn5转座子插入到受体菌的染色体上 ,方法参见文献〔 9〕 .
2　结果与分析
2. 1　筛选 Rifr Kans的 M I15产细菌素菌株和 Kanr Rifs的供体菌株
在含抗生素的 MW平皿上 ,共获得 10株 Rifr Kans的 M I15菌株 ,对致病菌 M I3-2做抑菌活性测
定 ,选取抑菌圈直径最大 ( 32mm)的 M I15— 1# 菌株作为受体菌株 .
在含抗生素的 LB平皿上 ,选取 Kanr Rifs的 E. coli和铜绿假单胞菌菌株各一株作为供体菌株 .
59第 1期 董江丽等　转座子 Tn5对葡萄根癌病生防菌 M I15的诱变
2. 2　 Tn5转座子诱变及细菌素插入突变株的筛选
分别以 E. coli S17— 1 /pSU P2021: : Tn5和铜绿假单胞菌 PAO1826 /pMO75: : Tn5为供体菌 ,以
葡萄根癌病生防菌 M I15为受体菌 ,进行接合杂交 ,在含有 Kan和 Rif的 MW选择平皿上筛选转移
接合子 .因为供体菌为 Rifs ,受体菌为 Kans ,所以初步认为在选择平皿上生长的为重组后的转移接合
子 .共获得 117株转移接合子单菌落 ,其中 E. coli与 M I15产生接合子 68株 ,编号为 E1— E68, P.
aeruginosa与 M I15产生接合子 49株 ,编号为 P1— P49(表 1) .
表 1　供体菌与受体菌不同比例产生的转移接合子
Table 1　 Transconjugants at the donor and receptor cell number rat io 1∶ 1、 1∶ 5 and 5∶ 1
供体菌与受体菌菌体数量比例
1∶ 1 1∶ 5 5∶ 1
E . coli和 M I15产生接合子数目 (株 ) 40 28 0
P . aeruginosa和 MI15产生接合子数目 (株 ) 32 17 0
　　对 117株转移接合子分别测定抑菌活性 ,结果表明 ,有三株重组菌株不能抑制致病菌 M I3-2的
生长 ,编号分别为 E64、 E65、 P17(图 1) .实验证明 ,供体菌与受体菌按 1∶ 1比例混合产生转移接合子
的几率最大 .
图 1　转移接合子的抑菌活性测定
Fig . 1　 Inhibito ry activity of t ransconjugants to Agrobacterium tumefaciens M I3-2
左皿: M I15与大肠杆菌转移接合子 E63、 E64、 E65、 E66　右皿: M I15与铜绿假单胞菌转移接合子 P17、 P27、 P28、 P29
2. 3　插入突变株 DNA与 Tn5DN A杂交
插入突变株产生于 Tn5转座子的直接证据是在基因组中存在 Tn5DN A序列 ,为此我们提取了
突变株 E64、 E65、 P17的染色体 DNA,分别与光敏生物素标记的 Tn5DN A探针进行斑点杂交 ,均获
得了阳性结果 ,而正常的 M I15菌株染色体 DNA与探针杂交呈阴性反应 .进一步证明 Tn5转座子插
入到 M I15菌株的染色体上引起插入突变并抑制了细菌素的产生 .突变株的获得为用转座子标签技
术分离鉴定 M I15菌株产细菌素相关基因、阐明细菌素防治根癌病的机理打下了基础 .
3　结论与讨论
　　分离自葡萄园土壤的放射土壤杆菌 M I15菌株可以抑制来自葡萄的大部分生物Ⅲ、Ⅰ 、Ⅱ型根癌
土壤杆菌 ,而对来自其它寄主的根癌土壤杆菌以及其它革兰氏阳性及阴性细菌均无抑菌作用 ,可见其
抑菌作用有很强的特异性 . K84菌株可以有效防治多种植物的根癌病 ,但对葡萄根癌病无防治作用 .
研究表明 , M I15菌株产生的细菌素理化性质与 A84有本质区别 ,产素基因由染色体编码而非质粒编
码 .由此推断 , M I15菌株与 K84菌株抑菌机理可能完全不同 .分离 M I15菌株产细菌素基因对于揭示
细菌素的生物防治机制有重要意义 .
对转移接合子测定抑菌活性时 ,其抑菌作用常常不稳定 ,即不具抑菌作用的转移接合子经几次传
代后又表现出抑菌作用 .分析其原因 ,可能是因为插入 M I15菌株染色体的 Tn5转座子又转座到染色
60 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) 2003年
体的其它位点 ;也可能是 M I15菌株由多条途径控制细菌素的产生 , Tn5转座子插入使主要途径失
活 ,经几次传代后 ,其它补偿途径激活产生细菌素 .因此 ,需要分别选取抑菌作用稳定和不稳定的转移
接合子做细菌素基因定位实验 .
参考文献:
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Transposon Mutagenesis of Anti-g rapevine
Agrobacterium Radiobactor M I15
DONG Jiang-li , ZHANG He-ling , ZHU Jing-qi
(College of L ife Science ,N eiMongol University , Hohhot 010021, PRC )
　　 Abstract: Pseudomonas aeruginosa PAO1826 containing suicide plasmid pMO75: : Tn5 and E.
coli S17-1 containing suicide plasmid pSUP2021: : Tn5 w ere mated wi th Agrobacterium radiobacter
M I15 respectiv ely. The Kanr Rifr transconjugants were obtained at the donor and recepto r cell num-
ber ratio 1∶ 1 and 1∶ 5. But no t ransconjugants w ere obtained when the ratio w as 5∶ 1. Three mu-
tants disable to produce bacteriocin were screened from 117 conjugants M I15. Do t blo t assay s
show ed tha t three mutants ch romosome DN A were posi tiv ely hybridized w ith pho tobiotin labeled
Tn5 DN A probe. It indicated that Tn5 inserted into chromosome of three mutants.
Key words: g rape crow n gall; bacteriocin; t ransposon
61第 1期 董江丽等　转座子 Tn5对葡萄根癌病生防菌 M I15的诱变