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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
过量表达大叶补血草 LgNHX1 基因对
拟南芥耐盐性的影响
周玲玲 祝建波 王爱英
(石河子大学生命科学学院，石河子 832000)
摘 要: 利用植物表达载体 pCAMBIA1301 和农杆菌 GV3101 将 LgNHX1(全长 1 656 bp)基因在拟南芥中过量表达。在
含 30 mg /L潮霉素的培养基上筛选获得 LgNHX1 的纯合转化子，并对其进行了分子鉴定和耐盐性分析。结果显示，经 PCR和
RT-PCR鉴定，野生型植株(对照)没有出现扩增条带，而转基因株系有相应的扩增条带，表明 LgNHX1 的确已经整合到拟南芥
的基因组中，并已正常转录。在不同盐浓度处理下，转基因株系生长情况好于野生型对照;转基因植株地上部分和根的干重、
鲜重相对高于野生型对照，但差异没有达到显著水平;当盐浓度达到 150 － 200 mmol /L时，两个转基因株系的 Na +含量显著高
于野生型，K +含量极显著高于野生型。以上结果表明，过量表达 LgNHX1 基因可能增强了拟南芥将 Na +区隔化至液泡的能
力，提高了转基因拟南芥的耐盐能力。
关键词: LgNHX1 基因 液泡膜 Na + /H +逆向转运蛋白 拟南芥 耐盐性
Overexpressing LgNHX1 Gene Improved Salt
Tolerance of Arabidopsis thaliana
Zhou Lingling Zhu Jianbo Wang Aiying
(College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832000)
Abstract: In this research，LgNHX1 gene(1 656 bp)was inserted into plant vector pCAMBIA1301． The resulting plasmids were
mobilized to Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 used for plant transformation． The gene was introduced into Arabidopsis thaliana
(ecotype Columbia)by Agrobaterium tumefaciens-mediated transformation with floral-dipping method under the control of CaMV 35S
promoter． Transformants were selected for their ability to grow on medium containing hygromycin(30 mg /L)． Several homozygous lines
transformed with LgNHX1 gene were selected and used for further molecular and physiological determination． PCR analysis indicated
that LgNHX1 gene had been integrated into the transgenic plants genomes． RT-PCR analysis revealed the expression of LgNHX1 gene in
T3 plants of several non-segregation transgenic lines． Under different concentrations of NaCl treatment，the transgenic plants grew more
vigorously than wild-type plants． The fresh weight and the dry weight of the transgenic lines were higher than that of wild-type plants，
and transgenic plants showed a tendency to accumulate more Na + and K + under saline conditions than wild type plants． Summarily，
overexpressing of LgNHX1 gene improved salt tolerance of transgenic plants．
Key words: LgNHX1 gene Vacuolar Na + /H + antiporter Arabidopsis thaliana Salt tolerance
收稿日期:2011-03-01
基金项目:石河子大学高层次人才启动项目(RCZX200903) ，国家转基因专项(2008ZX08005-004)
作者简介:周玲玲，女，博士，副教授，研究方向:植物基因工程;E-mail:Linglingzh@ shzu． edu． cn
在盐胁迫环境中，植物细胞的离子均衡受到破
坏，尤其是胞质中过多的 Na +对植物细胞的代谢产
生毒害。植物获得耐盐能力的一个重要策略是建立
新的离子均衡。离子均衡涉及钠离子的吸收、外排、
区隔化和长距离转运。植物的耐盐往往要求地上部
分保持低 Na +、高 K +的状态，维持细胞质内低 Na +
状态最直接的方法是将 Na +区隔化到液泡中，Na +
区隔化对植物耐盐至关重要，而植物液泡膜 Na + /
H +逆向转运蛋白是植物细胞中 Na +区隔化至液泡
的关键基因，它能利用液泡膜 H + -ATPase 及 PPiase
2011 年第 9 期 周玲玲等:过量表达大叶补血草 LgNHX1 基因对拟南芥耐盐性的影响
泵 H +产生的驱动力，逆着 Na +浓度梯度，将胞质中
的 Na +区隔化进液泡中［1］。在多种植物中过量表
达液泡膜 Na + /H +逆向转运蛋白都明显提高了转基
因植物的耐盐性。本试验所研究的 LgNHX1 基因是
从盐生植物大叶补血草(Limonium gmelinii)cDNA
中克隆所得，它编码一个液泡膜 Na + /H +逆向转运
蛋白，主要负责 Na +的区隔化，将其转入拟南芥中，
通过探讨 LgNHX1 基因在拟南芥耐盐性方面所起的
作用，为进一步通过转基因方法有效提高农作物及
其它植物的耐盐性研究提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料 拟南芥(Arabidopsis thaliana)Co-
lumbia生态型，播种于育苗营养土 ∶ 蛭石 ∶ 珍珠岩
(5∶ 2∶ 2)的混合介质中，自来水每 3 d 浇一次，温度
为 18 － 22℃。
1． 1． 2 质粒载体及菌种 质粒载体 pCAMBIA1301，
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101 菌株为石
河子大学农业生物技术中心重点实验室提供。
1． 1． 3 酶及化学试剂 潮霉素溶液为 Sigma 公司
产品，浓度为 50 mg /L。卡那霉素购自上海生物工
程公司。Taq 酶、AMV、RNase Inhibitor、Trizol 试剂、
PCR引物合成均购自上海生物工程公司。其它化
学试剂均为国产或进口分析纯。
1． 1． 4 主要仪器设备 凝胶成像系统 Image Master
VDS Pharmacia Biotech，台式冷冻离心机 Eppendorf
德国 Biofuge公司，三恒电泳仪 FCP300 型北京六一
仪器厂，PCR 仪器 My CyclerTM thermal cycler 购自
Bio RAD 公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 植物的生长 拟南芥种子播种于盛满混合介
质的直径 7 cm的培养杯中，于 16 h光照，8 h 黑暗的
长日照条件下培养，以促进开花。当植株长至茎高约
3 cm时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长。
待腋生花序长出，其下部的花已有受粉现象出现时进
行转化，转化前，将已受粉的花以及果荚除掉。
1． 2． 2 菌液制备及渗透操作 挑取鉴定好的农杆
菌单克隆放于 20 mL含有 40 mg /L利福平、50 mg /L
卡那霉素的 LB液体培养基中，28℃，250 r /min 震荡
培养至 OD600为 0． 5左右。在转化前一天，转入 50 mL
同样的 LB 液体培养基中培养过夜，第 2 天，当菌液
OD600在 1． 2 － 1． 6 之间时取出，室温 5 000 r /min 离心
15 min，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基(蔗
糖 5%，Silwet L-77 200 μL/L)中，使 OD600在 0． 8左右。
将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的
培养杯倒扣其上，浸泡 15 min。取出植株，横放在塑料
盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养。第
2天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度 6 －7 d。培
养 3 －4周，待种子成熟后，收取种子。
1． 2． 3 转化子的筛选 种子消毒:先用 70%的乙
醇浸泡 2 min，再用 1%NaClO溶液涡漩洗涤15 min，
无菌水漂洗 5 次，用 0． 1%的琼脂重悬浮种子，均匀
分散到固体筛选培养基(1 × MS salt，3%蔗糖，0． 8%
琼脂，pH5． 7，潮霉素 30 mg /L)表面上，放入培养室
培养。大约两周后，即可区分转化株与未转化株，转
化株移栽到土中以收取种子。
1． 2． 4 转化子的遗传分析 为得到纯合的转基因
株系，转化株要自交 3 代以上。取 T1 代所结种子，
表面消毒后播种于含 30 mg /L潮霉素的固体筛选培
养基上，萌发两周后，统计绿苗和黄苗的分离比例
(T2 代分离比，单位点插入应为 3∶ 1) ，绿苗移栽到
土壤中，培养至成熟，单株收取种子。每株收取的种
子分别播种于含 30 mg /L潮霉素的固体筛选培养基
上，在平板上生长全为绿苗的为含至少一个插入位
点的纯合转化植株。
1． 2． 5 转基因植株的 PCR 和 RT-PCR 鉴定 提取
部分转基因的纯系和野生型拟南芥的基因组总 DNA，
分别 用 P1:5-GGATCCAGCTTTAAGTTCAATCTTGC-
CAAAA-3 和 P2:5-GGTCACCTTATGATACCCTCTC-
CGTCAAATT-3这对基因全长特异性引物进行 PCR扩
增，并以质粒 pCAMBIA1301-LgNHX1 作阳性对照。
为了检测转化植株中 LgNHX1 基因是否表达，进行
了 RT-PCR检测。采用 Trizol RNA提取试剂提取部
分转基因的纯系和野生型拟南芥的 RNA，分别取 10
μL RNA，2． 0 μL Oligo dT，70℃ 5 － 10 min，冰浴 5
min，再加入 4 μL 5 × RT buffer，1． 0 μL dNTP
(10 mmol /L) ，2． 0 μL MgCl2，0． 5 μL RNase Inhibi-
tor，0． 5 μL AMV 反转录酶，反应体积 20 μL，37℃
1 h;70℃ 10 min。以反转录产物作为模板，利用
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
P1、P2 引物进行 PCR 扩增，扩增产物经 1%琼脂糖
凝胶电泳后用凝胶成像系统照相。
1． 2． 6 盐胁迫处理 纯系及野生型的种子直接播
种于混合介质中，用 Hoagland 营养液定期浇灌。每
个株系做 3 个重复，每个重复包含 5 棵植株。于 8 h
光照，16 h 黑暗的短日照条件下培养，以促进其营
养生长。培养28 d后，分别用0、100、150和 200 mmol /L
NaCl处理。NaCl 的浓度要逐渐增加，每隔一天处理一
次，每次处理增加 50 mmol /L，待一起达到处理终浓度
后，隔一天再继续用终浓度处理 7 d，对照浇灌 Hoagland
营养液。观察生长情况，收集相同部位(地上部和根)材
料放在一起，用于干、鲜重的测量及离子含量的测定。
1． 2． 7 干、鲜重的测量 收取整株植株，用蒸馏水
和去离子水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分，测量
鲜重。之后放入烘箱中，120℃烘烤 30 min，再转为
80℃烘烤 48 h时至恒重，称量干重。
1． 2． 8 Na +、K +离子含量的测定 将上述相同株
系的地上部分收集在一起，磨碎，用 8 mL 65%浓硝
酸和 3 mL 30%双氧水消解样品，过滤后定容至 50
mL，取部分样品溶液用 iCAP 等离子体发射光谱仪
测定 K +及 Na +含量。
2 结果与分析
2． 1 转基因拟南芥的筛选及遗传分析
转基因拟南芥 T0、T1 和 T2 代转化子在含 30
mg /L潮霉素的 MS培养基上的生长情况，如图 1 所
示，筛选获得转 LgNHX1 纯合转化子，并对其进行了
分子鉴定和耐盐性分析。
图 1 转基因拟南芥在潮霉素培养基上的生长情况
2． 2 转基因植株的 PCR鉴定
用 LgNHX1 全长特异性引物 P1 和 P2 进行 PCR
扩增分析，以野生型植株的 DNA 作对照，结果(图
2)显示，转化植株中都可以扩增出大小为 1 656 bp
的目的条带，与预期的片段及阳性质粒对照吻合，对
照植株没有出现相应的扩增条带，这表明目的基因
的确已经整合到拟南芥的基因组中。
图 2 转 LgNHX1 基因植株的 PCR鉴定
2． 3 转基因植株的 RT-PCR鉴定
提取经 PCR 检测为阳性的转化植株及野生型
对照植株的总 RNA，进一步作 RT-PCR，分析转化植
株中 LgNHX1 基因的表达情况(图 3) ，转化植株中
LgNHX1 基因已经正常转录，野生型拟南芥没有出
现相应的扩增条带，说明在转化植株中 LgNHX1 基
因已在转录水平上得到了表达。
图 3 转 LgNHX1 基因植株的 RT-PCR鉴定
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2011 年第 9 期 周玲玲等:过量表达大叶补血草 LgNHX1 基因对拟南芥耐盐性的影响
2． 4 转基因植株的耐盐性分析
2． 4． 1 转基因植株在不同盐胁迫处理条件下的生
长情况 野生型和转基因拟南芥播种于混合介质
中，一个月后，分别用 0、100、150 和 200 mmol /L
NaCl处理，处理方法如前所述。200 mmol /L NaCl
处理下转基因株系生长情况好于野生型对照。
2． 4． 2 盐处理对转基因植株和野生型植株鲜重和干
重的影响 与正常条件下相比较，各种盐浓度胁迫
下，两个转基因株系地上部分和根的鲜重以及干重与
野生型植株一样均下降，但在同一盐浓度条件下，两
个转基因株系地上部分和根的鲜重以及干重相对高于
野生型对照(图 4)，差异未达到显著水平(P ＞0． 05)。
A．转化植株与野生型植株地上部分鲜重;B．转化植株与野生型植株地下部分鲜重;C．转化植株与野生型植株地上部分干重;D．转
化植株与野生型植株地下部分干重;图中数据为 15 个重复的平均值 ±标准差(x— ± s)
图 4 盐处理对转基因植株与野生型植株鲜重和干重的影响
2． 4． 3 转基因植株与野生型植株中 Na +、K +含量
的变化情况 对于大多数植物而言，盐分胁迫的主
要伤害之一就是大量 Na +积累在细胞质中，造成对
植物膜系统的破坏和胞质中酶的毒害作用，而过量
盐分的积累往往又会影响到 K +的积累。因此测定
了转基因植株地上部分的 Na +和 K +含量。正常情
况下，植株地上部分仅积累微量的 Na +(图 5-A) ，各
株系 Na +含量的差异没有达到显著水平;但在盐分
胁迫下，Na +含量急剧上升，当盐浓度达到 150 － 200
mmol /L时，两个转基因株系的 Na +含量显著高于野
生型(P ＜ 0． 05)。在盐分胁迫下大量 Na +离子的存
在往往会影响到 K +的代谢，造成 K +绝对含量的下
降。在本试验中各株系地上部分的 K +含量在正常
情况下差异没有达到显著水平(图 5-B ) ，在盐分胁
迫下，植株地上部分的 K +含量较大程度地受到盐
分胁迫的影响，野生型的 K +含量下降最大，由正常
情况下的 135． 29 mg /g 下降到 70． 71 mg /g，下降了
47． 7%。盐胁迫下株系 T3-2 的 K +含量最高，由正
常情况下的 132． 35 mg /g 下降到 97． 32 mg /g，下降
了 26． 47%。在 150 － 200 mmol /L 盐胁迫下，两个
转基因株系 K + 含量都极显著高于野生型(P ＜
0． 01)。
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图 5 盐处理对转基因植株与野生型植株 Na +和 K +含量的影响
3 讨论
盐胁迫所造成的毒害作用是由于细胞中离子平
衡的破坏，Na +胁迫可导致根细胞 K +吸收被破坏;
同时 Na +进入细胞达一定水平将对胞质酶产生毒害
作用，并致细胞生长停止或死亡。因此，细胞内与离
子平衡相关的基因对细胞耐盐性则至关重要，其中
K +和 Na +的离子均衡尤为关键。因而，植物细胞离
子区隔化和离子均衡的关键基因对于植物耐盐性是
必要的。
高等植物的液泡膜 Na + /H +逆向转运蛋白能逆
着 Na +浓度梯度，将胞质中的 Na +区隔化至液泡中。
这一方面减少了胞质中的 Na + 浓度，避免过多的
Na +对胞质酶造成伤害，干扰生理生化代谢;另一方
面是植物利用 NaCl 作为渗透剂，减小了细胞的水
势，促进植物从外界吸水，从而有利于在盐渍化土壤
中的生存。Na +的区隔化不仅是植物耐盐的需要，
而且是生长最基本的需要［2］。外源液泡膜 Na + /H +
逆向转运蛋白基因导入植物后能明显提高植物的耐
盐性。在拟南芥［3］、番茄［4］和油菜［5］中过量表达
AtNHX1，转基因植株在 200 mmol /L NaCl 胁迫条件
下能正常生长，从而证明利用 Na +区隔化至液泡这
一单一性状可明显改善植物的耐盐性。在棉花中过
量表达 AtNHX1 基因发现，在温室中 200 mmol /L
NaCl处理条件下，转基因棉花植株产量增加并产生
更多的棉纤维，田间种植的转基因棉花也能够产生
更多、质量更好的棉纤维［6］。
国内外学者对 NHX 基因家族的研究结果证实
该基因家族大多可以增强生物耐盐性，但在耐盐机
理方面的研究还未取得一致的结果。高盐胁迫条件
下，酿酒酵母 NHX1 基因的耐盐作用与维持液泡内
的 K + /Na +比有关，NHX1 通过增加液泡内的 K +浓
度，减轻 Na +对细胞质中细胞器的危害［7］。在高盐
胁迫环境(200 mmol /L NaCl)生长的 NHX1 基因转
化油菜 T2 代植株叶和根中 Na +浓度提高到 7 － 9
倍［5］，这与超量表达拟南芥液泡膜 Na + /H +反向转
运蛋白基因 AtNHX1 的拟南芥［3］、番茄［4］、荞麦
(Fagopyrum esculentum Moench)［8］和草木樨状黄芪
(Astragalus melilotoides Pall)［9］Na +含量测定结果一
致。但薛哲勇等［10］在小麦中过量表达 AtNHX1 基
因，在 100 － 150 mmol /L NaCl 条件下，转基因株系
与非转基因株系相比，叶中积聚的 Na +浓度较低，而
K +浓度较高。
大叶补血草是新疆特有的泌盐植物，其生境土
壤多为盐化草甸土，根际土含盐量达 2． 3%时，群落
生长良好。因此，推断大叶补血草的 Na + /H +逆向
转运蛋白可能具有较强的 Na +转运能力。本试验在
对 LgNHX1 基因进行过量表达的研究中发现，在盐
胁迫条件下，转 LgNHX1 纯系植株的生长明显好于
野生型对照，不同盐浓度条件下，转基因株系的鲜
重、干重均相对高于野生型植株，说明转基因植株能
更好地适应盐胁迫，保持良好的长势。
许多研究和实践表明，盐胁迫时，耐盐植物根系
增强 K +的选择吸收，以维持较高的 K + /Na +比值，
保证气孔正常功能和许多代谢的正常进行，K + /
Na +比值与植株耐盐能力呈现正相关［11］。NaCl 胁
迫下保持叶片细胞中较高 K +浓度是植物耐盐性的
重要方式之一。本研究测试结果显示，虽然盐浓度
在 150 － 200 mmol /L 时，转基因株系的 Na +含量显
著高于野生型(P ＜ 0． 05) ，但在同样条件下，转基因
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2011 年第 9 期 周玲玲等:过量表达大叶补血草 LgNHX1 基因对拟南芥耐盐性的影响
株系 K +含量都极显著高于野生型(P ＜ 0． 01) ，说明
液泡膜 Na + /H +反向转运蛋白基因的表达可能使
K +代谢平衡发生了变化，在一定程度上保持了 K +
含量，表明在改善盐分胁迫下 K +的营养状况方面
LgNHX1 可能起到一定的作用，这可能与 LgNHX1
直接参与离子的转运有关。逆境条件下，细胞内保
持一定的 K +含量对正常的生命活动至关重要。
本试验结果表明，过量表达 LgNHX1 基因的拟南
芥比野生型具有更强的耐盐能力，通过对 LgNHX1 的
耐盐功能进行研究，揭示 LgNHX1 耐盐性关键所在，
为植物耐盐基因工程提供更有效的基因奠定基础。
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(责任编辑 马鑫)
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