全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 2006~2012　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.04722006
收稿 2015-09-01　　修定 2015-10-30
资助 北京市自然科学基金项目(6142007和6152008)、北京市农
林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140103)和北京
市农林科学院草业中心人才培养基金项目。
* 通讯作者(E-mail: menglin9599@sina.com; Tel: 010-
51503345)。
马蔺NHX基因的克隆与基因表达分析
郭强, 孟林*, 李杉杉, 张琳, 毛培春, 田小霞
北京市农林科学院, 北京草业与环境研究发展中心, 北京100097
摘要: 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX所特有的液泡Na+区域化功能, 在植物耐盐中发挥着极其重要的作用。以马蔺根中
总RNA为模板, 利用同源克隆方法克隆得到一个NHX基因, 命名为IlNHX。序列分析表明该基因的开放阅读框为1 641 bp,
编码546个氨基酸, 与已知的植物NHX具有较高的同源性(>70%)。预测其蛋白质分子量为60 kDa, 等电点为6.67。实时定
量PCR分析表明, 随着NaCl浓度的增加, 地上部和根中的IlNHX基因表达水平呈增加趋势, 且地上部中的表达量显著高于根
部, 表明IlNHX基因的表达受到盐的诱导和调节。
关键词: 马蔺; 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白; 表达; 耐盐
Cloning of Iris lactea var. chinensis NHX and Analysis of Gene Expression
GUO Qiang, MENG Lin*, LI Shan-Shan, ZHANG Lin, MAO Pei-Chun, TIAN Xiao-Xia
Beijing Research and Development Center for Grasses and Environment, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,
Beijing 100097, China
Abstract: The tonoplast Na+/H+ antiporters (NHX) are involved in the compartmentalization of Na+ into vacu-
oles and also play critical roles in salt tolerance of plant. Total RNA was extracted from the roots of Iris lactea
var. chinensis to obtain an IlNHX by homology cloning. The open reading frame of IlNHX was 1 641 bp encod-
ing 546 amino acids. The deduced amino acid sequence of IlNHX shared over 70% amino acid homology com-
pared with other plants NHX. The protein was estimated to have a molecular weight of 60 kDa and isoelectric
point of 6.67. Quantitative real-time PCR analysis showed that expression levels of IlNHX exhibited an increase
trends in both shoots and roots with the increase of external NaCl concentrations, and its levels in shoots was
significant higher than that of roots, indicating that the expression of IlNHX was induced and regulated by salt.
Key words: Iris lactea var. chinensis; tonoplast Na+/H+ antiporter; expression; salt tolerance
土壤盐渍化是限制农作物产量的主要非生物
因素之一(Guo等2012), 这主要是由于土壤中过高
浓度的Na+会造成植物的生理干旱, 扰乱细胞的离
子平衡, 导致膜功能失调和代谢活动的减弱, 从而
抑制生长并最终导致细胞死亡(Zhu 2001)。植物
细胞抵御Na+毒害的主要策略有Na+外排和Na+区
域化(Guo等2013)。其中, 在Na+区域化过程中, 液
泡膜Na+/H+逆向转运蛋白依靠液泡膜H+-ATPase形
成的H+跨膜电化学梯度为其提供驱动力, 将细胞
质中过多的Na+区域化到液泡中, 从而减轻了Na+
对细胞质内的各类代谢酶的伤害, 同时还可作为
一种廉价的渗透调节剂来维持细胞的膨压, 降低
细胞渗透势, 进而提高植物耐盐性(Blumwald和
Poole 1985)。
液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白活性最初是在甜
菜(Beta vulgaris)根中检测到(Blumward和Poole
1985)。Apse等(1999)从拟南芥(Arabidopsis thali-
ana)中鉴定出第一个高等植物液泡膜上的Na+/H+
逆向转运蛋白基因AtNHX1。随后相继在水稻
(Oryza sativa) (Fukuda等1999)、北滨藜(Atriplex
gmelinii) (Hamada等2001)、盐地碱蓬(Suaeda sal-
sa) (Ma等2004)、玉米(Zea mays) (Zörb等2005)、
胡杨(Populus euphratica) (Ye等2009)和霸王(Zygo-
phyllum xanthoxylum) (Wu 等2011)等植物中克隆到
液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX。异源表达
互补实验表明, 在酵母nhx1突变体中过量表达AtN-
HX1, 显著降低了酵母对盐的敏感性, 增强了细胞
内Na+的区域化能力(Gaxiola等1999)。Apse等
郭强等: 马蔺NHX基因的克隆与基因表达分析 2007
(1999)发现, 在拟南芥中超表达AtNHX1, 转基因植
株液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白活性显著高于野生
型, 且在高盐胁迫下仍能正常生长发育。在油菜
中过量表达AtNHX1 , 与野生型相比 , 发现200
mmol·L-1NaCl胁迫下转基因油菜T2代植株叶和根
中Na+含量提高了7~9倍, 而且仍能正常生长、开
花和结实(Zhang等2001)。将AtNHX1转入玉米(Yin
等2004)和小麦(Xue等2004)等植物中, 显著提高了
它们的耐盐性。Bao等(2014)研究发现, 将荒漠旱
生植物霸王ZxNHX转入百脉根(Lotus corniculatus)
后, 发现转基因植株的叶和根中积累了更多Na+、
K+和Ca2+, 降低了其叶片渗透势和增强了保水性,
使得其抗旱性和耐盐性得以显著提高。近年来,
随着研究的深入, 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的其
他一些功能也逐步被发现: 敲除拟南芥AtNHX1, 与
野生型相比, atnhx1突变体植株表皮细胞数量与叶
面积明显减小 , 并发生叶片卷曲现象 (Apse等
2003)。He等(2005)研究表明, 在棉花(Gossypium
hirsutum)中超表达AtNHX1, 盐胁迫下转基因植株
棉纤维产量显著增加, 同时, 转基因棉花的光合速
率和氮同化速率均比野生型植株强, 这可能是转
基因植株提高棉纤维产量的一个重要原因。此外,
植物液泡膜NHX类蛋白也可能参与K+/H+逆向转
运, 这类蛋白的过量表达将有助于K+在液泡内的
大量积累, 并调控K+在细胞质和液泡中的分配, 从
而提高转基因植物对高Na+环境的适应能力(Leidi
等2010)。随后Bassil等(2011)研究表明 , 利用
T-DNA定点插入的方法, 获得拟南芥双突变体atn-
hx1atnhx2, 与野生型相比, 双突变体液泡中的pH值
显著降低, 使之发生酸化, 液泡中的K+浓度和花粉
活性也随之降低; 说明AtNHX1和AtNHX2通过控
制液泡中pH和K+稳态来调节拟南芥开花和生长发
育。综上所述, 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX
不仅在植物耐盐中扮演着至关重要的作用, 而且
在保持细胞中的K+和pH稳态中也起重要作用, 从
而影响植物的生长发育(Reguera等2014)。
马蔺(Iris lacteal var. chinensis)又名马莲, 是鸢
尾科鸢尾属多年生宿根草本植物, 广泛分布于我
国西北、东北和华北等地区, 其叶片色泽青绿, 返
青早, 绿期长, 花淡雅美丽, 具有较强的抗病虫能
力, 其根系发达入土深, 须根稠密呈伞状分布, 具
有很强的缚土保水能力, 耐粗放管理, 养护成本较
低, 是优良的水保、护坡、观叶赏花园林地被植
物, 同时, 马蔺的种子还具有重要的药用价值(孟林
等2003); 特别是其极强的耐盐能力已成为我国北
方退化低地盐生草甸的主要植被(白文波和李品芳
2005)。然而, 有关液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX
在马蔺耐盐性中的作用机制研究尚不清楚。鉴于
此, 本研究以马蔺为材料, 克隆其IlNHX, 并分析了
盐胁迫下IlNHX基因的表达特性, 这为进一步研究
IlNHX基因的转化及功能解析奠定了基础。
材料与方法
1 实验材料
植物材料为马蔺[Iris lactea Pall. var. chinensis
(Fisch.) Koidz.], 其种子采自北京市农林科学院小
汤山草资源试验基地。大肠杆菌菌株Escherichia
coli DH5α由本实验室保存。
2 主要试剂
RNA提取、PCR扩增、DNA回收、TA克
隆、Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eras-
er第一链合成、DNA marker等试剂盒均购自宝生
物工程有限公司, 其他生化试剂均为进口或国产
分析纯。
3 实验材料培养
挑选色泽光亮饱满的马蔺种子经5%次氯酸
钠溶液消毒5 min后, 再用蒸馏水冲洗然后置于
40 ℃的水浴锅中浸泡56 h, 将其均匀播撒在装有
营养土和细沙(2:1)的花盆中, 置入人工气候箱培养
至6周龄时, 挑选长势一致的幼苗移入培养盒(长19
cm、宽13.5 cm、高7.5 cm)中浇灌Hoagland营养液
[2 mmol·L-1 KNO3, 0.5 mmol·L
-1 NH4H2PO4, 0.25
m m o l · L - 1 M g S O 4 · 7 H 2 O , 0 . 1 m m o l · L
- 1
Ca(NO3)2·4H2O, 0.5 mmol·L
-1 Fe-citrate, 92 μmol·L-1
H3BO3, 18 μmol·L
-1 MnC12·4H2O, 1.6 μmol·L
-1 Zn-
SO4·7H2O, 0.6 μmol·L
-1 CuSO4·5H2O, 0.7 μmol·L
-1
(NH4)6Mo7O24·4H2O]培养2周, 营养液每2 d更换一
次。培养室光照培养16 h (昼)/8 h (夜), 昼/夜温度
为25 ℃/18 ℃, 光强约为600 μmol·m-2 s-1, 空气相对
湿度为50%~80%。
4 马蔺IlNHX基因的克隆
将培养至8周龄的马蔺幼苗在100 mmol·L-1
NaCl溶液中处理24 h, 采集其根经无菌水冲洗后,
置于消毒滤纸上吸干水分, 取其鲜根100 mg, 于液
植物生理学报2008
氮中充分研磨, 参照宝生物RNA提取试剂盒和说
明书提取总RNA, 利用Prime Script RTase cDNA第
一链合成试剂盒进行反转录, 合成cDNA。根据
NCBI GenBank数据库中注册的白花马蔺IlNHX2
的序列(登录号: AY730277), 设计正、反向引物P1
(5 ′ -ATGGGGTCTGGTATGGAGGA-3 ′ )和P2
(5′-TCATTCCCATCCATGAACAC-3′), 引物由上海
生工合成。PCR扩增反应体系: 在200 µL PCR管中
依次加入: Prime STAR HS (Premix) 25 µL, 20
pmol·µL-1 P1和P2各0.5 µL, cDNA 4 µL, 加水补至
50 µL。反应条件: 94 ℃ 1 min; 98 ℃ 10 s, 55 ℃ 15 s,
72 ℃ 2 min, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。
PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测, 目的片段
的回收和纯化按照宝生物DNA胶回收试剂盒说明
书操作说明进行。回收得到的PCR纯化产物连接
到pMD19-T载体, 转化到感受态大肠杆菌DH5α中,
用含有50 mg·L-1氨苄青霉素的LB固体培养基进行
蓝白斑筛选, 转化白斑菌株经质粒PCR鉴定确认阳
性克隆后, 送至上海生工测序。
5 实时荧光定量PCR
采用实时荧光定量PCR方法分析不同盐浓度
(0、25、50、100和200 mmol·L-1 NaCl)处理48 h后
马蔺地上部和根中IlNHX基因的表达模式。盐处
理下马蔺地上部和根中的总RNA的提取参照宝生
物RNA提取试剂盒说明书进行。cDNA第一链的
合成按照Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA
Eraser试剂盒说明书进行(宝生物工程有限公司)。
马蔺IlNHX基因实时荧光定量PCR正向引物P3
(5′-TCTTCCCGCTGTCTTTCCTATC-3′)和反向引
物P4 (5′-CATCAAACCTGCCCACCA-3′), PCR产
物长度为98 bp; 马蔺内参基因Actin实时荧光定量
PCR正向引物P5 (5′-TATTGTGCTGGATTCTGGT-
GATG-3′)和反向引物P6 (5′-GGAGGATAGCATG-
GGGAAGAG-3′), PCR产物长度为80 bp。参考宝
生物SYBR® Premix Ex Taq II试剂盒说明书的方法
在Step One Plus仪器上进行实时荧光定量PCR实
验。反应体系: cDNA 1 µL, SYBR® Premix Ex Taq
II 10 µL, ROX Reference Dye 0.4 µL, 正、反向引
物分别为1 µL, 加水补至20 µL。扩增程序为: 95 ℃
1 min; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。采用2-△△CT
方法计算马蔺IlNHX基因在不同盐浓度胁迫下的
相对表达量, 设置3次重复。
6 生物信息学分析
序列的比较、翻译和系统进化树分析分别在
DNAMAN 8.0、Primer 5.0和MEGA 6.0软件上进
行, Blast搜索和蛋白质二级结构预测分别在NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和SOPMA (https://
npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=np-
sa_sopma.html)网站上进行。
实验结果
1 马蔺IlNHX基因的克隆
以马蔺根cDNA为模板, 用克隆引物P1和P2进
行PCR扩增, 1.2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进
行检测, 发现约在2 000 bp处有一条亮带, 且上下无
杂带, 与目的片段的大小一致, 将此片段回收纯化
连接到pMD19-T克隆载体上, 转化到DH5α中。从
转化的平板上随机挑取多个阳性克隆, 随后从这
些克隆中任选6个提取质粒, 进行PCR扩增, 得到的
扩增片段大小约在2 000 bp处(图1), 表明这些克隆
为阳性克隆, 测序结果发现该基因的开放阅读框
为1 641 bp, 编码546个氨基酸, 预测其蛋白质分子
量为60 kDa, 等电点为6.67; 与白花马蔺IlNHX2基
因的碱基序列相似性为99.39%, 氨基酸序列相似
性为99.27%, 命名为IlNHX。
图1 IlNHX PCR扩增产物
Fig.1 The PCR products of IlNHX
M1: DL2000 DNA Marker; 1: IlNHX扩增产物。
2 马蔺IlNHX的生物信息学分析
将IlNHX的氨基酸序列与GenBank中的氨基
酸序列进行比对, 结果显示IlNHX与油棕(Elaeis
guineensis)、谷子(Setaria italica)和拟南芥植物的
郭强等: 马蔺NHX基因的克隆与基因表达分析 2009
液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX同源性分别为
87%、83%和72%; IlNHX具有11个跨膜保守区, 在
第3个跨膜的保守区上有氨氯吡嗪咪的结合位点
(85LFFIYLLPPI94), 可能与Na+的竞争性抑制有关
(图2)。
利用在线的SOPMA软件对IlNHX蛋白质二级
结构进行了预测(图3), 发现其含有34.25% α螺
旋、28.75%延伸链、10.99% β转角和26.01%无规
则卷曲。α螺旋和无规则卷曲结构交错构成了其
蛋白质二级结构的主要部分。
为了进一步分析IlNHX与其他植物液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX的亲缘关系, 利用
MEGA 6.0软件对植物的NHX进行系统进化树分析
(图4)。结果表明: IlNHX与油棕EgNHX2、海枣
(Phoenix dactylifera) PdNHX2、小果野蕉(Musa
acuminata) MaNHX2、谷子SiNHX2、拟南芥AtN-
HX1等的亲缘关系较近, 而与拟南芥质膜Na+/H+逆
向转运蛋白AtSOS1亲缘关系较远。序列比较结果
以及进化树分析都表明IlNHX应为液胞膜Na+/H+逆
向转运蛋白上的一类基因。
3 马蔺IlNHX基因表达模式分析
为了分析盐处理对马蔺地上部和根中IlNHX
的表达影响, 8周龄的马蔺幼苗分别用0、25、50、
100及200 mmol·L-1NaCl处理48 h。结果显示, 随
NaCl浓度的增加, 地上部和根中的IlNHX表达水平
呈递增趋势, 且地上部IlNHX表达水平显著高于根
中的(图5)。由此表明, IlNHX的表达受盐胁迫的诱
导和调节。
讨　　论
植物为了抵御盐害将Na+区域化到液泡中, 以
避免Na+在细胞质中的含量达到毒害水平,并保持
图2 IlNHX与其他植物NHX氨基酸序列比对
Fig.2 Amino acid sequence alignment of IlNHX with other plants NHX
紫红色方框表示高度保守的氨氯吡嗪咪的结合位点; 黑色下划线表示跨膜区; Il: 马蔺; Eg: 油棕; Si: 谷子; At: 拟南芥。
植物生理学报2010
图3 IlNHX蛋白质二级结构预测
Fig.3 Prediction of the secondary structure of IlNHX
螺旋(h)、折叠(s)、转角(t)和卷曲(c)分别由蓝、红、绿和黄色线条表示。
图4 INHX与其他植物NHX的系统进化树分析
Fig.4 Phylogenetic tree of IlNHX and NHX from other plants
Al: 平滑獐毛; At: 拟南芥; Bd: 二穗短柄草; Eg: 油棕; Gr: 雷蒙德氏棉; Hv: 大麦; Il: 马蔺; Lf: 细穗千金子; Ma: 小野果蕉; Nn: 荷花; Pd:
海枣; Pe: 胡杨; Pha: 芦苇; Si: 谷子; Ta: 小麦; Te: 长穗偃麦草; Vv: 葡萄; Zj: 结缕草。
郭强等: 马蔺NHX基因的克隆与基因表达分析 2011
液泡较低的水势, 维持膨压和细胞膨胀, 是植物耐
盐的重要策略之一(Guo等2013)。液泡膜Na+/H+逆
向转运蛋白NHX是植物耐盐的关键因子, 主要负
责参与液泡Na+区域化, 其次还在保持液泡中的K+
和pH值稳态以及影响叶片发育扮演着重要的角色
(Reguera等2014)。本研究从马蔺中克隆得到液泡
膜Na+/H+逆向转运蛋白基因IlNHX, 其编码了546个
氨基酸, 与其他植物NHX的同源性高达72%以上,
且N末端具有11个疏水跨膜结构域, C末端含有一
个长的亲水性尾巴(图2)。一般而言, 植物NHX蛋
白含有10~12个跨膜结构域, 主要以二聚体的形式
行使功能(Padan等2009), 该蛋白C末端是调节活性
的区域, 其结构域中含有多个蛋白激酶作用位点,
主要参与钙调素的结合以及多种信号的启动反应
(石乐义等2006)。据此, 推测马蔺IlNHX的C末端
结构域可能也参与多种信号的启动及钙调素的结
合。由图2所示, 与拟南芥AtNHXl一样, 在IlNHX
TM3跨膜区同样含有高度保守的氨氯吡嗪咪结合
位点(LFFIYLLPPI)。拟南芥AtNHXl对于氨氯吡
嗪咪具有高度的敏感性, 可被氨氯吡嗪咪完全抑
制, 这归于拟南芥AtNHX1的氨氯吡嗪咪结合位点
(LFFIYLLPPI)的第4个氨基酸残基是异亮氨酸、
第5个是酪氨酸残基, 而这2个氨基酸残基对于氨
氯吡嗪咪具有很高的亲和性(Counillon等1993)。
这暗示着, 马蔺IlNHX TM3跨膜区上的LFFIYLLP-
PI结构域对液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的底物Na+
的竞争性抑制剂氨氯吡嗪咪具有敏感性, 是负责
Na+转运的区域。
系统进化树分析表明, 植物Na+/H+逆向转运
蛋白家族可分为两类, 即质膜型和液泡型。IlNHX
与其他植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的同源关
系较近, 而与质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)的同
源关系较远(图4)。这与之前报道的该家族分类的
结果一致(Brett等2005)。特别是, 随着NaCl浓度的
增加, 马蔺地上部和根中的IlNHX表达水平呈增加
趋势, 且地上部中的IlNHX表达水平显著高于根部
(图5); 这或许是由于随着盐处理浓度的增加对
IlNHX的诱导和刺激作用越大, 这也有利于将地上
部细胞质中的Na+及时有效的区域化在液泡中, 从
而减轻盐对植物的伤害 ( A p s e等2 0 0 3 ; Wu等
2011)。由此可知, 马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋
白基因IlNHX定位在液泡膜上, 且与其他植物如拟
南芥AtNHX1一样具有类似的液泡膜Na+/H+逆向转
运蛋白基因的功能。
马蔺具有极强的耐盐能力, 是我国北方退化
低地盐生草甸的主要植被, 在长期的自然选择过
程中具有极强的抗逆性, 可能蕴藏着丰富的耐盐
基因资源, 挖掘和鉴定与其耐盐相关的功能基因,
将能克服栽培作物抗性育种中抗逆基因匮乏的问
题。鉴于此, 本研究从马蔺中克隆了IlNHX基因,
同时定量分析了不同浓度NaCl处理下各组织中的
IlNHX基因表达变化规律, 这将为下一步IlNHX基
因的转化及功能分析奠定了坚实的基础。
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图5 不同浓度NaCl处理下马蔺地上部和根中IlNHX基因的
表达分析
Fig.5 Expression analysis of IlNHX in shoots and roots under
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植物生理学报2012
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