全 文 ： 万方数据
万方数据
2。06年5月牛卫宁等：少根根霉(舷蛔娜舶泌)脂肪酶基因在毕赤酵母中的分泌表达 ·39·
子接种到MM一罗丹明乎板上，在培养艇盖上加100
江甲簿进行诱导表达。在∞℃下培养48ll，选取
365nm紫外光下形成最大荧光圈的熏组子进行下
一步试验u1|。
1．3．4重组子的咒R鉴定
从MM．罗丹明平板上随机挑取4个单克隆，使
用酵母基因组提取试剂盒掇取其基因组DNA(天为
时代，j艺京)。以提取的基因组为模板进行PCR扩
增。
l。3。5摇瓶培养
将选取的阳性重组子在装有l∞mLBMGY培
养基的500mL锥形瓶中培养20。24h至∞锄2。
6。培养液在室瀑下进行离心收集细胞，然后娥50
mLBMMY培养綦重悬，30℃下200∥min进行培养。
每12h在培养液中加o．5％的甲醇诱导脂肪酶的表
达，每12h测一次酶活。
1．3．6小试发酵培养
为了提高脂肪酶的表达量，我们在5L的发酵
罐中进行了翼旨骆酶的诱导表达。3∞越的静子液
被接种到3L的发酵培养基中。NH40H溶液被用作
氮源并调节发酵液的pH值(pH6．0)。当40{；；／L甘
油被耗尽后开始溅洳甲醇诱导嚣鹭肪酶的表达。嫠焉
在线甲醇分析仪检测发酵液中甲醇浓度。通过调节
转速(500～900“觚n)和通气量使溶氧被控制在
簦％敝一奠。
1．3．7脂肪酶活性测定
月黯肪酶活性测定使用橄榄油乳化法[1引。用50
船，碰毛粪柏珏溶液滴定反应中释放的脂肪酸。每个
样品试验3次取平均值。在30℃pH8．0的反应条
件下，每分钟释放l微摩尔脂肪酸的脂肪酶量定义
为1个脂肪酶活性单位。
1．3．8蛋白浓度测定
蛋白浓度测定使用Bra(蜘一法¨3|，以牛血清白
蛋自律标准。在鬃自层析纯纯试验中，在280鳓下
检测蛋白质峰。
1．3．9重组脂肪酶的纯化
嘏AL的纯化方法如下：发酵液经6。oO×g离心
20111in后收集上清。上清液经截留分子量为lO000
的膜超滤浓缩意对0。02艄l／L磷酸钠缓冲液(糯s，
pH6．O)4℃下透析过夜。透析液12∞0×g离心15
111in后上o。02mol／LPBs平衡过的sPS印haToseFast
FloW(1．6em×20em)柱，然后用O～O．5瑚d纯NaCl
进行梯度洗脱，活性峰被收集后使篇硫酸铵调整其
浓度至1．5mol儿，然后过ButylSepha鹪eFastnow(1
蘸，Ame赢黝)柱，使焉1．5—0两惩(嚣强)2SQ进行
梯度洗脱收集活性峰。使用sDs，PAGE分析纯化的
蛋自。
l。3．10Ⅳ．端氨基酸序列分析
重组蛋囱经SDs．PAGE电涌转印到PvDF膜上。
脂肪酶条带被切下后使用ABIp黼ise492cK蛋白
溺序仅测定箕弹．端氨基酸序列。
2结果与讨论
2。1脂肪酶表达载体的构建
以提取憋少根根霉基因组为模板咒R扩增褥
到l098bp的脂肪酶编码序列(包括脂肪酶前导序
列和成熟肽)(图2)，克隆至pMD．18T载体。克隆的
质粒趟D—18囊融L积酵母表达旗粒p琢C9K分别被
段oRI和Ⅳo￡I双酶切后进行连接，连接产物转化
露．∞屁DH5戗，然后提取重组质粒进行酶切鉴定，结
象如豳3所示。
M：DNAM棚．ker；l：“pasegellebyPCR砌pl谴ication
圈2多禳壤霉貉赫酶基霸的袋渡扩壤
Fig．2Ⅱpasegene舶m膨旺印凇n砌如淞was踟pli{ied
byPcRmethodol0料
2。2重组酵母的PCR鉴定
随机在MM．罗丹明平板上挑取4个转化子并提
取其基因组，以载体ppIC9K序列引物(57A似l，3’
A锻1)迸葶予咒R扩增，结果如图4所示。以菌株l
和2基因组为模板只扩增到一条约1400bp的条
带，以菌株3和4基因组为模板扩增得到l400bp
和22∞bp(22∞bp的条带为野生型矗溅l基因)
两条带，这与酵母表型鉴定结果一致(1，2为Mut8；
3，4为Mut+)。证明脂肪酶基因已经正确整合到毕
赤酵母基因缱中。
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