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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
分离自甘肃天祝五台岭土壤的放线菌拮抗性的初步研究
韩素贞 王静 吕超
(首都师范大学生命科学学院,北京 100048)


摘
要:
从甘肃天祝县土壤中分离到的 27株放线菌, 作为测试放线菌拮抗性的供试菌株。抗菌试验表明, 14株放线菌
对 6株革兰氏阳性菌和阴性菌以及白色念珠菌等指示菌有抗性。菌株WTL-4、WTL-20和 WTL-26抗菌谱最广, WTL-4能抗 3
种革兰氏阳性菌, WTL-20能抗革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌、革兰氏阴性的沙门氏菌及真菌白色念珠菌,
WTL-26能抗革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌及革兰氏阴性的沙门氏菌。抗肿瘤试验表明, 有 8株菌株对肿瘤
细胞有抑制作用, 其中抑制率在 60%以上的菌株占 18
5%。对抗肿瘤活性较高的 3株菌 WTL-4、WTL-14和 WTL-15以及没
有抗菌和抗肿瘤活性的菌株WTL-27进行了系统发育分析。从系统发育树可以看出, 4株菌均属于链霉菌属 ( Strep tomyces )。
菌株 WTL-4与 S trep tomyces virido chromoqenes的相似性为 98% ;菌株WTL-14和WTL-15的相似性达到 99
2% , 它们与 S. flavoli-
m osu s 174457的相似性达到 99
4% ; WTL-27与 S. mycroflavus的相似性为 99%。
关键词:
放线菌 抗菌活性 抗肿瘤活性
Study on Antagonistic Functions of Actinomyces Isolated from
Wutailing in T ianzhu, Gansu Province
H an Suzhen W ang J ing Lv Chao
(Lif e Science Co llege, CapitalN ormal University, Beijing 100048)


Abstrac:t
27 stra ins o f actinom ycetes w ere iso la ted from the so il ofWu tailing in T ianzhu, Gansu prov ince wh ich w ere used as ex-
perim ent ones on resistance research. The results of ant-i bacte ria activ ity show ed tha t 14 stra ins had the res istance toBacillus subtilis,
S taphy lo coccus aureus, L ister ia monocy tog enes, Salm onella, p roteusbacillus vulgar is and Canid ia alb icans. Stra in WTL-4, WTL-20 and
WTL-26 had thew idest ant-i bacte rial spectrum: WTL-4 cou ld resist on 3 gram-positive strains, WTL-20, WTL-26 on both g ram-positiv e
bacter ia( S taphy lococcus aureus and Listeria monocy tog enes) and gram-negative ones, WTL-26 also on the fungus Canid ia alb icans. The
resu lts o f ant-i tumor activ ity show ed that 8 stra ins could resist grow th of cancer ce lls, and the percent of strains( inh ibition ra te over 60% )
w as 18
5%. F rom the results of 16S rDNA sequenc ing o f 4 stra ins( ant-i tum or stra inWTL-4, WTL-14 andWTL-15, non ant-i tumo r stra in
WTL-27), it ind icated that they a ll belonged toS trep tomyces: WTL-4 had the sim ilarity of 98% w ith S trep tomyces viridochrom oqenes; WTL-
14 99
2% w ithWTL-15, and they had the sim ilarity 99
4% w ith S. flavolim osus 174457; WTL-27 99% w ith S. mycrof lavus.
Key words:
Ac tinomyce tes Ant-i bacter ia activ ity Ant-i tum or activ ity
收稿日期: 2010-11-18
基金项目:北京市教委基金项目 (KM200510082008)
作者简介:韩素贞,副教授,研究方向:微生物分类; E-ma i:l han suzhen99@ vip. sina. com
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切。目
前广泛应用的抗生素约 70%由各种放线菌所产生,
有些放线菌还能产生各种酶制剂 (如蛋白酶、淀粉
酶和纤维素酶等 )、维生素 ( B12 )和有机酸等, 弗兰
克氏菌属 (F rank ia )的放线菌能与非豆科木本植物
结瘤固氮。此外,放线菌还可用于甾体转化、烃类发
酵、石油脱蜡和污水处理等方面。
由于土壤中发现放线菌新种的几率越来越小,
因此研究者把目光集中到特殊生境和海洋等区域。
西藏地区海拔高、气温低,太阳辐射强、日照时间长,
土壤中放线菌资源丰富 [ 1] , 引起了研究者的广泛关
注。陈义光等 [ 2]从青海省盐碱土中分离到多种抗
肿瘤的放线菌;蔡艳 [ 3]也在青海各种类型的土壤中
分离到对 G+细菌有抗性的放线菌。甘肃天祝藏族
2011年第 5期 韩素贞等:分离自甘肃天祝五台岭土壤的放线菌拮抗性的初步研究
自治县与西藏和青海一样地处青藏高原, 但其土壤
中的放线菌研究报道不多。本研究从天祝县海拔
3 000多米的五台岭土壤中分离放线菌,对其抗菌活
性和抗肿瘤活性进行了测定。
1 材料与方法
1
1
菌种分离和保藏
将采集自甘肃天祝县的土样制成土壤悬液,用
平板稀释法在高氏一号培养基平板上分离纯化放线
菌, 25
培养至单菌落出现。将单菌落接入高氏一
号斜面, 25
培养后用 20%甘油制成菌悬液,放入
冻存管于 - 56
冰箱保藏。
1
2 拮抗性试验
1
2
1
抗菌试验 试验中所用指示菌为枯草芽孢
杆菌 ( Bacillus sub tilis)、金黄色葡萄球菌 ( S taphy lo-
coccus aureus)、大肠杆菌 (E scherichia coli)、单增李斯
特菌 ( L isteria monocytog enes)、沙门氏菌 ( Salmonel-
la )、变形杆菌 (P roteusbacillus vu lgaris)和白色念珠
菌 ( Canid ia albicans)等。
配置牛肉膏蛋白胨和土豆培养基 ( PDA, 用于
培养白色念珠菌 ) , 与指示菌混合后制成平板。将
放线菌培养于黄豆饼粉培养基平板上, 于 28
培
养 1周。用打孔器在放线菌平板上打孔, 制成直
径约 1 cm的菌块, 菌面朝上分别贴于指示菌平板
上, 与 28
培养 24 h后, 观察并测定抑菌圈的
大小。
1
2
2
抗肿瘤试验 将放线菌菌株接种于装有 50
mL ISP2液体培养基的 250 mL三角瓶中, 28
180
r /m in摇床振荡培养 7 d。发酵结束后,将发酵液移
至 10mL试管中于 8 000 r /m in离心 20m in,上清用
0
22
m的微孔滤膜过滤除菌, 滤液即为筛选抗肿
瘤活性菌株样品,于 - 20
保存待用。
将生长期的人乳腺癌细胞, 用 DMEM培养液
(内含 10% 的小牛血清, 1
105 U /L青霉素和 125
mg /L链霉素 )配制成 1
104个 /mL的单细胞悬液,
接种于 96孔培养板,每孔 80
L; 同时加 20
L待
测样品,阴性对照组用加肿瘤细胞而不加样品,空白
对照只加培养基。上述试验品按一定顺序加好后置
37
、5% CO2培养箱中培养 72 h, 试验中止前 4 h
(即第 68 h) ,每孔加入 10
L、5mg /mL的四甲基偶
氮唑 (MTT )生理盐水溶液, 继续培养至 72 h, 离心
后仔细吸弃上清, 每孔加 150
L二甲基亚砜 ( DM-
SO )之后,置于振荡器上充分振荡 1 m in, 待孔内结
晶溶解后,用空白对照调零, 用酶标仪在 570 nm处
测定光密度 ( OD)值。每组设 3个重复,按下式计算
抑制率 ( Inh ib ition rate, IR)。
IR (% ) = [ 1 - OD570 (样品 ) /OD570 (阴性 ) ]

100
1
3 四株菌的系统发育分析
总 DNA提取、16S rRNA基因的 PCR扩增按
Cui等 [ 4]使用的方法进行, 16S rDNA PCR产物用
0
8%的琼脂糖胶进行电泳检测, 检测后交送上海
生物工程技术服务公司测序。根据测序结果, 用
B last搜索程序从 G enBank中调出相似性较高的相
关菌株的 16S rRNA基因序列, 用 CLUSTAL X进
行多重序列比对 [ 5] , 用 MEGA 4
0 (M olecu lar E vo-
lutionary G enetics Analysis)软件包采用邻 接法
( N e ighbo r2 Jo in ing method)进行聚类分析和系统进
化树构建 [ 6]。
2 结果与分析
2
1 抗菌试验结果
7种指示菌, 除白色念珠菌是真菌外, 其他 6种
都是细菌;其中,大肠杆菌、沙门氏菌和变形杆菌为
G
-菌, 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯
特菌为 G +菌。
从表 1可以看出,菌株WTL-1、3、4、5、7、14、15、
16、17、18、20、21、22和 26,这 14株放线菌对指示菌
有抗性。其中, 3株菌对金黄色葡萄球菌有抗性, 5
株菌对枯草芽孢杆菌有抗性, 9株菌对单增李斯特
菌有抗性; 5株菌对沙门氏菌有抗性, 4株菌对变形
杆菌有抗性; 3株菌对白色念珠菌有抗性。所有的
供试菌对大肠杆菌都没有抗性。菌株 4、20和 26抗
菌谱最广,菌株 4能抗 1种革兰氏阴性菌和 2种革
兰氏阳性菌,菌株 20能抗革兰氏阳性的金黄色葡萄
球菌和单增李斯特菌、革兰氏阴性的沙门氏菌及真
菌白色念珠菌,菌株 26能抗革兰氏阳性的金黄色葡
萄球菌和单增李斯特菌及革兰氏阴性的沙门氏菌
(图 1)。
2
2 抗肿瘤试验结果
MTT法测定放线菌对人乳腺癌细胞株的抑制
结果见表 2。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
图 1
菌株W TL-4、26和 20分别对沙门氏菌 ( A)、金黄色葡萄球菌 ( B )和白色念珠菌 ( C)产生的抑菌圈
表 1
放线菌对指示菌的抗性
菌号
指示菌抑菌圈直径 ( cm )
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 沙门氏杆菌 枯草芽孢杆菌 单增李斯特菌 白色念珠菌 变形杆菌
WTL-1





1
3
WTL-2







WTL-3





1
7
WTL-4

1
5 2
4 2
4


WTL-5


1
4 1
8
1
7
WTL-6







WTL-7



1
7


WTL-8







WTL-9







WTL-10







WTL-11







WTL-12







WTL-13







WTL-14




1
5

WTL-15

1
5


1
8
WTL-16

1
7
1
8


WTL-17


2
2 2
0


WTL-18


2
0 1
8


WTL-19







WTL-20
2
0 1
7
2
2 1
7

WTL-21
1
8



1
6
WTL-22


1
4 1
6


WTL-23







WTL-24






WTL-25







WTL-26
2
2 1
7
2
0 1
5

WTL-27








代表无抗性
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2011年第 5期 韩素贞等:分离自甘肃天祝五台岭土壤的放线菌拮抗性的初步研究
从表 2可以看出, 有 8株菌株对肿瘤细胞有抑
制作用,其中抑制率在 60%以上的菌株占总菌株数
的 18
5%。抑制率最高的 3株菌是WTL-4、14和 15。
表 2
放线菌对人乳腺癌细胞株的抑制率
菌株 平均值 OD 抑制率 (% )
WTL-4 3
97 98
WTL-5 0
09 12
5
WTL-6 0
10 15
WTL-14 3
21 79
2
WTL-15 3
09 76
2
WTL-17 2
44 60
WTL-20 3
04 75
WTL-27 0
09 12
5
2
3 菌株WTL-4、14、15和 27的系统发育地位
在光学显微镜下, 对较高抗肿瘤活性的菌株
WTL-4、14、15和没有抗菌及抗肿瘤活性的菌株
WTL-27进行了形态学观察和系统发育学研究。
从基内菌丝和气生菌丝的形态来看, 4株菌均
具有链霉菌属的特性 (图 2)。基内菌丝发育良好,
多分枝,不形成横隔;气生菌丝分枝,孢子丝直、波曲
或螺旋形,孢子球形、椭圆形或柱形,表面光滑,具有
链霉菌属的特征。初步确定供试菌属于链霉菌属。
同时,对 4株菌的 16S rDNA扩增产物进行了测
序, 4株菌的序列长度均在 1 400- 1 500 bp之间。
用 B last搜索软件从 GenBank等数据库中进行相似
性搜索, 找出相似性最高的相关菌株的 16S rRNA
基因序列,用相关软件进行序列比对,构建了系统发
育进化树 (图 3)。
图 2
菌株 WTL-4(A )和 15( B)在 100
油镜下的菌丝形态
图 3
菌株 WTL-4、14、15和 27基于 16S rRNA基因序列的系统发育树
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从图 3可以看出, 4株菌均属于链霉菌属 (S trep-
tomyces)。菌株 WTL-4与 S trep tomyces viridochromo-
qenes的相似性为 98% ;菌株 WTL-14和 WTL-15的
相似性达到 99
2%, 有可能为同种, 它们与 S. f la-
volimosus 174457的相似性达到 99
4%; WTL-27与
S. mycrof lavus的相似性为 99%。最终确定以上菌株
的分类地位,还需要结合形态特征、生理生化特征、
细胞化学特征以及与典型菌株基因组间的 DNA-
DNA同源性比较等多相分类 ( po lyphasic taxonomy)
的研究结果。这些菌株的多相分类研究正在进
行中。
3 讨论
从特殊的环境乃至极端环境筛选新的放线菌菌
株是微生物药物研究的热点。生长在这些环境中的
放线菌,由于长期的选择压力, 形成了独特的环境适
应模式、特殊的生理机制和独特的基因类型,可以产
生多种类型的代谢产物, 不仅在自然界物质循环中
发挥重要作用,而且成为一类重要的生物资源。
李蓉等 [ 7]从深圳红树林根际土壤中分离到 95
株放线菌,其中的大部分属于链霉菌属。有 9株放
线菌能抗病原真菌, 1 /3的菌株具有抗肺癌细胞的
细胞毒性。Hara ld[ 8 ]从挪威海峡沉积物种分离到
3 200株稀有放线菌 (M icromonospora ) , 可以产生抗
生素。从具有典型的内陆干旱气候的新疆地区分离
到多种放线菌资源, 包括 2个新属和 19个新种 [ 9 ]。
张迎春 [ 10]从西藏念青唐古拉山卡拉山支脉的土样
中分离到 40株放线菌,通过多相分类表明这些放线
菌都属于链霉菌属, 其中有些菌株有可能是新的分
类单元。这些研究结果都表明,特殊环境中放线菌
资源丰富,具有发掘新药物的巨大潜力。
甘肃天祝藏族自治县属青藏高原东北边缘,海
拔在 2 040- 4 874m之间,属寒冷高原性气候,气候
带的垂直分布十分明显。目前,有关甘肃地区土壤
中放线菌的研究报道还不多。从本试验结果看, 从
甘肃天祝藏族自治县五台岭土壤中分离到的 27株
放线菌, 有 52%的菌株能够抗 G +、G -和白色念珠
菌; 抗肿瘤的阳性率达到 30% ,其中抑制人乳腺癌
细胞的抑制率在 60% 以上的菌株占总菌数的
18
5%。这些研究结果充分表明我国甘肃环境中也
具有产生天然生理活性物质的重要放线菌资源。
参 考 文 献
[ 1] 姜怡,唐蜀昆,张玉琴,等.放线菌产生的生物活性物质.微生物
学通报, 2007, 34( 1 ): 188-190.
[ 2] 陈义光,姜仪,李文均,等.青海盐碱环境中具抗肿瘤活性放线菌
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[ 4] Cu iX, M ao P, Zeng M, et a.l S treptimonospora sa lina gen. nov. , sp.
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[ 10] 张迎春,阚丽娟,刘少佳,等.西藏卡拉山土壤中放线菌的多相
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(责任编辑 马鑫 )
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