全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
微量病原检测技术研究进展
刘雅莉 1, 2 刘箐 2, 3 韩舜愈1
( 1甘肃农业大学食品科学与工程学院,兰州 730070; 2甘肃出入境检验检疫局中心实验室,兰州 730020; 3兰州大学生命科学学院,兰州 730030 )
摘 要: 微量病原由于其浓度很低, 达不到常规检测技术的检测灵敏度, 导致不可避免的漏检。近年来 ,新发展起来了
一些专门针对微量病原的灵敏、特异、快速的检测技术, 包括 PCRELISA、PCRM PH、ICPCR、IMPCR、IM SELISA、IM SPCR、
HCPCRM PH、HCrea l tim e PCR、RCA、LAMP等均可不同程度的解决以上问题。
关键词: 微量病原 敏感性 杂交诱捕 滚环扩增 环介导等温扩增
Progress in Research on Detection ofM icropathogens
L iu Yali
1, 2
L iu Q ing
2, 3
H an Shunyu
1
(
1
College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;
2
Key Lab of Gansu EntryEx it Inspection
and Quarantine Bureau, Lanzhou 730020;
3
College of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730030)
Abstrac:t M icropathogens w ith low concentrations, usua lly fa il to perform the detection sens itiv ity, lead ing to the inev itab le unde
tected. Recently, som e new detection techn iques includ ing PCRELISA, PCRMPH, ICPCR, IMPCR, IMSELISA, IM SPCR, HCPCR
M PH, H Crea l tim e PCR, RCA, LAM P, can detect m icropa thogen sensitive ly, spec ifica lly and rap idly.
Key words: M icropa thogens Sens itiv ity H ybrid ization capture Ro lling c ircle amp lifica tion Loopm ediated iso the rma l am
p lifica tion
收稿日期: 20100511
基金项目:甘肃省科技厅中小企业创新基金计划 ( 0802NCCA028) ,国家质监总局项目 ( 2007IK259, 2009IK276)
作者简介:刘雅莉,女,硕士研究生,研究方向:食品安全; Em ai:l w oly@l yahoo. com. cn
通讯作者:刘箐,男,博士,高级农艺师; Em ai:l ciqq@l sohu. com
病原感染事件是人类、动物、植物医学、以及
环境保护和食品安全中日趋突出的问题, 许多感
染人类、动物和植物以及环境和食品的样品都是
微量病原, 传统检测方法不仅耗时长,而且灵敏度
不够,病原漏检几乎不可避免。针对这一实际情
况, 建立一套专门针对微量病原的灵敏、准确、特
异、快速的检测技术, 以保证病原在浓度很低的情
况下也能被检出, 进一步提高检测灵敏度和检出
率, 严防漏检和误检, 是微量病原检测亟待解决的
问题之一。
近年来,国内外学者建立的微量病原检测技
术, 一部分是在以 PCR为代表的分子生物学技术
基础上衍生出来的新技术, 一部分是将免疫血清
学、分子生物学以及病原捕捉富集技术相结合的
微量病原检测技术。对于样品中含量极少的病原
检测,关键是提高检测技术的灵敏度、降低检测极
限。从三个方面论述如何提高检测技术的灵敏
度:一是常规分子生物学检测方法的衍生技术; 二
是在检测之前将微量病原进行浓缩、富集和纯化,
扩大检测病原基数; 三是利用高效的核酸扩增技
术使目标核酸在短时间内高效扩增, 放大检
测信号。
1 常规分子生物学检测方法的衍生技术
基于核酸水平的分子生物学检测技术灵敏度
高、特异性强, 是微量病原检测的最准确的方法之
一, 最具代表性的是 PCR技术, 但是普通 PCR产物
检测一般采用电泳分析,该法灵敏度低、污染大、只
能定性分析; 实时荧光定量 PCR实现了 PCR技术
由定性到定量的飞跃且不需电泳, 但此法需要使用
特殊仪器 (实时荧光定量 PCR仪 ) ,在一些基层实验
室不能得到很好的应用。 PCR技术的这些不足限
制了其发展、推广和应用, 利用酶联免疫法检测
2010年第 11期 刘雅莉等:微量病原检测技术研究进展
PCR产物,很好地解决了这一问题, 该技术分为不
杂交和杂交两种。
11 PCR酶联免疫 ( PCREL ISA )
用生物素和地高辛标记 PCR反应的引物, 得到
双标记的 PCR产物, 将产物稀释后加入标记有亲和
素的酶联板中,再加入标记抗地高辛的酶标抗体,最
后加底物读 OD值。此法不需解链杂交等反应, 操
作相对简单。
12 PCR微孔板杂交 ( PCRMPH )
过程是将 PCR产物变性后在微孔板中与含有
荧光素的探针杂交, 之后加入标记抗荧光素的酶标
抗体, 最后加底物读 OD值。此法有杂交过程特异
性强,同时可清除 PCR反应中非特异扩增杂带的影
响,结果更准确可靠。
PCRELISA、PCRMPH 在病毒、细菌以及支原
体衣原体检测方面都有很好的应用。杨利峰 [ 1]采
用 RTPCRELISA法检测猪瘟病原, 灵敏度比琼脂
糖电泳法高 100倍, 并对此法研制试剂盒做了详细
说明。谭炳乾等 [ 2] 在 2007年首次建立的 PCR
ELISA检测食品样品中单核细胞增多性李斯特菌的
方法表明 PCRELISA检测灵敏度是 PCR电泳法的
150倍以上。酶联法检测 PCR产物综合了 PCR、分
子杂交、ELISA 3种技术的优点, 可以检出极微量的
病原物, 且特异性强, 无 EB污染。该技术与巢式
PCR及实时荧光 PCR相比, 3者敏感性一致,但是,
后两者操作起来费时费力, 相比之下, PCRELISA
更简便、可适用于大量样本的同时检测且可以定量。
近年来有文献报道 [ 3, 4] , 一种新的现场快速检测技
术问世,这是一种用试纸条检测 PCR产物的方法,
其操作比 PCRELISA 更加方便。如果能证明此方
法具有比 PCRELISA更高的敏感性和稳定性, 它将
成为继 PCRELISA之后的又一更加快捷、灵敏的
DNA检测工具。
2 检测前微量病原的富集
目前新发展起来的检测技术都将重点放在了病
原的检测部分,而忽略了病原检测前的富集过程,造
成了微量病原的漏检。如果在检测之前将大体积样
品中含量很低的病原通过一定方法全部浓缩到可供
检测的小体积样品中, 增加单位体积样品中的病原
数量后再进行常规检测, 不仅可以对微量病原进行
分离纯化、浓缩富集,同时还可去除样品中抑制检测
的成分和杂质,从而提高检测灵敏度和特异性。
21 免疫捕捉 PCR ( Immunocaptured PCR, ICPCR)
和免疫 PCR技术 ( Immuno PCR, IM PCR)
两者都是免疫血清学技术与 PCR技术结合的
新的检测技术,通过抗原抗体的特异性反应,稳定地
从病原粗提液中诱捕目标病原, 达到病原浓缩的目
的, 检测灵敏度比普通 PCR明显提高, 且增强了特
异性。王继华 [ 5]用 ICRTPCR、RTPCR、ELISA 3种
方法检测百合无症病毒, 前者的灵敏度分别是后两
者的 10倍和 1 000倍。本试验室宋蕤等 [ 6]建立的
ICPCR检测西瓜细菌性果斑病, 不需提取核酸, 直
接捕捉抗原后扩增,灵敏度可达到 600个细菌 /mL,
试验证明此法是一种高灵敏度的 PCR技术;目前本
实验室拟研制西瓜果斑病的 ICPCR试剂盒用于进
出口种子的检测。史俊岩等 [ 7 ]的试验证明 IM PCR
方法敏感性高 (是 ELISA法的 25 000倍 ) , 特异性
强, 有可能作为一种高敏感性的检测方法用于肾综
合征出血热 (HFRS)的临床辅助诊断。目前, IC
PCR和 IM PCR已经研制成试剂盒在各个检测领域
得到广泛应用。
22 免疫磁珠检测技术
免疫磁珠基本原理是利用磁珠上特异性抗体抓
捕微量病原,再将富集在磁珠上的病原洗脱或不洗
脱后进行常规检测, 具有高效、灵敏、快速、特异的
优点, 但同时其分离富集病原的效果也受一些因
素影响, 如磁珠尺寸、包被抗体的特异性、pH 值
等。免疫磁珠技术在近几年发展较迅速, 已广泛
应用于医学、食品及动植物检测等各个领域,许多
研究者将免疫磁珠与其它检测技术相结合应用于
微量病原的检测, 如 IM SELISA、IM SPCR、IM S
RTPCR、IM SnestedPCR及 IM Srea l tim ePCR等。
221 免疫磁珠与酶联免疫技术相结合 ( IM S
ELISA ) 在食品检测方面, Lnk等 [ 8]应用抗沙门菌
C群 ( O抗原 6和 7)单克隆抗体包被磁珠的方法检
测沙门菌 ( O: 6, 7) , 采用直接和间接 ELISA法测定
结合到磁珠表面上的细菌或其游离的抗原, 此法的
敏感性为 103 - 104个菌 /mL样品。在动物检疫方
面, 邓艳 [ 9 ]采用 IM SEL ISA法检测鼠疫抗原, 最低
检出浓度为 2 ng /mL,是 ELISA的 10倍。在植物检
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
疫方面 [ 10] ,常采用复合 ELISA检测番茄溃疡病菌和
番茄细菌性斑点病菌的检测,设想可将免疫磁珠富
集技术与复合 ELISA技术相结合, 产生的免疫磁珠
复合 ELISA将被广泛应用于各种微量病原的灵敏、
快速检测。
222 免疫磁珠与 PCR技术相结合 ( IM SPCR )
用 IM SPCR法检测细菌, 不需提取核酸, 富集后
热裂解释放核酸进行 PCR扩增, 大大缩短了检测周
期。例如, 张红等 [ 11]采用 IM SPCR法检测番茄溃
疡病菌, 检测周期为 4 h, 最低检出限 10 CFU /mL,
是常规 PCR的 100倍。刘光明等 [ 12, 13]通过 IMSreal
timePCR技术检测空肠弯曲菌,不仅较传统的生物
化学检测方法灵敏、快捷, 而且解决了空肠弯曲菌生
长缓慢甚至可能解决活的非可培养态而难以检测的
问题。郑姬等 [ 14]以 H IVp24为检测对象,建立的以
金磁微粒为固相载体的免疫 PCR检测技术的灵敏
度是 ELISA检测的 15 000倍。
23 杂交诱捕检测技术
杂交诱捕是利用标记在固相载体上的诱捕探
针,对目标核酸进行捕捉、富集,之后再进行常规检
测的一门新的微量病原检测技术。具体过程如下:
将固相引物 (诱捕探针 )标记在 PCR管上,加入组织
抽提液捕捉目标核酸后 PCR扩增, 得到的 PCR产
物分为两部分,一部分是液相产物,可以进行电泳检
测;另一部分是结合在 PCR管壁上的固相产物, 可
利用 PCR微孔板杂交技术进行产物分析。朱建
裕 [ 15]用杂交诱捕 RTPCRELISA检测李坏死斑病
毒,分别进行了特异性试验、灵敏性试验和诱捕管保
存期试验。试验证明,此法特异性强,灵敏度高 (是
传统 RTPCR的 10倍 ) , 包被好的诱捕管干燥后
4 保存, 有效期在 1年以上, 这也证明可以将该技
术研制成试剂盒推广应用。赵文军 [ 16]用该法检测
番茄环斑病毒,灵敏度比普通实时荧光 PCR高。也
有研究者将杂交诱捕技术结合实时荧光 PCR技术
形成杂交诱捕实时荧光 PCR (HCreal timePCR ),可
实现定量检测, 是一种先进的微量病原检测技术。
杂交诱捕 PCR微联板杂交技术实现了微量病原富
集纯化、PCR扩增、核酸杂交、酶联免疫检测的一体
化,它结合了 PCR的高灵敏度、核酸杂交的高特异
性以及酶联免疫的信号放大作用, 产物可同时进行
电泳分析及微孔板杂交分析,结果更加客观准确。
病原富集技术除了上述提到的之外, 还有膜过
滤法、阴阳离子交换、适配子技术、固定吸附洗脱、细
胞特异性结合等病原富集技术, 如果把这些病原浓
缩富集技术与常规的免疫技术或分子生物学技术相
结合,相信会有更多、更好、更灵敏、更快速的新技术
应用于微量病原的检测。
3 高效核酸扩增技术
核酸扩增是检测微量病原最常用的技术之一,
将微量病原的微量核酸进行高效扩增,使其数量增
多, 便可解决由于病原基数太低而无法检测的困扰。
目前应用最普遍变温核酸扩增体系 ! ! ! 聚合酶链反
应, 需要特殊仪器、模板的热变形及长时间的温度循
环, 已经不符合目前检测技术的灵敏、特异、快速、便
捷的要求。新发展的恒温核酸扩增体系,如滚环扩
增、环介导等温扩增,可以在等温条件下高效、快速、
高特异、高灵敏的扩增靶序列,扩增能力达 109, 灵
敏度可达 1个拷贝的核酸分子, 同时该技术操作简
单, 不需特殊仪器 (水浴锅等温条件即可 ) , 在检测
RNA时不需进行 RNA逆转录, 而这些特点, 都是
PCR技术无法企及的, 是一种高灵敏的、快捷的微
量病原检测技术。
31 滚环扩增 ( rolling circ le amp lification, RCA)
1998年建立的滚环扩增技术可用于扩增大的
环状 DNA模板, 例如, 质粒和噬菌体 DNA, 其线性
扩增倍数为 105, 指数化扩增能力大于 109, 是一种
痕量的分子检测方法,可用于极微量的生物大分子
和生物标志物的检测与研究。RCA有线性 RCA、指
数 RCA、多引物 RCA和免疫 RCA。 Schw eitzer等 [ 17]
建立的免疫 RCA,灵敏度可达 01 pg /mL,产生的扩
增产物可连接在固相支持物 (如玻片、微孔板等 )表
面的 DNA引物或抗体上。我国应用 RCA技术较
晚, 2008年黄冠军等 [ 18 ]利用锁式探针 RCA检测柑
橘溃疡病菌,检测灵敏度高于常规 PCR。 2009年任
晓强等 [ 19]成功建立了慢性乙型肝炎病毒 ( HBV )共
价闭合环状 DNA ( cccDNA )全序列的 RCA方法, 最
低可检测到 10个拷贝的 cccDNA分子, 并获得了所
扩 cccDNA的全基因序列。
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2010年第 11期 刘雅莉等:微量病原检测技术研究进展
RCA可以很容易地与微球和小珠、组织和细
胞、微孔板和微列阵等技术相结合, 应用到核酸测
序、SNP检测及细胞原位检测分析、DNA芯片、蛋白
质芯片分析等方面, 并且基于锁式探针的 RCA技
术,极有可能成为几种生物芯片研究的新方向。但
由于 RCA技术较新, 还有一些不足未得到解决,如
锁式探针成本过高,信号检测时的背景问题等。
32 环介导等温扩增
环介导等温扩增 ( loopmed iated iso therm al am
plification, LAMP)是 N otom i等 [ 20]在 2000年提出来
的一种新的高效的核酸扩增技术, 该技术的问世解
决了基于核酸的分子生物学检测技术的诸多难题,
使其作为快速、灵敏、特异检测方法成为可能。它依
赖于 4个特异引物和一种具有链置换活性的 DNA
聚合酶,在等温条件下可高效、快速、高特异、高灵敏
地扩增靶序列。其产物检测方法通常有 3种: 电泳
检测、荧光检测、浊度检测, 后两者都可以进行定量
分析。
LAMP在病毒、细菌、支原体、寄生虫等检测领
域已经得到广泛应用,据报道, 此法还可用于胚胎性
别鉴定、肿瘤检测, 同时还可以与原位杂交相结合。
LAMP应用于病毒检测, 许春英 [ 21]用 LAMP法和
PCR法检测建兰花叶病毒, 前者的检测灵敏度是后
者的 100倍, 且反应时间短 ( 1 h) , 不需要昂贵的
PCR仪, 非常适合基层部门和养殖场使用, 尤其适
合现场检测。LAMP应用于食品致病菌检测, 张宏
伟 [ 22]在对食品中的沙门菌进行 BPW TTB培养后,
LAMP检测低限为 15 CFU /100 g, 同时分别用电
泳、肉眼观察、荧光检测 3种分析 LAMP产物, 荧光
检测灵敏度是 22 CFU /测试管, 是前两者灵敏度的
10倍。LAMP应用于原位杂交, M aruyama等 [ 23]将
LAMP和原位杂交结合,用于检测大肠埃希菌, 克服
了原位 PCR的一些缺点, 原位 LAMP具有等温条件
下相对较低的温度,可减少对细胞的破坏,有利于荧
光抗体进行同步细胞鉴定, 并且其产物结构的特殊
性防止了产物泄露到细胞外。但新发展起来的
LAMP技术也有一些不足, 首先 LAMP是链置换合
成,靶序列长度最好在 300 bp以内, 大于 500 bp则
较难扩增; 其次由于其灵敏度高, 极易污染造成
假阳性。
目前, 有研究者建立了一种新的检测技术
LAMPLFD,原理是利用生物素标记 LAMP扩增引
物,之后标记生物素的 LAMP产物与标记荧光素的
探针杂交,取杂交液进行 LFD试纸条检测, 该法比
LAMPAGE法灵敏,且产物检测仅需 10m in,大大提
高了检测的效率。K iatpa thomchai[ 24 ]在 2008年首次
利用 LAMPLFD检测 TSV (虾桃拉病毒 ) , 其灵敏度
是 LAMPAGE法的 1 000倍,试验时间分别 70m in、
120 m in。 Jaroenram [ 25] 利用 LAMPLFD和 nested
PCR检测WSSV (虾白斑病毒 ), 证明两种方法灵敏
度相同, 但 LAMPLFD检测只需 45 m in。 Puthaw i
boo l
[ 26]采用此法检测 IMNV (传染性肌肉坏死病
毒 ) , LAMPLFD、LAMPAGE、nestedPCR 3种方法
灵敏度都是 10- 4, 但是反应时间差别较大, 分别是
75m in、2 h、2 - 3 h。我国学者丁文超等 [ 27]采用
LAMPLFD检测 ISKNV (传染性脾肾坏死病毒 ), 其
灵敏度达到 10拷贝数, 分别是 LAMPAGE和 PCR
AGE的 10倍、1 000倍,十分适合微量病原的检测;
并且该技术已在 2010年申请专利, 发明名称 ∀传染
性脾肾坏死病毒的 LAMPLFD检测方法 # [ 28]。
4 展望
在微克级样品的检测中,由于病原量太小,会使
真实情况被掩盖,通过常规分子生物学的衍生技术、
病原富集检测技术以及高效的核酸扩增技术建立起
来的微量病原检测技术, 在一定程度上有效解决此
类问题。目前, PCRELISA、ICPCR以及杂交诱捕
技术都可以制成试剂盒保存, 这将有利于微量病原
的快速检测。在众多病原富集技术中免疫磁珠以其
高灵敏、高特异、操作简单等优势应用于各个领域的
病原检测中,但是其试验成本相对较高,且不能同时
检测多种抗原,以至于没有在更多实验室得到普及。
不过目前郭慧芳等 [ 29 ]建立的一种新的可重复利用
的免疫磁珠,用于抗体样品免疫检测时,至少可以重
复利用 20次以上,不仅可以用于特异性抗体样品的
免疫检测,而且免疫磁珠可以再生化,在基础研究与
临床检测中具有广泛的应用前景。核酸等温扩增技
术是近年来病原检测技术方面的重大科技进展之
一, 尤其是 2008年建立的 LAMPLFD技术, 在病原
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
的灵敏、特异、快速检测等方面显示出了令人鼓舞的
前景, 如果在不久的将来还能实现多元以及高通量
检测, 相信最终可能建立起成本低廉的检测体系,也
将会广泛应用于各种微量病原的检测。其它技术,
如蛋白质指纹图谱、生物传感器、核酸杂交、毛细管
电泳、生物芯片等技术也显示出了很高的敏感性,随
着各学科的交叉发展, 可以采用多种方法联合使用
的策略建立越来越多新的微量病原检测技术。
参 考 文 献
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