全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 4期
三株牛源亚洲 1型口蹄疫病毒 VP1基因的克隆与序列分析
何继军 1, 2
尚佑军 2
陈涓 2
马维民2
杨亚民2
吴润 1
刘湘涛 2
( 1 甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070; 2中国农业科学院兰州兽医研究所 国家家畜疫病病原
生物学重点实验室 国家口蹄疫参考实验室,兰州 730046)


摘
要:
以 3株国内分离的亚洲 1型口蹄疫病毒 (分别命名为 F1、F2、F3)为研究目标, 根据 GenBank中注册的 FMDV
VP1基因的序列设计 1对引物, 采用 RT
PCR方法成功地扩增出含有 VP1 全基因的片段,并测定了 3个毒株 VP1 基因的序列。
结果表明, 3株亚洲 1型 FMDV毒株 VP1基因长度均为 633 bp,编码 211个氨基酸。 3株毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在
82
8%~ 99
1%之间, 推导氨基酸序列同源性在 89
1%~ 99
1%之间。从系统发生树看, F1株与我国香港 2005年牛毒株序列
同源性 99
5% , 属同一遗传谱系, F2株、F3株与 2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘肃静宁县疫情的毒株分属同一
个基因群。
关键词:
亚洲 1型口蹄疫病毒
VP1基因
序列分析
Cloning and Sequence Analysis of theVP1 Gene of Three Strains
of Foot
and
mouth D isease V irus Type Asia 1
H e Jijun
1, 2
Shang Youjun2
Chen Juan2
M aW emi in2
Yang Yam in2
W uRun1
L iu X iangtao2
(
1
Co llege of VeterinaryM edicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070; 2Lanzhou Veterinary R esearch Institute,
StateK ey Laboratory of Veterinary E tio logical Biology, N ational Foo t and M outh D iseaseR eference Laboratory, Lanzhou 730046)


Abstrac:t
ThreeVP1 gene o f three stra ins nam ed F1, F2 and F3 o f FMDV type Asia1 w ere am plified by RT
PCR respective ly
and PCR products we re sequenced
The resu lts suggested that the fu ll leng th o f FMDV serotype Asia1 VP1 gene a ll com prised 639 bp,
cod ing for 213 am ino ac ids
The nuc leo tide sequence homo log ies among 3 stra ins were betw een 82
8%~ 99
1% , and those of the am i

no ac id sequence be tw een 89
1% ~ 99
1%
F1 stra in w as most close ly re la ted to stra ins iso lated in H ong Kong in 2005
F2 and F3
stra ins w erem ost c losely re lated to stra ins iso lated in H ebe,i Be ijing and Gansu in 2005 in Ch ina

Key words:
Foot
and
m outh disease v irus
VP1 gene
Sequence ana lys is
收稿日期: 2008
12
19
基金项目:
十一五
国家科技支撑计划
禽流感等重大动物疫病综合防控技术研究
( 2006BAD06A17)
作者简介:何继军 ( 1979
) ,男,甘肃庄浪人,硕士,研究方向:兽医微生物与动物病毒学; E
m ai:l hej ijun1979@ sina. com
通讯作者:刘湘涛,男,研究员; E
m ai:l hnx iangtao@ sin a
com


口蹄疫 ( Foot andmouth d isease, FMD)是由口蹄
疫病毒 ( Foot and mouth disease v irus, FMDV )引起
偶蹄动物的一种急性、热性、高度传染性疾病, 由于
其传播速度快、可侵害多种动物而被国际兽医局
( O IE )列为 A类传染病之首。口蹄疫的大范围流
行,给畜牧业的发展造成巨大的经济损失,影响到对
外贸易,失去国际市场, 甚至会带来政治影响 [ 1, 2 ]。
近年来,世界口蹄疫流行格局发生了变化 [ 3] , 原来
无口蹄疫的国家和地区也相继发生口蹄疫, 致使我国
口蹄疫防治工作面临重大挑战。 2005年以来, 我国
突然暴发牛亚洲 1型口蹄疫,疫情波及新疆、江苏、山
东、香港等省市区, 对亚洲 1型口蹄疫的防控已成为
我国兽医防疫工作的重点 [ 4]。为进行亚洲 1型口蹄
疫流行病学调查和疫源追踪,对我国 2005年和 2006
年 3株牛源亚洲 1型口蹄疫流行毒株进行 VP1基因
序列测定、分析,从流行病学角度查明了我国亚洲 1
型口蹄疫来源,为有效防控口蹄疫提供基础。
1
材料和方法
1
1
材料
1
1
1
毒株
3株牛源口蹄疫亚洲 1型病毒流行
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
株采集自 2005~ 2006年山东省泰安市、江苏省无锡
市和青海省同仁县发病牛舌部、蹄部水泡皮,编号分
别为 F1、F2和 F3。病料经接种 3 d乳鼠增殖分离
病毒。病毒培养物由国家口蹄疫参考实验室保存。
1
1
2
乳鼠
病毒分离用 3 d乳鼠, 由中国农业科
学院兰州兽医研究所实验动物场提供。
1
1
3
口蹄疫反向间接血凝诊断液
A、O、C及亚
洲 I型口蹄疫反向间接血凝试验诊断试剂盒、标准
抗原由国家口蹄疫参考实验室提供。
1
1
4
工具酶及试剂盒
总 RNA提取试剂盒
RNeasym ini Sp in
Co lumns K it购自德国 Q IAGEN公
司; DNA胶纯化回收试剂盒、DNA M arker、ONE STEP
RT
PCR K it等购自 TAKARA公司;其它试剂为国产
分析纯。
1
1
5
标准参考毒株序列
本研究所用中国国内
参考毒株序列由国家口蹄疫参考实验室提供, 国外
口蹄疫亚洲 1型参考毒株序列源自 GeneBank或世
界口蹄疫参考实验室。
1
2
方法
1
2
1
引物
用于 FMDV VP1基因扩增的引物由
上海宝生物合成, VP1基因扩增引物是 1D2和 1D5,
其序列为
1D2 (正向 ) 5
TAGTGCTGGYAAR

GACTTTG
3, 1D5 (反向 ) 5
GACATGTCCTCCTG

CATCTGGTTGA
3
1
2
2
病毒血清型鉴定
用反向间接血凝诊断试
剂对病料或鼠毒进行血清型鉴定, 操作按试剂盒说
明书进行。
1
2
3
病毒 RNA的提取及 VP1基因的 RT
PCR扩
增
将预处理好的鼠毒组织悬液, 3 000 r /m in离心
10m in, 按 QIAGEN RNA提取试剂盒说明进行总
RNA的提取后,在 250
l的 PCR薄壁管中依次加入
10
One S tep RNA PCR Buffer 5
,l dNTP( 10 mM ) 5

,l MgC l2 ( 25 mM ) 10
,l RNase抑制剂 1
l( 40 U /

l),反转录酶 (AMV ) 1
l( 5 U /
l), RT
PCR聚合酶
1
l( 5 U /
l),正反向引物各 1
l( 50 pmol /
l) ,病毒
RNA溶液 25
,l总体系 50
l。混匀液体后, 置于
PCR扩增仪中, 进行扩增。扩增反应条件: 50
30
m in, 94
5m in, 94
40 s, 55
30 s, 72
40 s, 30个循
环后 72
延伸 8m in。
1
2
4
PCR产物的纯化、回收及测序
用宝生物
(大连 )公司的 Agarose Ge lDNA Pur ification K it回收
DNA。纯化后的 PCR产物直接测序。
1
2
5
序列分析
用 DNA star软件对序列进行分
析和比对。
2
结果和分析
2
1
病毒分离结果
3份病料接种 3 d乳鼠进行分毒,获得 3株病毒
株, 经口蹄疫反向间接血凝试验和分型 RT
PCR鉴
定为口蹄疫亚洲 1型。
2
2
VP1 基因的 RT
PCR扩增
以特异性引物 1D2、1D5进行 RT
PCR扩增,获得
约 800 bp的目的条带,与预期的结果相符 (图 1)。
M
2 000 bpDNA Marker; N
阴性对照; F1~ F3
分离株 VP1扩增产物
图 1
VP1基因扩增电泳图
2
3
VP1基因序列测定与分析
2
3
1
VP1基因序列测定结果
纯化后的 PCR产
物直接测序, 结果表明: 3株口蹄疫亚洲 1型病毒株
的 VP1 基因全长均为 633 bp, 编码 211个氨基酸。
将所测定的毒株的全长 VP1 基因序列通过 NCB I
BLAST程序与 GenBank中注册的核苷酸序列进行
比较,结果与这 3个亚洲 1型毒株同源性最高的 30
个序列均为亚洲 1型 FMDV VP1 基因序列,进一步
证明所测定的 3个毒株的核苷酸序列均为相对应型
的 FMDV VP1 基因序列,而且在这些毒株之间未发
现核苷酸的缺失或插入。
2
3
2
VP1 基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的比
较
利用 DNAStar软件分析, 3株流行株 VP1基因核
100
2009年第 4期 何继军等:三株牛源亚洲 1型口蹄疫病毒 VP1基因的克隆与序列分析
苷酸序列同源性在 82
8%~ 99
1%之间,由其推到的
氨基酸序列同源性在 89
1%~ 99
1%之间。通过比
较发现, F1株 VP1基因氨基酸序列与香港 2005年牛
毒株 ( Asia1/Hongkong /05 /B )序列同源性为 99
5%;
F2株、F3株 VP1基因氨基酸序列同源性为 99
1%,
二者与 2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘
肃静宁县疫情的毒株 A sia1 /HeB /WQ /05 /B、Asia1/
BJ/YQ /05 /B、Asia1 /GS /JN /05 /B同源性在 99
1%~
99
5%之间,分属同一个基因群 (图 2, 3)。 图 2
VP1 基因推导氨基酸序列系统发生树
图 3
VP1 基因推导氨基酸序列同源性
2
3
3
VP1基因氨基酸差异分析
从 VP1基因氨基
酸序列可以看出, 3株流行株主要差异在 40~ 50位、
140~ 156位、94~ 101位、210~ 211位氨基酸 4个区
域,而且这些区域内氨基酸的变异反映了不同的进化
分支方向,如 A44、I80、T139、E169、M210等氨基酸代
表了香港 2005年牛毒株进化分支。在 VP1序列上
143~ 145位由精氨酸
甘氨酸
天冬氨酸 ( RGD)组成
的区段参与构成病毒的细胞吸附位点,该区段的氨基
酸非常保守以保持病毒对细胞的侵染性,但其侧翼序
列高度可变 [ 5~ 7]。本试验 3株流行株也符合本规律,
如 RGD基序两侧的 139~ 141位、153~ 156位氨基酸
变异频度较高 (图 4)。
图 4
VP1 基因推导氨基酸序列
101
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
3
讨论
FMDV的毒力和抗原性都易发生变异,经过不
断的抗原
漂移
过程,导致一系列亚型乃至型的产
生 [ 8~ 10]。FMDV VP1 基因的核苷酸序列是一个高
度可变区。分析这个高变区不仅对 FMDV遗传变
异的研究有指导意义, 而且对 FMD 的流行病学研
究、疫源的追踪、毒株型和亚型的分析, 为合理的选
择疫苗,甚至为诊断抗原的制备及新型疫苗的研制
提供理论指导 [ 11~ 14]。
历史上,我国发生的亚洲 1型口蹄疫仅限于云南
边境地区,内地从未有亚洲 1型疫情的报道 [ 4]。 2005
年以后,我国突然暴发牛亚洲 1型口蹄疫,疫情波及江
苏、宁夏、河北、北京、湖北、青海、甘肃、山东及新疆等省
市区,给我国口蹄疫防治工作带来极大挑战,国家口蹄
疫参考实验室即开展流行病学调查,从分子水平查明
我国牛口蹄疫亚洲 1型病毒的来源。从流行病学调查
情况来看,我国的牛口蹄疫亚洲 1型病毒分别属于 3
个相对独立的遗传群 [ 15] ,即云南保山 58谱系 ( Asia1/
YB /BSh /58/B )、香港 05谱系 ( Asia1/Hongkong /05/B )
和江苏 05谱系 ( F2为代表毒株 ),其中江苏 05谱系为
主要流行毒株 (图 2)。
云南保山 58谱系以 1958年云南保山毒为代表,我
国目前用于诊断的标准毒和亚洲 1型弱毒疫苗毒株均
为该毒株。我国云南边境发生亚洲 1型口蹄疫系由该
毒株引起,与 Asia1 / IND /63 /72同源性 91
9%,其来源
与东南亚国家常年流行的亚洲 1型口蹄疫关系较为密
切。香港 05谱系该毒株 2005年 4月在山东泰安引起
牛发病,并在新疆、宁夏、甘肃等地流行,说明该毒株已
跳跃性地扩散到了内地。通过与周边国家流行毒株的
VP1基因序列进行比对分析发现香港 05谱系与印度
1991~ 1999年间发生的部分亚洲 1型口蹄疫关系较密
切,属同一基因型。F1、Asia1/Hongkong /05/B与 2004
年间巴基斯坦流行毒株 (A sia1/PAK /1 /04/B )同源性
分别为 99
1/%和 98
6%,属高度同源。江苏 05谱系
毒株自 2005年引起口蹄疫大暴发以来,已散播到江苏、
宁夏、河北、北京、湖北、青海、甘肃等地区, 该谱系与
OIE公布的国外近 20年间出现的流行毒的遗传关系均
相距甚远,而与印度 20世纪 80年代初流行的某些毒株
具有高度的遗传衍化关系,因此可以推测,我国亚洲 1
型口蹄疫病毒是新近从国外传入。所以, 要有效防控
我国 Asia1型口蹄疫的发生,需内外兼顾,对内加大免
疫和监测,对外加强贸易流通监管,以建立真正有效的
防控体系。
参 考 文 献
1
谢庆阁,口蹄疫 [M ]
北京:中国农业出版社, 2004

2
Francisco S, M argarita S, M iguel AJ, et al
Vet R es, 2001, 32: 1
~ 30

3
Know les NJ
V iru s St rain Id ent ificat ion for th e Years 2000~ 2001:
R eport for th e O IE /FAO World R eference Laboratory for Foot
and

m ou th d isease, Ins titu te forAn im alH ealth, P irbrigh t, 2001

4
刘湘涛,刘在新,张强,等.中国兽医科学, 2007, 37 ( S1) : 2~ 3

5
Belsham GJ
Prog B iophysM ol B io,l 1993, 64: 241~ 260

6
LoganD, A bu
Ghazalch R, B lak emoreW
N ature, 1993, 362: 566
~ 571

7
Beck E, St roh am aier K
V iro,l 1987, 61 : 1621~ 1629

8
Dom ingo E, M ateuMG, Escarm is C, et al
V irusG ene, 1995, 11 ( 2
~ 3) : 197~ 207

9
Dom ingo E , S iez J, M artin ezMA , et al
Jou rnal ofGeneralV irol

ogy, 1993, 74: 2039~ 2045

10
Borrego B , Novella IS , G iraltE , et al
V iro,l 1993, 67: 6071~
6079

11
B itle JL , H ough ten RA , A lexand erH
et al
Natu re, 1982, 298:
30~ 35

12
B row n F
V accine, 1992, 10: 1022~ 1026

13
赵启祖,谢庆阁
畜禽重大疫病免疫防制研究进展 [ C ]
北京:
中国农业出版社, 1996, 14~ 23

14
C arrillo C, W igdorov itz A, Trono K, et a.l V iral Imm uno,l 200 ,l 14
( 1) : 49~ 57

15
何继军,尚佑军, 陈涓, 等
中国兽医科学, 2007, 37 ( S1 ) : 68
~ 72

(上接第 94页 )
7
王力华,付士红, 唐青,等
病毒学报, 2006, 22( 2) : 107~ 113

8
李敏,杨谦
中国生物工程杂志, 2007, 27 ( 8 ): 53~ 58

9
吴利先, 黄文祥
中国人兽共患病学报, 2006, 22 ( 9 ) : 828
~ 832.
10
C larke P
NucleicA cids Research, 2005, 33( 2 ): e18

11
龚永兴
嗜线虫致病杆菌北京变种抗生素抗性相关基因的研究
[博士学位论文 ]
北京:中国农业科学院, 2006

102