全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(1)：132— 136 2007年 1月
口蹄疫病毒 VP1高效植物表达载体构建及鉴定
郝岗平 ，边高鹏2，孙凌云1，张媛英
(1．泰山医学院 生物化学教研室，山东 泰安 271000；2．山西长治学院生化系 ，山西 长治 046011)
摘 要：采用高保 真 PCR方 法从 pGEM-VP1一T质粒扩 出 VP1基 因，定向克隆到含 DHA 的融合 中间载体
pUCI8一DHA，得到 pUCI8一VPI—DHA，经测序证实核酸序列正确后，再亚克隆到转化范围广，转化效率高，且含有
双增强子的高效植物双元表达 载体 pGreen0029一GFP上，获得含 VP1融合 DHA基 因的植 物双元表 达载体
pGreen0029一VP1一DHA，采用电击法将含 VPI的植物表达载体转入根癌农杆菌 G3101中，获得了含 VP1基因的
双元植物表达载体，为下一步的广范围转基因植物表达研究奠定了基础。
关键词：口蹄疫病毒 VP1基因；植物高效表达载体
中图分类号：Q943 文献标识码；A 文章编号：1000-3142(2007)01-0132-05
Construction and identification of VP1 plan t
high efi ciency expression vector of
foot-mouth disease virus
HAO Gang-Ping ，BIAN Gao-Peng2，SUN Ling-Yun ，
ZHANG Yuan-YingI
(1．Department of Biochemistry，Taishan Medical College，Taian 271000，China；2．Department
ofBiochemistry，CIzangzhiColege，Changzhi 046011，China )
Abstract：Using high-fidelity PCR，VP1 was amplified from pGEM-VP1-T plasmid and then subcloned into the tran-
sition vector pUC18一DHA including the fusing DH Folowing confirmation the VP1 sequence。pUC18一VP1一DHA
was obtained．After this vector was subcloned into the plant binary vector pGreen0029-GFP which is wide species and
high transform efficiency，new plant binary vector，named pGreen0029-VP1-DHA。was produced．Analysis with re—
striction endonucleases confirmed successful transfer of pGreen0029一VP1一DHA into Agrobacterium tumefaciens
G3101．The plant binary expression vector encoding VP1 have been constructed，which facilitates further investiga-
tion of VP1 protein exp ressions in wide transgenetic plants．
Key words：VP1 gene of foot-mouth disease virus；high efficiency plant expression vector
利用转基因植物生产研制基因工程药物是当今
植物基因工程研究的一大热点，已有病毒蛋白、细菌
毒素和抗体分子等多种基因在转基因植物中获得成
功的报道(李昌等，2003)。用转基因植物表达外源基
因与细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因动
物等表达系统相比，具有独特的优势(王捷等，1999)。
自Mason(1992)首次提出用植物生产可食性疫苗以
来，运用此种方法生产的人用疫苗和功能蛋白已达
100种以上。
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth
Disease Virus，FMDV)引起的一种急性、高度接触性
传染病，对牛、羊、猪等多种偶蹄动物危害甚大，被国
际兽疫局列为A类传染病之首(郭慧琛等，2003)。目
前，除美国、日本、加拿大、澳大利亚、新西兰等少数国
收稿日期：2005-04-11 修回日期：2006-01-05
基金项目：泰山医学院博士科研启动基金资助 (2004)[Supposed by Initial Foundation to PhD of Taishan Medical College(2004)]
作者简 ：郝岗平(197o一)，男 ，山西临县人，博士，副教授，从事药用植物分子生物学与基因工程研究，E-mail：haogangping{~163．tom．
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1期 郝岗平等：口蹄疫病毒 VPI高效植物表达载体构建及鉴定 133
家外，世界大部分国家和地区都不同程度地存在着
FMD流行(Samuel等，2001)。FMD不仅造成巨大的
经济损失，对旅游、贸易乃至政治、外交等也会有严重
的不良影响，因此 FMD的研究受到世界各国政府和
学者的高度重视。
目前，防治口蹄疫的主要方法仍然是接种灭活疫
苗，但由于 FMDV血清型和变异株众多，灭活疫苗的
保护率并不理想；同时灭活疫苗生产过程中存在着散
毒、病毒灭活不完全等潜在危险(Mason等，2001)，因
此研究高效、安全的新型疫苗受到国内外学者的广泛
关注。口蹄疫病毒的结构蛋白P1为口蹄疫病毒的抗
原位点，其结构蛋 白P1成熟后裂解为 VPI、VP2、
VP3、VP4，其中VPI为主要抗原位点，能诱导机体产
生抗 FMDV中的抗体和抗病毒保护性免疫，是基因
工程疫苗研究的对象。为了制备安全、有效的新型基
因工程疫苗，人们积极探索 FMDV转基因植物的研
究，1998~2001年 Carrilo等(1998)、w dorovitz等
(1999)将 FMDV-VP1结构蛋白基因的植物双元载体
分别转化拟南芥、苜蓿和马铃薯，获得整合了VP1基
因的转基因植物，并且在转基因植物中得到表达。将
其表达产物提取物免疫动物能够诱导动物产生特异
性免疫应答。另外，Dussantos等(2002)把 口蹄疫病
毒VP1结构蛋白 135～160多肽(vP1135-160)基因
片段插入到gus基因的前面构成融合基因，转化苜蓿
得到转基因植物，通过检测gus，证明该多肽在苜蓿中
表达，并也能诱导动物的特异性免疫应答。这些研究
结果表明用植物表达系统完全有可能生产有效安全
的口蹄疫疫苗。但这些研究都存在表达检测复杂，表
达量低等问题。随着植物转基因的研究进展和对口
蹄疫及其病毒基因组研究的深入，我们拟采用转化范
围广且转化效率高的 pGreen0029载体，构建含 DHA
凝集素的VP1基因融合表达载体，利于表达检测，提
高表达效率，用于转化玉米、牧草等植物，为进一步研
究可饲用的FMD疫苗奠定基础，现将研究结果报告
如下。
1 材料与方法
1．1质粒和菌株
含亚洲I型1：1蹄疫病毒 VP1基因(700 bp)片段的
pGEM-VP1一T质粒，由中国科学院遗传与发育研究
所王义琴博 士惠赠。pGreen0029一GFP和 pUC18一
DHA质粒和 GV3101根癌农杆菌由北京农业生物技
术研究中心黄丛林研究员惠赠。E coli DH5a为本室
保存。
1．2试剂和主要仪器
限制性内切酶NeoI、StuI和 PstI购自Takara公
司。质粒抽提试剂盒购自Omega公司。DNA凝胶
纯化试剂盒、Tag酶、dNTP均购自大连宝生物工程公
司。
高速冷冻离心机(Aleg M 64R centrifuge，美国
BECKMAN公司)，PTCl 仪(美国 公司生 产)，凝胶自动成像系统(．法00
国
PCR
OUR
IVIJ
VILBERL MAT公
司)。冷冻干燥仪(ALPHA 1-4，德国Ma rtin Chfim公
司)，电泳系统(北京六一仪器公司)。Gene pulser I电
击转化仪(BI()-RAD公司)
1．4方法
(1)质粒 DNA提取：参照《分子克隆实验指南》
(萨姆布鲁克等，1993)中的方法进行。
(2)VP1基因的 P(’R扩增与纯化 ：根据已经测定
的 FMDVP1片段的核苷酸序列及质粒 pUC18一DHA
的限制性酶切位点，设计 1对引物，其序列为：PR1：5
ACC~ CATGGTCGAGCCCAAACCACCTCTGCI
PR2：5 03AGGC rCAGT03AAG．IvI℃AGA AGCT—
G 兀vr。两引物的 5 端分别引入 NcoI和StuI酶切
位点(下划线部分)。取 pGEM-VP1一T质粒约 4O ng
为模板，在5O L反应体系中PCR。PCR反应条件为
94℃下预变性 4 min，94℃下变性 50 S，60℃下退火
50 S，72℃下延伸 1 min，共 3O个循环，最后在 72℃
下延伸7 min。PCR产物全部上样电泳。PCR产物
用 Omega公司的胶回收试剂盒回收。
(3)质粒 DNA酶切、片段回收、连接和转化：质粒
DNA酶切与连接按厂家说明书进行，DNA片断回收
采用 Omega公司的胶回收试剂盒。取 5 L连接产
物，转化 E coli DH5a感受态细胞，涂布于含 60 vgl
mL安苄青霉素或 50／~g／mL卡那霉素的 LB平板，37
℃培养 16～18 h。
(4)阳性克隆的筛选与鉴定：从上述抗性平板挑
取单菌落，接种在含 60~g／mL安苄青霉素或 5Oug／
mL卡那霉素的3 mL LB液体培养基中，培养 6～8
h。取 2 L菌液为模板，按 1．3．2节中的反应条件进
行 PCR扩增。将 PCR扩增阳性的菌液测序。
(5)电击法转化农杆菌：用 BIO-RAD Gene pulser
Ⅱ电击转化仪转化根癌农杆菌G3101受体细胞。
(6)转化农杆菌的酶切鉴定：小量提取农杆菌中
的质粒酶切鉴定。
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2 结果
2．1 VP1基因的扩增
用所设计的引物从 pGEM-VP1一T质粒扩增到特
异性条带，大小约 700 bp，与预期大小相符(图 1)。
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8： b
图 1 VP1基 因 PCR扩增结果
Fig．1 Result of amplification by PCR for VP1 gene
1-4：Result of PCR；M ：DNA M arker．
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a b
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图 2 重组质粒 pUC18-VP1-DHA
Nco I和 Stu I双酶切结果
Fig．2 Identification of plasmid pUC18-
VP1一DHA by Nco I+ Stu I
1-5：pUC18一VP1一DHA／Nc0 I+Stu I；M：DNA Marker．
2．2 pUC18-VP1-DHA中间载体的构建和鉴定
Omega公司的胶回收试剂盒回收上述 PCR产
物 ，用 NcoI和 StuI双酶切位点。同时用相同的酶双酶
切 pUC18-DHA，经琼脂糖凝胶电泳，回收大片段，与
上述双酶切回收的PCR产物连接，连接物转化大肠
杆菌，经含抗生素 AmP平板筛选，提取质粒，NcoI和
StuI双酶切鉴定 (图 2)。测序证实 VP1基 因与
pUC18-DHA大片断连接成功，且核苷酸序列正确。
2．3 pGren0029-VP1-DHA载体构建和鉴定
将上述构建好的 pUC18-VP1-DHA中间载体和
pGreen0029-GFP载体 同时进行 NcoI+PstI双酶切，
电泳，回 收 pUC18-VP1一DHA 的 小 片 断，回 收
pGreen0029一GFP大片断，再将两回收产物连接，连接
物转化大肠杆菌，经含抗生素 Kan平板筛选，得到9
个转化菌落，提取质粒，Nc0I+PstI双酶切鉴定(图
3)。整个载体 的构建路线见图 4。
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图 3 重组质粒 pGreen0029-VP1-DHA
NcoI+PstI双酶切鉴定
Fig．3 Identification of plasmid pGreen0029一
VP1一DHA by NcoI+PstI
1-4：pGreen0029一VP1一DHA／NcoI+PstI；M：DNA Marker．
2．4植物表达载体导入根癌农杆菌
将构建的表达载体 pGreen0029-VP1-DHA用电
转移法转化根癌农杆菌株系 GV3101，2 d后长出菌
落，由于根癌农杆菌的质粒拷贝数很低，因此先采用
碱法提取质粒，再转化大肠杆菌，扩增后用碱法提取
质粒，酶 切 鉴 定。Nco I+ Pst I双 酶 切 鉴 定 与
pGreen0029-VP1-DHA用相同的双酶切鉴定得到相
同的结果，可以切出大约 700 bp的片断。PCR扩增
转化 的 农 杆 菌，可 扩 出 VP1基 因 片 断，表 明
pGreen0029一VP1一DHA质粒已经导人 到农杆菌株 系
GV3101。
3 讨论
表达载体是指按特殊要求设计的，能使克隆在其
中特定位点的外源基因的编码序列，在原核或真核细
胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的克隆载体。
构建高效表达载体时，应选择有意义的目的基因
并对其进行序列修饰，本研究以目前急需研制新型疫
苗的FMD为研究对象，以引起这类传染病的病原体
FMDV的主要抗原基因为靶基因，通过设计一系列中
间载体，消除多余及不必要的酶切位点。
同时，构建载体时，还应采用正确的构建策略。
除考虑编码基因即目的基因阅读框与启动子方向一
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致外，还要根据目的基因所在原载体的多克隆位点，
选用最快捷的途径，构建到最终表达载体上。另外，
在构建过程中，还应考虑最终载体的大小。FMDV只
含有 1个开放阅读框，编码病毒前体蛋白，经过裂解
形成4种结构蛋白，其中，VP1是诱导中和抗体的主
要成分。业已证实的 O型口蹄疫病毒 5个抗原位点
中，有 3个位于VP1上，包含病毒的宿主细胞受体位
点 RGD，在病毒的侵入和免疫保护中发挥着重要的
作用，是各种亚单位疫苗研制的首选基因 (刘铀等，
2004)。
图 4 pGreen0029一VP1一DHA表达载体质粒的构建技术路线
Fig．4 Construction of recombinant plasmid pGreen0029-VP1-DHA
中间载体 pUC18一DHA含有常用的组成型启动
子 35S和一个增强子，且该中间载体的目的基因不含
终止子，目的序列后面直接连接 DHA(植物凝集素基
因)，目的是为了通过 West bloting检测 DHA，说明
目的基因是否表达。由于没有合适的酶切位点，不可
以直接将 VP1基因从 pGEM-VP1一T载体直接切下
连接到此中间载体上，因此，采用高保真 PCR方法调
出 VP1基因，并在 PCR产物上加上 NcoI和 StuI酶切
接头，以便定向克隆到中间载体上。
实现外源基因在植物中的表达，必须将外源基因
连接到特定的植物表达载体上，通过根癌农杆菌对植
物的侵染作用，将外源基因整合到植物染色体 DNA
上(彭志强等，2002)。pUC18一DHA中间载体的 35S
启动子是组成型启动子，在植物大部分组织中能很好
地启动外源基因的表达，pGreen0029一GFP载体中含
有双增强子，可以大大提高外源基因表达量。根癌农
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杆菌仅将左右边界序列 RB和 LB之间的DNA序列
整合到植物染色体中。pGreen0029载体在 pSoup质
粒的协助下，在农杆菌 GV31Ol内的复制速度快，转
化植物的范围广，多克隆位点多，操作方便(Helens
等，2000)。因此，整个含 VP1基因的表达调控元件
(启动子 、增强子 、外源基因和 DHA)通过酶切连接，
构建在植物双元载体 pGreen0029的左右边界序列之
间，由于构建的VP1表达为独立的表达单元，因此不
需要鉴别其方向，左右边界序列之间还包含一个
NPTI基因，也是一个独立的表达单元，其表达产物
能够磷酸化卡那霉素及其衍生物，作为筛选转基因植
株的抗性基因。
本研究所构建 的 pGreen0029-VP1一DHA植物表
达载体，可用于烟草、马铃薯、玉米、番茄等植物的转
化，从而为用植物作为生物反应器生产口服疫苗提供
依据。
参考文献：
萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW．黄培堂，等(译)．2002．分子克隆实验
指南EM]．北京：科学出版社：27—29
Carrillo C，Wigdomvitz A。Olieros JC，et a1．1998．Protective immune
response to foot-mouth disease virus with VP1 expressed in trans—
genic plants[J]．J Virol，72(2)：1 688—1 690
Dus Santos MI，Wi【gdorovitz A，Trono K，eta1．2002．A novel meth—
odolngy to develop a fot and mouth disease virus(FMDV)pepati—
de-based vaccine in transgenic plants[J]．Vacin，20：1 141-1 147
Guo HC(郭慧琛)，Liu ZX(刘在新)，Sun SQ(孙世珞)，et a1．2003．
The latest pmgress of genetics vacc es against fo t-mouth disease
(IEI蹄疫基因疫苗研究进展)EJ]．
cine(动物医学进展)，24(4)：1—5
Helens RP。Edwards EA，Leyland NR，et a1．2000．pGreen ：a veJ-sa-
tile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant
transformation[J]．Plant Mol Biol，42(6)：819-832
Li C(李昌)，Jin NY(金宁一)，Wang G(王罡)，et a1．2003．On con—
structing expressing vectors for genetics engineering vaccine(植物
基因工程疫苗高效表达载体的构建)D-1．J Jilin Agric Univ
(吉林农业大学学报)，25(3)：253-256
Liu Y(刘铀)，Bi YZ(毕英佐 )，Ma JY(马静云)，et a1．2004．Con-
struction of VP1 plant expression vector of fo t-mouth disease viru s
(口蹄疫病毒 VP1植物表达载体的构建)EJ]．J Zha iang 0-
c~o．n Univ(湛江海洋大学学报)，24(4)：59-62
Mason H& 1992．Expression of hepatitis B surface antigen in trans—
genic plants[J]．Pro Natl Acad Sci USA，89，11 745—11 749
Mason PW，Grubman MJ．2001．Co ntroling fot and mouth disease
with vaccine[J]．Australian Veterinary Journal。79(5)：342-343
Peng ZO(彭志强)，Yu SY(俞守义)，Yu DQ(余迪求)，et a1．2002．
Co nstruction of plant expression vector containing the gene enco —
ding cholera toxin B subunit(编码霍乱肠毒索B亚单位基因植物
表达载体的构建)[J]．J First Military Medical Univ(第一军医
大学学报)，22(8)：736—738
Samuel AR，Knowles NJ．2001．Fot and mouth disease sevirus：
Cause of the recent crisis for the UK livestock industry[J]．Trends
ingenetics，17(8)：421—424．
Wang J(王捷)，Guo Y(郭 勇)．1999．Vaccine production in trans-
genic plant(疫苗生 产的新途径——转基 因植物)EJq．Guiha／a
(广西植物)，19(3)：26O一262
Wigdomvim A，Ca rri1o C，Dus Santos MJ，et a1．1999．Induction of a
protective antibody response tofo t andmouthdisease virusinmice
folowing oral or parenteral immunization with alfalfa transgenic
plants expressing the viral structure protein VP1 EJq．Virology，
255(2)：347—353
(上接第 139页 Continue from page 139)
泳拖尾现象消失。
参考文献：
王关林，方宏筠．2002．植物基因工程EM]．北京：科学出版社：742
— 744。755
郭锡勇，曹宇浩．1999．黔产绞股蓝 中多糖的含量测定EJq．贵阳
中医学院学报，21(3)：59-60
Cheng FS，Broun SK，Weeden NF．1997．A DNA extraction protocol
from various tisues in woody speies[J]．Hortscience，32(5)：921—
922
Co lins GG，Symon SRH．1992．Extraction of nuclear DINA from
grapevinel~ves by amodifned procedureFJG．P／amMolRep，10：
233- 235
Ding XD(丁晓东)，Lu LX(吕柳新)．2000．Study on genomic DNA
extraction from recalcitrant litchi(从顽拗植物荔枝中提取基因组
DNA技术的研究)[J]．Chin．，Appl Environ Biol(应用与环境
生物学报)，6(2)：142—145
Fang G，Hammar S。Grumet R．1992．A quick and inexpensive meth—
od for removing polysaccharides from plant genemic DNAEJ]．Bio-
techniques，13(1)：52—56
Haymes KM．1996．Mini—prep method suitable for a plant breeding
progran~J]．PlantMol Biol Rep，14(3)：280-284
Kim C S，Lee C H，Shin J S，et a1．1997．A simple and rapid method
for isolation of high quality genomic DNA from fruit tree and eoni—
fers using PVP[J]．NucleicAcid Res，25：1 O85—1 086
Luro F，Laigret F． 1995． Preparation of high molecular weight ge-
nornic DNA from nucleic of woody plants[J-]．Biotechniques，19：
388——392
Oard J H．Dronavalh S．1992．Rapid isolation of rice and maize DNA
for analysis by random-primer PCREJ]．Plant Mol Biol Rep，10：
236——241
Wang z(王珍)；Fang XJ(方宣钧)．2003．Plant DNA isolation(植物
DNA分离)[J]．Mol Plant Breeding(分子植物育种)，1(2)：281
— — 288
维普资讯 http://www.cqvip.com